酸性纖維素酶解硫化染色棉織物動力學研究

姚繼明， 竇春曉

(河北科技大學 紡織服裝學院， 河北 石家莊 050018)

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酸性纖維素酶解硫化染色棉織物動力學研究

姚繼明， 竇春曉

(河北科技大學 紡織服裝學院， 河北 石家莊 050018)

選用酸性纖維素酶處理未染色和經過C.I.硫化黑1 染料染色的純棉針織物，通過測定處理后織物的毛羽去除率、質量損失率、織物上的酶吸附量及處理殘液中的還原糖含量，分析纖維素酶與織物之間的相互作用并建立動力學方程。結果表明：織物上染料的存在對纖維素酶的吸附具有促進作用，但降低了毛羽去除率；纖維素酶處理染色織物與未染色織物具有相近的米氏常數，分別為51.81和49.97，但未染色織物的最大反應速率約為染色織物的10倍。

酸性纖維素酶； 硫化染料； 純棉針織物； 酶處理； 米氏常數； 最大反應速率

纖維素酶是一種可促進纖維素降解但自身不發生變化的生物催化劑。纖維素酶一般含有3種主要成分：外切β-1,4-葡聚糖纖維二糖水解酶(C1酶，也稱CBH)，內切β-1,4-葡聚糖水解酶(Cx, 也稱EG)，β-葡萄糖苷酶。纖維素酶降解纖維素是復雜的過程，主要依賴于各組分之間的相互協同作用[1-2]，纖維素酶主要應用于去除纖維素纖維織物表面的微纖維，使織物獲得光潔的外觀和柔軟的手感[3-4]。目前，研究人員已經做了大量的針對未染色織物的纖維素酶的水解動力學的研究[5-7]，但對于染色織物，纖維素酶水解染色織物的機制尚未得出一致結論[8-10]。

文獻[11]的研究發現，硫化染料染色織物在用酸性纖維素酶進行處理時，纖維素酶的作用效果受到很大的抑制。本文實驗采用酸性纖維素酶對未染色和經過C.I.硫化黑1 染料染色的純棉針織物進行處理，測定處理后織物的毛羽去除率、蛋白質吸附量、織物質量損失率及處理殘液中的還原糖含量，分析纖維素酶與織物之間的相互作用并建立動力學方程，得出酶處理過程中的米氏常數，并建立最大反應速率的回歸方程。

1 實驗部分

1.1 材料儀器

材料：純棉緯編針織物(面密度為160 g/m2)，C.I.硫化黑1，酸性纖維素酶L4，由石家莊美施達生物化工公司提供。其他化學藥品均為分析純。

儀器：THZ-82A水浴恒溫振蕩器(金壇榮華儀器制造有限公司)，高溫染色機(上海一派印染技術有限公司)，756型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 染色過程

將織物于20 ℃下投入含有0.8 g/L C.I.硫化黑1，20 g/L元明粉和1.2 g/L硫化堿的染浴中，浴比為1∶20，在高溫染色機上使染浴在20 min內升溫至90 ℃，并繼續染色60 min。將織物取出冷水洗凈后，置入含有5 mL/L雙氧水和5 mL/L醋酸的溶液中，常溫下反應15 min。織物洗凈晾干后放入含有1 g/L非離子洗滌劑和5 g/L碳酸鈉的溶液中，95 ℃下在高溫染色機中洗滌15 min，洗凈晾干。

1.2.2 酶處理

將織物浸入含有0.8、1.0、1.2 g/L的纖維素酶溶液中，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調節處理液pH值為5.0，處理液浴比為1∶20，采用水浴恒溫振蕩器在不同溫振時間條件下對染色及未染色的棉針織物進行酶處理。

1.3 測試方法

1.3.1 纖維素酶活性的測定

纖維素酶的活性用濾紙測定法來測定，濾紙酶活(FPA)也稱總酶活，Cx酶活用羧甲基纖維素測定，C1酶活以脫脂棉為底物測定，BG酶活測定以纖維二糖為底物進行[12-13]。

1.3.2 毛羽去除率的測定

將酶處理前后的織物沿橫向折疊壓平，用Microscope物視顯微鏡獲取織物折疊邊緣3個不同位置的照片，通過Photoshop軟件進行圖片分析處理，計算圖片中絨毛部分的光點數占整個照片光點數的百分比，根據下式計算處理前后織物圖片光點數百分比的變化率η，以η值作為織物的毛羽去除率。

式中：Y0為織物酶處理前的圖片光點數百分比；Y1為織物酶處理后的圖片光點數百分比。

1.3.3 還原糖含量及蛋白質吸附量的測定

酶處理殘液中的還原糖含量，用堿性條件下處理液還原3,5-二硝基水楊酸的方法確定[14]。織物上吸附的蛋白質含量采用紫外分析法測定，用756型紫外可見分光光度計分別測定處理液在波長為280 nm與260 nm下的吸光度，從而計算得出處理殘液中的蛋白質含量，織物處理前后處理液中蛋白質含量的差值即為織物上的蛋白質吸附量，也就是織物上纖維素酶的吸附量[15]。

1.3.4 纖維素酶處理后織物質量損失率的計算

在織物處理前先將織物烘干至質量穩定，用萬分之一天平稱量，處理后織物洗凈晾干后同樣烘至質量穩定，用萬分之一天平稱量。根據下式計算織物的質量損失率。

式中：W0為織物處理前的質量；W1為織物處理后的質量。

2 結果與討論

2.1 不同溫度下纖維素酶的各組分活性

實驗中測得的不同溫度下酸性纖維素酶的酶活數值如表1所示。

表1 不同溫度下纖維素酶L4的酶活值

根據表1數據可看出，在40～60 ℃范圍內，纖維素酶的各組分酶活性都隨著溫度的升高而增強，這個溫度范圍是大多數纖維素酶的最佳作用溫度。

2.2 織物上蛋白質吸附量的分析

織物上蛋白質的吸附量與纖維素酶對織物進行酶處理的作用效果有直接影響，圖1示出了不同處理條件下織物上蛋白質的吸附量。

圖1 不同酶質量濃度時織物上的蛋白質吸附量Fig.1 Protein adsorption at L4 concentration of 0.8 g/L (a), 1.0 g/L (b) and 1.2 g/L(c)

根據圖1可看出，在相同纖維素酶質量濃度的處理液中，在一定時間范圍內，隨著時間的延長，織物上纖維素酶的吸附量均勻增加。80 min后，織物上纖維素酶吸附量不再顯著變化，這主要是由于吸附在纖維上的部分纖維素酶隨著纖維的水解從纖維表面剝離下來，但隨著微細纖維從纖維表面脫落，纖維素酶與纖維之間發生新的吸附，織物上纖維素酶的吸附與解吸達到動態平衡。

隨著溫度升高，織物上蛋白質的吸附量增加，這可能是由于溫度升高，有利于纖維素酶的運動和酶與纖維素之間的相互接觸，同時隨著溫度的升高，酶的活性及酶向纖維素的吸附速率都有所增強，這些都將造成織物上蛋白質吸附量的增加。

處理液中纖維素酶質量濃度較高時，織物上與處理液中的纖維素酶有較高的濃度差，處理液中纖維素酶質量濃度與織物上的差值越大，吸附到織物上的纖維素酶量越高。

對比硫化染料染色織物與未染色織物，染色織物上有較高的纖維素酶吸附量，這表明織物上硫化染料的存在并未影響纖維素酶在纖維上的吸附，而硫化染料的存在促進了織物上纖維素酶的吸附。

2.3 毛羽去除率

毛羽去除率用來表征織物經纖維素酶處理后，纖維表面微纖維的去除程度。織物表面毛羽去除越干凈，毛羽去除百分比越高，表明纖維素酶對纖維素纖維的作用越強。圖2示出了不同條件下染色與未染色織物的毛羽去除率。

圖2 酶質量濃度為1.0 g/L時織物上的毛羽去除率Fig.2 η values at enzyme concentration of 1.0 g/L

由圖2可明顯看出，在40～60 ℃之間，溫度升高，織物上毛羽去除率顯著增大。造成這一結果的原因是：首先，隨著溫度的升高，纖維素酶活性增強，降解纖維的能力提高，對織物表面的毛羽有較強的去除效果；其次，隨著溫度升高，纖維上酶的吸附量增加，有更多的酶分子參與到對纖維的降解過程中；再次，溫度升高，紗線膨化，也有利于微細纖維的脫落。

對比染色織物與未染色織物，相同溫度下，未染色織物的毛羽去除效果好，原因在于織物上染料的存在阻礙了纖維素酶與纖維之間的相互作用，同時纖維上存在的染料還可能對纖維素酶的活性有抑制作用。

隨著處理時間的延長，織物的毛羽去除率增加，但增長速率逐漸下降，這表明隨著時間的延續，纖維素酶與織物之間的相互作用變弱。造成這一現象的原因可能是纖維上酶的吸附量逐漸飽和，同時由于酶解產物的增加，降低了酶解的速率。

2.4 處理過程中還原糖質量濃度分析

上述實驗得出的纖維素酶活力值是在特定底物下測得的，只能表明對特定底物的酶解能力，在纖維素酶處理織物的過程中，底物為棉纖維織物，特定底物條件下的活力值不能準確地反映纖維素酶實際的作用效果。采用處理過程中酶解產生的葡萄糖含量可動態地反映纖維素酶與織物之間的相互作用，葡萄糖含量越高，纖維素酶的水解作用越強，如表2所示。

表2 不同酶質量濃度時殘液中還原糖質量濃度

由表2可明顯看出，未染色織物處理液比染色織物處理液中的葡萄糖含量高。根據這一結果可得出織物上的染料顯著影響了纖維素酶的作用效果。綜合織物上蛋白質的吸附量及毛羽去除率的結果可認為，織物上的染料是造成葡萄糖含量降低的原因。通常情況下纖維素酶的活性受到反應產物纖維二糖、葡萄糖等產物的抑制，在本實驗中，纖維素酶的活性同時還受到織物上硫化染料的抑制，根據實驗結果，其對β-葡萄糖苷酶活性的抑制較纖維素酶的其他組分強。

表2中同時也給出了不同溫度條件下處理液殘液中葡萄糖的生成量。根據表中數據可看出：在酶質量濃度低于1.0 g/L，50 ℃時的葡萄糖質量濃度高于40 ℃和60 ℃的，原因是50 ℃時纖維素酶與纖維之間具有最強的相互作用；當酶質量濃度為1.2 g/L，開始時60 ℃的葡萄糖質量濃度高，但處理時間超過120 min后，葡萄糖質量濃度反而下降，這可能是由于在較高的溫度下，起始產生的葡萄糖抑制了酶的作用所致。

對比表中實驗結果可知，纖維素酶質量濃度越高，葡萄糖的生成量越高，這是由于纖維素酶質量濃度較高，織物上有較高的酶吸附量，織物上與處理液中較高的濃度差使得織物上酶的吸附量增多，酶與底物的反應更充分。

2.5 催化常數與最大反應速率

根據Michaelis-Menten模型[16-18]，纖維素酶水解纖維素的反應可用下式表示：

E+S?ES?E+P

式中：E為纖維素酶；S為反應底物；ES為酶與底物的復合物；P為反應產物。

隨著酶解過程中底物濃度隨時間的變化，Michaelis-Menten模型可表示為

式中：Vmax為最大反應速率；Km為Michaelis-Menten常數。

對上述方程進行積分，變換后為

當反應時間t=0時，[S]=[S0]；當反應時間t=t時，[S]=[St]，積分后最終的方程變為：

對表3中0.5 h之內的織物質量損失率數據進行分析處理，得出染色織物的米氏常數Km為51.81，未染色織物的米氏常數Km為49.97。不同溫度及不同酶質量濃度下水解反應的最大反應速率Vmax如表4所示。

利用Minitab軟件，對表4中的數據進行分析，將溫度與酶質量濃度的二次方項及溫度與酶質量濃度的交互作用考慮在內，得出染色織物最大反應速率的回歸方程為

表3 酶處理過程中織物質量損失率

表4 酶解最大反應速率

Vmax=0.034 8+0.006 8T+0.006 0C-

0.001 2T2+0.001 3C2-0.001 0TC

未染色織物的最大反應速率的回歸方程為

Vmax=0.358 6+0.033 8T+0.048 3C-

0.014 8T2-0.014 3C2-0.001 3TC

式中：T為溫度，℃；C為纖維素酶質量濃度，g/L。

根據Minitab軟件的分析結果，當對應項的顯著系數小于0.05時，該因素對因變量具有顯著影響，而當顯著系數大于0.05時，對應項對于因變量沒有顯著影響。根據分析結果，對于染色織物，其中溫度與酶質量濃度的平方項及溫度與酶濃度交互作用項的顯著系數分別為0.321，0.335，0.897，這3項的顯著系數均大于0.05，因此這3種因素對于纖維素酶最大反應速率的影響忽略不計，簡化后染色織物最大反應速率的回歸方程為

Vmax=0.034 8+0.006 8T+0.006 0C

同理，對未染色織物進行分析，簡化后的回歸方程為

Vmax=0.358 6+0.033 8T+0.048 3C

根據上式可看出，在相同的酶質量濃度及溫度下，未染色織物的最大反應速率約為染色織物的10倍，這一結果表明織物上染料的存在明顯抑制了纖維素酶對染色織物的酶解作用。

3 結 論

經過硫化黑染色的織物，在酶處理過程中，織物上纖維素酶的吸附量要高于未染色織物，但是染色織物的毛羽去除率明顯低于未染色織物，這表明織物上硫化染料的存在明顯降低了纖維素酶的作用效果，同時反應生成的葡萄糖量也證明了硫化染料抑制了纖維素酶的活性。

纖維素酶水解纖維素是在非均勻介質中進行的，其對纖維素的水解是一個復雜的過程，纖維素酶水解染色織物與未染色織物的米氏常數分別為51.81和49.97，二者的米氏常數沒有較大差異，而對于最大反應速率，相同處理條件下，未染色織物的最大反應速率約為染色織物的10倍，這表明織物進行染色后，纖維素酶解纖維素的速率降低，染料的存在顯著降低了纖維素酶的作用效果。

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[1] 曾盈宇, 陳介南, 何鋼. 纖維素酶及相關基因克隆的研究進展[J]. 湖南農業科學, 2009 (12) : 1-3, 7. ZENG Yingyu, CHEN Jienan, HE Gang. Process of cellulase and its related genic clone[J]. Hunan Agricultural Sciences, 2009 (12) : 1-3, 7.

[2] 陳燕勤, 毛培宏, 曽憲賢. 細菌纖維素酶結構和功能的研究[J]. 化學與生物工程, 2004(6): 4-6. CHEN Yanqin, MAO Peihong, ZENG Xianxian. Studies on structures and functions of the cellulase from bacteria [J]. Chemistry & Bioengineering, 2004(6): 4-6.

[3] 劉磊, 陸必秦. 纖維素酶在棉織物生物拋光中的應用[J]. 武漢紡織大學學報, 2011, 24(11): 34-36. LIU Lei, LU Biqin. Application on the bio-polishing for cotton fabric with cellulase[J]. Journal of Wuhan Textile University, 2011, 24(11): 34-36.

[4] ARTUR Cavaco Paulo. Mechanism of cellulase action in textile processes [J]. Carbohydrate Polymers, 1998, 37: 273-277.

[5] 沈勇, 王黎明, 孫凱. 纖維素酶對纖維素纖維酶解動力學的研究[J]. 東華大學學報：自然科學版, 2001, 27(1): 17-19. SHEN Yong, WANG Liming, SUN Kai. Research on the kinetics of the hydrolysis of cellulase to cellulose fibers in biofinishing[J]. Journal of Donghua University: Natural Science Edition, 2001, 27(1): 17-19.[6] IBRAHIM N A, EL-BADRY K E, HASSAN T M. A new approach for biofinishing of cellulose-containing fabrics using acid cellulases [J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83: 116-121.

[7] CORTEZ J M, ELLIS J, BISHOP D P. Cellulase finishing of woven, cotton fabrics in jet and winch machines [J]. Journal of Biotechnology, 2001, 89(2/3): 239-245.

[8] BUSCHLE D G, TRAORE M K. Influence of direct and reactive dyes on the enzymatic hydrolysis of cotton [J]. Textile Research Journal, 1998, 68(3): 185-192.

[9] EUN K C, SOON Y P, HEE C C, et al. Effect of pre-existing dyes and fabric type on cellulase treatment of cotton fabrics [J]. Textile Research Journal, 1997, 96(3): 155-162.

[10] PAULO A C, ALMEIDA L. Cellulase hydrolysis of cotton cellulose: the effects of mechanical action, enzyme concentration and dyed substrates[J]. Biocatalysis, 1994(4): 353-360.

[11] 姚繼明, 竇春曉, 鄭明遠，等. 纖維素酶對不同染料染色針織物拋光效果比較[J]. 針織工業, 2014(3): 32-36. YAO Jiming, DOU Chunxiao, ZHENG Mingyuan, et al. Comparison of polishing effects on knitted fabric dyed by different dyes with cellulase[J]. Knitting Industries, 2014(3): 32-36.

[12] MARCOS H L S, MARTINHO R, ELBA P D S B, et al. A simple and fast method for the determination of endo- and exo-cellulase activity in cellulase preparations using filter paper [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2012, 51(1): 280- 285.

[13] LEE W C, LEE R Y, RUAAN R C. Effect of cell concentration on the kinetics of whole-cell enzyme entrapped within calcium alginate [J]. Biotechnol Progress, 1995, 11(4): 461-464.

[14] 李環, 陸佳平, 王登進. DNS法測定山楂片中還原糖含量的研究[J]. 食品工業科技, 2013, 34(18): 75-77. LI Huan, LU Jiaping, WANG Dengjin. Study on determination of reducing sugar from haw flakes with DNS colorimetry method[J]. Science and Technology of Food Industry, 2013, 34(18):75-77.

[15] 路蘋, 于同泉, 王淑英，等. 蛋白質測定方法評價[J]. 北京農學院學報, 2006, 21(2) :65-69. LU Ping, YU Tongquan, WANG Shuying, et al. A review on determination of protein[J]. Journal of Beijing Agricultural College, 2006, 21(2) :65-69.

[16] BANSAL Prabuddha, HALL Mélanie, REALFF Matthew J, et al. Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates [J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(6): 833-848.

[17] MARANGONI A G. 酶催化反應動力學：方法與應用[M]. 北京: 化學工業出版社, 2007: 37-51. MARANGONI A G. Enzyme Kinetics：A Modern Approach[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2007: 37-51.

[18] 袁勤生. 現代酶學[M]. 上海: 華東理工大學出版社, 2007:5-30. YUAN Qinsheng. Modern Enzymology[M]. Shanghai: East China University of Science and Technology Press, 2007: 5-30.

Hydrolysis kinetics of acid cellulase on sulfur black dyed cotton fabric

YAO Jiming, DOU Chunxiao

(CollegeofTextileandGarments,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang,Hebei050018,China)

The acid cellulase was used to treat the undyed and dyed cotton knitting fabrics with C.I. sulfur black 1, the hairiness removal percentage, weight loss of the fabric, the cellulase adsorption on the fabric and the reducing sugar in the residue were determined to explore the interaction between cellulase and fabric to set up kinetic equation. As results, existed dyes in the fabric promoted the adsorption of cellulase to the fabric, declined the hairiness removal percentage; the closed Michaelis constant value of dyed fabric 51.81 and undyed fabric 49.97 obtained. However, the maximum velocity of undyed fabric being almost 10 times of dyed fabric.

acid cellulase; sulfur dye; cotton knitted fabric; cellulase treatement; Michaelis constant; maximum velocity

10.13475/j.fzxb.20141105606

2014-11-21

2015-04-12

河北省自然科學基金資助項目(B2013208082)；河北科技大學五大平臺開放基金項目(2013FZ04)

姚繼明(1965—)，男，教授，博士。研究方向為紡織生化加工技術。E-mail：yaojiming66@126.com。

TS 195.1

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