一種華法林用藥指導(dǎo)的多重SNP檢測方法

顏進(jìn) 南麗

(寧波海爾施基因科技有限公司 浙江寧波 315800)

一種華法林用藥指導(dǎo)的多重SNP檢測方法

顏進(jìn) 南麗

(寧波海爾施基因科技有限公司 浙江寧波 315800)

目的：為患者提供一種華法林用藥指導(dǎo)的多重SNP檢測方案。方法：采用多重PCR和毛細(xì)管電泳片段分離技術(shù)，同步檢測人基因組DNA 的5個(gè)SNP位點(diǎn)的7個(gè)基因型。結(jié)果：14個(gè)基因型、3個(gè)人基因組DNA內(nèi)參及1個(gè)PCR反應(yīng)內(nèi)參可以在同一個(gè)反應(yīng)管中擴(kuò)增，在毛細(xì)電泳時(shí)清晰分離。

華法林;SNP;個(gè)體化用藥

華法林是香豆素類口服抗凝血藥，在體內(nèi)有對抗維生素K(Vk)的作用，可以抑制維生素K參與的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的在肝臟的合成，對血液中已有的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ并無抵抗作用。目前被廣泛應(yīng)用于血栓栓塞性疾病的抗凝治療，但因治療窗窄，療效和不良反應(yīng)個(gè)體差異很大，不同個(gè)體間華法林穩(wěn)定劑量的差異可達(dá)20倍以上。據(jù)估計(jì)，服用華法林的患者中，每年有15.2%的人發(fā)生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5%。研究發(fā)現(xiàn)，藥酶CYP2C9*2和*31、維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體第1亞單位(VKORC1)的G-1639A［1］和C1173T［2］基因型、藥酶CYP4F2*3［3］、鈣控蛋白基因(CALU)rs339097［4］及γ-谷氨酰基羧化酶基因(GGCX)rs11676382［5］與華法林療效密切相關(guān)。華法林主要經(jīng)由CYP2C9代謝，CYP2C9*2和*3基因突變導(dǎo)致酶活性降低從而使華法林代謝減慢，血液中華法林濃度過高，易出現(xiàn)出血等嚴(yán)重不良反應(yīng)。華法林抑制VKORC1，從而發(fā)揮抗凝血作用，VKORC1的基因突變可使體內(nèi)VKORC1的生成減少，進(jìn)而對華法林的需求量下降，血液中華法林濃度相應(yīng)升高，需要減少。CYP4F2是維生素K的氧化酶，突變減少了Vk的代謝，使Vk濃度升高，需要提高華法林劑量。CALU可調(diào)控VKORC1，突變患者需要增加華法林劑量。GGCX利用被VKORC1還原的Vk激活凝血因子，突變患者需要減少華法林劑量。

本研究開發(fā)了一種用于華法林用藥指導(dǎo)的多重基因檢測試劑盒，同步檢測與華法林用藥相關(guān)的5個(gè)基因7個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因型，為醫(yī)生和患者提供了一種華法林用藥指導(dǎo)的新型檢測方案。

1.材料和方法

DNA提取

以抗凝靜脈血作為樣本進(jìn)行DNA提取。DNA提取在自動化提取工作站Smart LabAssist-32(臺灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)有限公司)上完成。試劑盒使用"核酸自動提取試劑盒(磁珠法)"(寧波海爾施基因科技，貨號：1060055)。

PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)：華法林PCR預(yù)混液16μL、Taq DNA聚合酶2μL、樣品DNA/華法林陽性對照2μL?；靹蚝蟀匆韵聹囟冗M(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)：94℃3分鐘;94℃30秒，60℃30秒，70℃30秒，共35個(gè)循環(huán);72℃3分鐘;4℃保存產(chǎn)物。

DNA片段分離

采用遺傳分析儀(3500/3130，美國生命公司或GeXP，美國貝克曼庫爾特公司)進(jìn)行DNA片段分離，詳見說明書。

2.結(jié)果

華法林試劑盒檢測人DNA樣品，因每個(gè)SNP位點(diǎn)有可能出現(xiàn)2個(gè)基因型峰，故共可能出現(xiàn)11-18個(gè)特征峰，其中7-14個(gè)為SNP特征峰、3個(gè)人DNA內(nèi)參特征峰(B1-B3)和1個(gè)PCR反應(yīng)內(nèi)參pcDNA特征峰(圖1)。華法林陽性對照檢測結(jié)果應(yīng)出現(xiàn)全部18個(gè)特征峰。

圖1 本試劑盒檢測人DNA樣品結(jié)果舉例。共出現(xiàn)12個(gè)特征峰：7個(gè)SNP位點(diǎn)只有1個(gè)雜合子(CYP4F2)，即8個(gè)基因型峰和4個(gè)內(nèi)參峰。

3.討論

目前常用的SNP檢測方法：qPCR法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，其缺點(diǎn)是通量低且探針成本高;DNA芯片有高通量等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)為成本昂貴、靈敏度低、重復(fù)性差且準(zhǔn)確性低;Sanger測序法是SNP分析金標(biāo)準(zhǔn)，能發(fā)現(xiàn)已知SNP和未知SNP，缺點(diǎn)是工作量大，周期長，多位點(diǎn)檢測累計(jì)價(jià)格相對昂貴。

本研究提供了一種快速、準(zhǔn)確同步檢測多個(gè)SNP位點(diǎn)用于指導(dǎo)華法林用藥指導(dǎo)的新方法。目前，國內(nèi)外尚無類似的研究報(bào)道。

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R452

B

1009-6019(2015)03-0060-02

卓永，(1963-11-)，男，大專，江蘇睢寧，主治醫(yī)師