美洛昔康抑制人結腸癌細胞增殖與Wnt/β-catenin 信號的關系研究

周 密，何百成，秧茂盛,2

(1.重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016; 2.吉首大學醫學院藥理教研室，湖南 吉首 416000)

美洛昔康抑制人結腸癌細胞增殖與Wnt/β-catenin 信號的關系研究

周 密1，何百成1，秧茂盛1,2

(1.重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016; 2.吉首大學醫學院藥理教研室，湖南 吉首 416000)

目的 研究美洛昔康(meloxicam，Mel)對人結腸癌細胞LoVo增殖抑制作用及其機制。方法 以人結腸癌細胞株LoVo為研究對象，體外藥物敏感試驗(結晶紫染色)和流式細胞術(FCM)分析Mel對細胞的增殖抑制作用；流式細胞術和HE染色檢測Mel對細胞凋亡的影響；螢光素酶報告質粒檢測Mel對Wnt/β-catenin通路信號轉導的影響；Western blot檢測Mel對細胞內β-catenin蛋白水平的影響。結果 與對照組相比，Mel能抑制LoVo細胞增殖，72 h、100 μmol·L-1Mel的細胞抑制率高達(57.635±3.86)%(t=10.044，P=0.001)；Mel能誘導LoVo細胞凋亡，24 h、60 μmol·L-1Mel的細胞凋亡率達到(33.6±1.7)%(t=30.166，P=0.001)；Mel能降低TCF/LEF及Myc/Max報告質粒的螢光素酶活性，24 h、60 μmol·L-1Mel 可使TCF/LEF和Myc/Mac報告的熒光素酶活性分別降至(40.05±2.79)%(t=14.864,P=0.001)和(35.9±2.38)%(t=16.904,P=0.001)；Mel能下調細胞內β-catenin蛋白水平，40 μmol·L-1Mel在24、48 h時，可將β-catenin蛋白水平分別降至(71±3.78)%(t=7.353，P=0.003)、(52.66±3.57)%(t=11.724，P=0.001)。結論 Mel能抑制LoVo細胞增殖并促進其凋亡，其機制可能與抑制 Wnt /β-catenin通路信號轉導，降低細胞內β-catenin蛋白水平有關。

美洛昔康；人結腸癌LoVo細胞；增殖抑制；凋亡誘導；Wnt /β-catenin信號；β-catenin蛋白

美洛昔康(meloxicam，Mel)是一種烯醇胺類的非甾體抗炎藥(NSAIDs)，是臨床上控制風濕性疾病的主要藥物之一，其胃腸道副作用較少、腎毒性較低。目前已有研究顯示，Mel在不同類型腫瘤包括胃癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌等具有增殖抑制和凋亡誘導作用，但相關機制還有待闡明[1-3]。結腸癌(colorectal carcinoma, CRC)是一種發病率和死亡率呈逐年上升的惡性腫瘤，在常見的胃腸道惡性腫瘤中，結腸癌的發病率位居全球第2位。結腸癌診療技術的發展為患者帶來了一定的福音，但晚期患者的預后仍不理想，5年生存率仍維持在50%左右[4]。早期結腸癌的首選治療方式是手術切除，而晚期或復發病例則以藥物治療為主。研究表明，Wnt信號通路在腸道發育和腫瘤發生過程中扮演重要角色；β-catenin 蛋白水平調節因子發生突變，可導致β-catenin蛋白的胞質和核累積，使Wnt信號通路被過度激活，可能參與結腸癌的發生[5-6]。因此，β-catenin 可能是結腸癌的藥物治療靶點。本工作研究Mel對結腸癌LoVo細胞增殖、凋亡的影響及其相關機制，期望能給Mel的抗腫瘤新用途提供初步的實驗研究基礎與相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞培養人結腸癌LoVo細胞購自ATCC(American Type Culture Collection)；Meloxicam購自西安昊軒生物科技有限公司；試驗所用抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；Lipofectamine購自Invitrogen公司；培養細胞采用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、100 kU ·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素)、DMEM培養基和胎牛血清均購自Hyclone；培養條件為5% CO2和37 ℃。其它常用的生物化學和分子生物學試劑均為分析純。

1.2 實驗設計及分組分為對照組和實驗組。實驗組使用Mel處理，Mel用DMSO溶解，設立20、40、60、80和100 μmol·L-1五個實驗組；對照組的處理是使用相同體積的DMSO。

1.3 結晶紫染色法評估增殖生長至對數期的細胞鋪于24孔板，每孔的細胞數目為5×103，分別使用20、40、60、80和100 μmol·L-1的Mel或加入DMSO溶劑處理。藥物作用細胞24、48和72 h后進行結晶紫染色以檢測細胞增殖情況，每個時間點的試驗重復3次。移除培養基，用預冷PBS(4 ℃)洗3次去除殘余培養基。每孔加入用PBS緩沖、用體積分數為 0.1的甲醛配制的飽和結晶紫溶液0.2 mL， 室溫下孵育25 min后，棄結晶紫染液，用PBS清洗3次以除去未與細胞結合結晶紫。將24孔板置于室溫下晾干后進行掃描。每孔加入體積分數為 0.2 的乙酸 0.2 mL震蕩 10 min以溶解結晶紫，采用全自動酶標儀測定OD值(λ =590 nm)定量。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡將生長至對數期的細胞接種于6 孔板，每孔細胞數目為1×105，貼壁后按實驗分組分別加入20、40、60 μmol·L-1的Mel或加入DMSO溶劑處理24 h，用無EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞后，用預冷PBS(4 ℃)洗滌2次，隨后重懸于1 mL PBS(4 ℃)。收集的細胞通過流式細胞術進行細胞周期和凋亡分析，每組試驗重復3次。

1.5 螢光素酶報告質粒法將生長至對數期的細胞接種于T25培養瓶，每瓶細胞數為1×106。 細胞貼壁后，每個T25用Lipofectamine轉染3.0 μg LEF/TCF4報告質粒(pTOP-Luc)和E-box報告質粒(pBG-Myc/Max-Luc)，轉染6 h后換DMEM培養基培養。換液12 h后消化細胞，并接種于24孔板中，每孔的細胞數目為5×103，細胞貼壁后按實驗分組分別加入20、40、60 μmol·L-1的Mel進行干預或加入DMSO溶劑處理。24 h后，充分裂解細胞，樣品上機檢測。螢光素酶活性測定Wnt/β-catenin信號通路活性，方法參照試劑盒(美國NEB公司)說明書；BCA 法測定抽提總蛋白濃度用于結果校正；每組重復3次。

1.6 HE染色每組取對數期2×103個細胞進行細胞爬片，24 h后分別使用20、40、60 μmol·L-1的Mel或加入DMSO溶劑干預。加藥24 h后棄培養基，用體積分數為0.95的酒精固定細胞，用蘇木精和伊紅分別對細胞核、細胞質進行染色，然后進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后滴加中性樹脂封片。凋亡細胞鑒定經典的形態學特征使用正置顯微鏡(日本Nikon)，每組試驗重復3次。

1.7 Western blot 實驗將對數期細胞接種于6 孔板中，每孔中的細胞數為1×105，分別使用20、40 μmol·L-1的Mel和DMSO溶劑處理，并設溶劑對照，相同條件下分別培養24 h、48 h后收集細胞，抽提各組總蛋白，細胞裂解和溶胞產物通過煮沸10 min變性，采用BCA法進行總蛋白定量；總蛋白用10%的變性聚丙烯酰胺不連續凝膠(SDS-PAGE)進行電泳，將目標蛋白從凝膠電轉至PVDF 膜，隨后按Western blot常規方法進行操作，化學發光法ECL顯影，凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)成像并分析結果；每組試驗重復3次。

2 結果

2.1 Mel對細胞增殖的影響結晶紫染色及細胞周期分析結果顯示(Fig 1)，Mel干預組與對照組相比增殖明顯受到抑制，量化結果顯示(Tab 1),Mel的增殖抑制作用表現為時間和濃度依賴性。流式細胞周期結果顯示，G1期細胞明顯增多，細胞DNA合成受到阻滯。Mel能明顯抑制人結腸癌LoVo細胞增殖。

Fig 1 Effects of meloxicam on the proliferation of LoVo cells

LoVo cells were treated with different concentrations of meloxicam for 24, 48 and 72 h, followed by crystal violet viability assay and flow cytometry analysis. A: Crystal violet staining results; B: Flow cytometry measurement of cell cycle.

Tab 1 The analysis results of the crystal violet staining

**P<0. 01vscontrol group.

2.2 Mel對細胞凋亡的影響流式細胞分析及 HE染色結果顯示(Fig 2)，分別使用20、40 和 60 μmol·L-1Mel處理LoVo細胞24 h后，細胞凋亡率以濃度依賴的方式而增加，對照組的凋亡率為(4.47±0.19)%，而20、40 和 60 μmol·L-1的Mel組的細胞凋亡率分別為(10.04±0.56)%(t=16.324，P=0.001)、(16.14±0.71)%(t=25.145，P=0.001)、(33.6±1.7)%(t=30.766，P=0.001)。HE染色結果直觀地顯示，在(400×)正置顯微鏡下，細胞凋亡的經典形態學變化包括細胞收縮，核固縮，細胞偽足減少等。Mel能促進LoVo 細胞凋亡。

Fig 2 Effects of meloxicam on apoptosis in LoVo cells

LoVo cells were treated with different concentrations of meloxicam for 24 h, followed by flow cytometry measurement of cell apoptosis and H&E stain. A: Flow cytometry measurement of apoptosis; B: HE stain results.

2.3 Mel對Wnt/β-catenin信號轉導的影響根據螢光素酶報告質粒結果(Fig 3)，TCF/LEF轉錄活性數值：與對照組比較，20 μmol·L-1組降至(91.23±4.78)%(t=1.87，P=0.141)；40 μmol·L-1組降至(62.79±3.05)%(t=9.074，P=0.003)；60 μmol·L-1組降至(40.05±2.79)%(t=14.864,P=0.001)。Myc/Max轉錄活性數值：與對照組比較，20 μmol·L-1組降至(88.64±4.91)%(t=2.45，P=0.074)；40 μmol·L-1組降至(55.28±3.35)%(t=11.044，P=0.001)；60 μmol·L-1組降至(35.9±2.38)%(t=16.904,P=0.001)。Mel作用后，LoVo細胞中LEF/TCF4與c-Myc/Max的轉錄活性明顯降低，且呈濃度依賴性。Mel能明顯下調細胞Wnt /β-catenin通路的信號轉導。

Fig 3 Effects of meloxicam on Wnt/β-catenin pathway signaling transduction of LoVo cells

pTOP-luc and p-SEB-Myc/Max-luc plasmids were employed to transfect LoVo cells. Then，cells were treated with different concentrations of meloxicam for 24 h, followed with luciferase activity quantitative.**P<0. 01vscontrol group.

2.4 Mel對細胞β-catenin蛋白水平的影響Western blot試驗結果顯示(Fig 4)，在24 h時間點，與對照組相比，20 μmol·L-1組的β-catenin蛋白水平降至(92.1±4.56)%(t=1.900，P=0.134)；40 μmol·L-1組降至(71.05±3.78)%(t=7.353，P=0.003)。在48 h 時間點，與對照組相比，20 μmol·L-1組的β-catenin蛋白水平降至(88.08±3.34)%(t=2.801，P=0.054)；40 μmol·L-1組降至(52.66±3.57)%(t=11.724，P=0.001)。Mel能明顯下調LoVo細胞中β-catenin蛋白表達水平，且呈時間和濃度依賴性。

3 討論

結腸癌是一種發病率和致死率均較高的惡性腫瘤。因此，探討結腸癌細胞增殖凋亡的相關因素及其分子機制，將有利于尋找新的治療途徑。目前認為，Wnt/β-catenin信號通路的激活可能是結腸癌的病理機制之一，多數結腸癌細胞均有β-catenin突變[7-10]。已有的證據表明，Mel可降低結腸癌、乳腺癌、食管癌和胃癌等的發病風險，提高抗癌治療的效果[11]。然而，Mel的抗癌作用機制尚不十分清楚。

Fig 4 Effects of meloxicam on protein level of β-catenin in LoVo cells

本實驗結果顯示，Mel能抑制人結腸癌細胞LoVo的增殖，促進LoVo細胞凋亡，而且這種抑制增殖或促進凋亡作用均具有時間和濃度依賴性。此外，Mel可降低LoVo細胞中β-catenin蛋白水平；β-catenin的下調可抑制腫瘤細胞生長和促進細胞凋亡，進而下調或抑制結腸癌細胞中過度激活的Wnt/β-catenin信號通路。可見，Mel對人結腸癌細胞LoVo的抑制增殖或促進凋亡作用可能與干擾Wnt/β-catenin信號通路有關。然而，Mel是如何調節β-catenin蛋白表達的？如何抑制Wnt信號通路的？其詳細機制還有待于進一步的深入研究。總之，本研究結果給Mel的抗腫瘤新用途提供初步的理論依據與實驗基礎，對結腸癌的臨床防治具有一定的參考價值，對研究其它類似藥物的臨床新用途具有借鑒意義。

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Anti-proliferative effect of meloxicam and Wnt/β-catenin signal in colon cancer cells

ZHOU Mi1, HE Bai-cheng1, YANG Mao-sheng1,2

(1.ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing400016,China；2.DeptofPharmacology,SchoolofMedicine,JishouUniversity,JishouHunan416000,China)

Aim To investigate the inhibitory effect of meloxicam (Mel) on human colon cancer LoVo cells and its mechanism. Methods Crystal violet staining assay and flow cytometry assay were performed to determine the anti-proliferative effect of Mel. Flow cytometry assay and H&E assay were used to evaluate the apoptotic effect of Mel. Luciferase reporter plasmid ISRE-Luc was employed to measure the effect of Mel on the activation of Wnt/β-catenin signaling transduction. Western blot assay was used to detect effect of Mel on the expression level of β-catenin protein. Results Compared with the control group, the inhibitory rate of cell proliferation at 72 h and 100 μmol·L-1Mel was (57.635±3.86)% (t=10.044，P=0.001); the cell apoptotic rate at 24 h and 60 μmol·L-1Mel was (33.6±1.7)% (t=30.166，P=0.001); the transcriptional activities of TCF/LEF and Myc/Max at 24 h and 60 μmol·L-1were (40.05±2.79)% (t=14.864,P=0.001) and (35.9±2.38)% (t=16.904,P=0.001) respectively; the levels of intracellular β-catenin protein at 24 h or 48 h and 40 μmol·L-1were (71±3.78)%(t=7.353，P=0.003)or (52.66±3.57)%(t=11.724，P=0.001)respectively. Conclusion Mel may inhibit proliferation and promote apoptosis of LoVo cells by inhibiting Wnt/β-catenin pathway signaling transduction and decreasing intracellular β-catenin protein level.

meloxicam; human colon cancer LoVo cells; anti-proliferation; apoptosis; Wnt /β-catenin signal; β-catenin protein

時間：2015-3-3 11:08 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.020.html

2014-12-02,

2015-01-28

國家自然科學基金資助項目(No 81071462，81372120)

周 密(1987-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail:137127220@qq.com; 秧茂盛(1965-)，男，博士，教授，研究方向：藥理學，通訊作者,Tel: 0743-8759168， E-mail:1724041576@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.020

A

1001-1978(2015)03-0396-05

R329.24；R329.25；R735.350.22；R979.1