雞瘦素受體胞外域成熟肽重組蛋白質的表達以及多克隆抗體的制備

雷明明, 吳思謙, 李孝偉, 施振旦

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所動物品種改良和繁育重點實驗室,江蘇南京 210014;2.華南農業大學動物科學學院,廣東廣州 510642)

雞瘦素受體胞外域成熟肽重組蛋白質的表達以及多克隆抗體的制備

雷明明1, 吳思謙2, 李孝偉2, 施振旦1

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所動物品種改良和繁育重點實驗室,江蘇南京 210014;2.華南農業大學動物科學學院,廣東廣州 510642)

根據雞瘦素受體基因(LEPR)編碼區序列(GenBank:NM_AB033383)設計并合成2對引物,以雞肝臟cDNA為模板擴增雞LEPR胞外域2段cDNA序列。然后將這2段序列克隆到表達載體pRSET-A的BamH I和Hind III酶切位點之間,構建重組表達載體(pR-LEPR1和pR-LEPR2)并轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。轉化菌在IPTG誘導后分別表達了分子量為2.62×104的LEPR1和分子量為2.86×104的LEPR2重組蛋白質。經凝膠Ni-NTA純化后的重組蛋白質與礦物油佐劑混合免疫生長雞,經過3次免疫之后,獲得高效價的抗LEPR1和抗LEPR2抗血清。

瘦素受體;成熟肽序列;克隆和表達;多克隆抗體

瘦素(Leptin)是由白色脂肪細胞分泌的一種多肽,在調節攝食、代謝和能量平衡方面有重要作用[1-2]。在中樞神經系統,瘦素可以抑制下丘腦神經肽Y和促進肥胖素(Orexin)的表達來抑制攝食[3]。在外周能量代謝調控中,瘦素可以通過降低血糖濃度和提高AMP激活蛋白激酶(AMPK)的活性來促進代謝[4],刺激脂肪氧化代謝和降低胰島素樣生長因子-I (IGF-I)的分泌來降低甘油三酯的濃度[5-6]。1998年Taouis等首次報道了雞瘦素基因[7],隨后Friedman-Einat等報道無法檢測雞等鳥類血清中的瘦素[8],Hen等利用瘦素信號傳導細胞模型也幾乎檢測不到雞血液瘦素信號[9],Pitel等報道雞基因組缺失哺乳動物瘦素基因座位區域[10]。最近一些研究者相繼報道發現了草雀、鴿子、鴨子等瘦素基因片段和基因[11-12]。2014年,日本學者Ohkubo等也報道雞血清中可能存在瘦素[13]。盡管對雞是否存在瘦素仍有爭議,但雞瘦素受體(Leptin receptor,LEPR)是真實存在的,并且在雞的許多組織中表達[14-15]。

LEPR有a、b、c、d、e、f 6種不同的亞型[16],其中a、c、d、e、f這5種是短型受體,b是長型受體。這些亞型中只有長型受體LEPR-b包含了激活JAK-STAT信號傳導途徑所必需的一段胞質區和疏水氨基酸殘基,是瘦素的重要功能性受體。雞LEPR-b有1 148個氨基酸,在胞質區有3個保守的酪氨酸殘基,分別是Tyr985、Tyr1077和Tyrl138,這3個氨基酸在LEPR激活的過程中起重要作用。2014年Lei等研究發現對生長雞免疫LEPR胞外域后產生的抗LEPR抗體可以顯著加強LEPR的信號轉導,促進脂肪代謝相關基因的表達和降低脂肪合成基因的表達,導致脂肪沉積減少[17]。但是,對雞免疫LEPR胞外域后產生的抗LEPR抗體加強LEPR信號轉導的作用機理尚不清楚,需要進一步深入研究。因此,本研究旨在通過構建雞受體胞外域蛋白融合表達載體,獲得雞瘦素受體胞外域不同區域融合蛋白,并且利用融合蛋白制備受體特異性的多克隆抗體,為研究雞瘦素和雞瘦素受體的生物功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

pMD18-T載體購自TaKaRa公司,E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)和pRSET-A由江蘇省農業科學院畜牧研究所動物品種改良與繁育重點實驗室保存。限制性內切酶BamH I和Hind III、Ex TaqDNA聚合酶、DL2000分子量標準、T4連接酶及膠回收試劑盒為TaKaRa公司產品。用于純化的帶His-tag的50%Ni-NTA凝膠(Qiagen)購自基因公司。辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.2 雞LEPR成熟肽基因序列的克隆、重組蛋白質表達和純化

根據雞LEPR基因編碼區的核苷酸序列(Gen-Bank:NM_204323.1)設計2對引物并由上海英駿公司合成。第1對引物在N-末端,成熟肽包含第101～300位的共200個氨基酸殘基,上游引物序列為下游引物序列為第2對引物在胞外域的近膜段,成熟肽包含第582～796位上的共215個氨基酸殘基,上游引物序列為下游引物序列為引物中包含有Hind III酶切位點和BamH I酶切位點。將雞的肝臟組織cDNA作為模板,用這2對引物進行PCR擴增,分別得到1條600 bp和1條645 bp的2段LEPR,然后分別將這2段LEPR克隆插入pMD18-T載體構建重組質粒pLEPR1和pLEPR2,并將其轉化入E.coliDH5α細胞株增殖復制。

抽提pLEPR1和pLEPR2質粒并用BamH I和Hind III雙酶切,經凝膠電泳分離回收LEPR1和LEPR2 cDNA片段,并克隆插入表達載體pRSET-A的BamH I和Hind III兩位點之間,構建pR-LEPR1和pR-LEPR2重組載體。將這2個載體轉化到E. coliBL21(DE3),用IPTG誘導表達pR-LEPR1和pR-LEPR2重組蛋白質,經SDS-PAGE驗證蛋白的表達和分子大小之后,用50%Ni-NTA凝膠在變性條件下進行純化。

1.3 LEPR1和LEPR2特異性多抗的制備和純化

將純化并透析復性后的LEPR1和LEPR2重組蛋白質與白油混合制成含重組蛋白質1 mg/ml的油乳劑,并對生長雞進行肌肉注射,每只注射油乳劑1 ml。間隔14 d免疫1次,共免疫3次。每次免疫前翅下靜脈采血,第3次免疫后第5 d翅下靜脈采血。用33%飽和硫酸氨純化多克隆抗體,純化得到的抗體保存于-20℃。

1.4 ELISA檢測抗血清效價

將LEPR1和LEPR2抗原稀釋至濃度為10 μg/ml包被96微孔酶標板,每孔加入100 μl,4℃包被過夜,次日倒掉包被液,用洗滌液(0.05%Tween+ PBS)洗3次,加5%的BSA-PBS于37℃封閉1 h,洗滌3次后依次加免疫血清、HRP羊抗雞IgG(1∶4 000稀釋),最后加底物TMB,37℃顯色25 min,加2 mol/L硫酸終止反應,測定450 nm光吸收值作為抗體效價。

2 結果與分析

2.1 雞LEPR1和LEPR2基因cDNA克隆

從雞肝臟組織中提取總RNA,經反轉錄和PCR擴增后,獲得2條特異條帶,長度與預期的相符。經測序證明獲得的序列為雞LEPR基因cDNA序列,與GenBank中所提交的序列完全一致,包含所引入的2個酶切位點。通過雙酶切和連接將雞LEPR基因2個cDNA片段插入原核表達載體pRSET-A,獲得重組的表達載體pR-LEPR1和pR-LEPR2。經過Hind III和BamH I雙酶切鑒定,分別獲得長度長為600 bp和645 bp的片段(圖1)。

圖1 雞LEPR1和LEPR2基因的RT-PCR克隆Fig.1 The amplification of chicken LEPR1 and LEPR2 genes by RT-PCR

2.2 在E.coli BL21(DE3)中表達的雞LEPR1和LEPR2成熟肽及其純化

轉化重組質粒pR-LEPR1和pR-LEPR2的E. coliBL21(DE3)株在LB(AMP+)液體培養基中培養并經IPTG誘導后,表達出分子量約為2.62×104的LEPR1和分子量約為2.86×104的LEPR2重組蛋白質(圖2)。對2個重組蛋白質進行Western blot分析,發現轉化重組質粒有免疫條帶出現(圖2),說明pR-LEPR1和pR-LEPR2正確表達出含有雞LEPR的2段融合蛋白質。

圖2 原核表達的雞LEPR1和LEPR2重組蛋白質的表達以及純化蛋白質的電泳圖譜和Western blot檢測圖Fig.2 The expression of recombinant chicken LEPR1 and LEPR2 proteins,SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein,and Western blot analysis of the recombinant protein

2.3 ELISA檢測血清抗體效價

從圖3可以看出,在免疫LPER1和LEPR2重組蛋白質之后雞血清中多克隆抗體LPER1抗體和LEPR2抗體的抗體效價(由ELISA分析的OD值代表)逐漸升高。免疫前血清中抗體效價較低,免疫2次后效價有所上升,免疫3次后效價進一步升高。

圖3 免疫LEPR1、LEPR2和BSA后雞血清中多克隆LEPR1抗體和LEPR2抗體的抗體效價Fig.3 Anti-LEPR1 and anti-LEPR2 antibody titers in chicken antiserum after immunization

2.4 抗LEPR1和LEPR2多克隆抗體的純化

反復用33%飽和硫酸氨提純雞血清,收集蛋白質并進行SDS-PAGE電泳。電泳圖譜出現較純的輕鏈(分子量2.5×104)和重鏈(5.5×104)條帶(圖4),抗體純度達到96%以上。用ELISA測定純化后抗體的效價,純化后1.2 mg/ml多克隆抗體按倍比稀釋,隨著抗體濃度越來越低,顯色越來越淺,稀釋至1∶6 400時P/N值仍大于2。

圖4 純化后多克隆抗體的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE profile of purified polyclonal antibody

3 討論

本研究克隆了雞LEPR基因胞外域2段cDNA序列,將雞LEPR基因胞外域2段cDNA序列插入表達質粒pRSET-A的BamH I和Hind III兩酶切位點之間,表達出2個融合蛋白質。一個融合蛋白質由236個氨基酸殘基組成,其N端36個殘基(包括6×His的組氨酸標簽)源自pRSET-A的序列,C端的200個氨基酸殘基源自雞LEPR;另一個融合蛋白質有251個氨基酸殘基,同樣N端36個氨基酸殘基(包括6×His的組氨酸標簽)源自pRSET-A的序列, C端的215個氨基酸殘基源自雞LEPR。經過多重PCR擴增、酶切和連接等,獲得閱讀框架正確的表達載體pR-LEPR1和pR-LEPR2。所表達的重組蛋白質可與Ni-NTA凝膠結合并被純化,說明蛋白分子中具有來源于表達載體pRSET-A的6個連續組氨酸標簽序列(His-Tag)。說明分子克隆操作和所表達的重組蛋白質分子表達的正確性,為動物免疫實驗等研究工作奠定了基礎。

本研究獲得的多克隆抗體來自于經LEPR抗原免疫的雞血清,這種蛋白質抗原有多個不同的抗原決定簇,為了獲得特異性高的多克隆抗體需要純度較高的抗原。抗LEPR1和抗LEPR2兩種多克隆抗體的效價測定結果顯示,隨著免疫次數的增加,多克隆抗體效價不斷升高。抗體是一種特殊分子,它不僅可以和受體結合,而且可以觸發受體的信號轉導,最典型的例子就是Graves病癥,病人自身產生抗TSHR抗體導致甲狀腺功能亢進[18-19]。以受體的胞外區蛋白質作為抗原,通過主動免疫可以不斷提高抗體效價,刺激或拮抗受體信號[20]。對產蛋雞免疫重組蛋白質LEPR1后發現抗LEPR1抗體可以顯著加強LEPR的信號轉導,抑制卵泡發育和降低產蛋率[21];同樣對生長雞免疫融合蛋白質LPER2后發現抗LEPR2抗體也可以顯著加強LEPR的信號轉導,促進脂肪代謝和抑制脂肪沉積[17]。這些研究結果表明對雞免疫LPER蛋白質產生的抗LPER抗體加強了Leptin樣物質的生物活性。抗體與受體如何作用加強LEPR信號轉導的機理并不清楚,需要進一步研究。而本研究所制備的高純度抗LEPR1和抗LEPR2兩種多克隆抗體,則可以應用于研究抗體與受體間的動力學和調控脂肪代謝和繁殖性狀的研究工作。

[1] PELLEYMOUNTER M A,CULLEN M J,BAKER M B,et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ ob mice[J].Science,1995,269:540-543.

[2] STOCKEBRAND M,SAUTER K,NEU A,et al.Differential regulation of AMPK activation in leptin-and creatine-deficient mice [J].The FASEB Journal,2013,27:4147-4156.

[3] KANOSKI S E,ALHADEFF A L,FORTIN S M,et al.Leptin signaling in the medial nucleus tractus solitarius reduces foodseeking and willingness to work for food[J].Neuropsychopharma-cology,2014,39:605-613.

[4] BRABANT G,MULLER G,HORN R,et al.Hepatic leptin signaling in obesity[J].The FASEB Journal,2005,19:1048-1050.

[5] ATKINSON L L,FISCHER M A,LOPASCHUK G D.Leptin activates cardiac fatty acid oxidation independent of changes in the AMP-activated protein kinase-acetyl-CoA carboxylase-malonyl-CoA axis[J].J Biol Chem,2002,277:29424-29430.

[6] LEE Y,NASEEM R H,DUPLOMB L,et al.Hyperleptinemia prevents lipotoxic cardiomyopathy in acyl CoA synthase transgenic mice[J].PNAS,2004,101:13624-13629.

[7] TAOUIS M,CHEN J W,DAVIAUD C,et al.Cloning the chicken leptin gene[J].Gene,1998,208:239-242.

[8] FRIEDMAN-EINAT M,BOSWELL T,HOREV G,et al.The chicken leptin gene:Has it been cloned?[J]Gen Comp Endocrinol,1999,115:354-363.

[9] HEN G,YOSEFI S,RONIN A,et al.Monitoring leptin activity using the chicken leptin receptor[J].J Endocrinol,2008,197: 325-333.

[10]PITEL F,FARAUT T,BRUNEAU G,et al.Is there a leptin gene in the chicken genome?Lessons from phylogenetics,bioinformatics and genomics[J].Gen Comp Endocrinol,2010,167:1-5.

[11]HUANG G,LI J,WANG H,et al.Discovery of a novel functional leptin protein(LEP)in zebra finches:evidence for the existence of an authentic avian leptin gene predominantly expressed in the brain and pituitary[J].Endocrinology,2014,155(9):3385-3396.

[12]PROKOP J W,SCHMIDT C,GASPER D,et al.Discovery of the elusive leptin in birds:identification of several′missing links′in the evolution of leptin and its receptor[J].PLoS One,2014,9 (3):e92751.

[13]OHKUBO T,HIROTA K,MURASE D E,et al.Avianblood induced intranuclear translocation of STAT3 via the chicken leptin receptor[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2014, 174:9-14.

[14]HOREV G,EINAT P,AHARONI T,et al.Molecular cloning and properties of the chicken leptin-receptor(CLEPR)gene[J].Mol Cell Endocrinol,2000,162:95-106.

[15]OHKUBO T,TANAKA M,NAKASHIMA K.Structure and tissue distribution of chicken leptin receptor(cOb-R)mRNA[J].Biochim Biophys Acta,2000,1491:303-308.

[16]TARTAGLIA L A.The leptin receptor[J].J Biol Chem,1997, 272:6093-6096.

[17]LEI M M,WU S Q,SHAO X B,et al.Creating leptin-like biofunctions by active immunization against cLEPR in growing chickens[J].Domest Anim Endocrinol,2015,50:55-64.

[18]RAPOPORT B,CHAZENBALK G D,JAUME J C,et al.The thyrotropin(TSH)-releasing hormone receptor:interaction with TSH and autoantibodies[J].Endocr Rev,1998,19:673-716.

[19]MCLACHLAN S M,NAGAYAMA Y,RAPOPORTB.Insight into graves′hyperthyroidism from animal models[J].Endocr Rev, 2005,26:800-832.

[20]HILL R A,FLINT D J,PELL J M.Antibodies as molecular mimics of biomolecules:roles in understanding physiological functions and mechanisms[J].Adv Physiol Educ,2008,32:261-273.

[21]LEI M,WU S,LI X,et al.Leptin receptor signaling inhibits ovarian follicle development and egg laying inchicken hens[J]. Repro Biol and Endocri,2014,8:25.

(責任編輯:張震林)

Expression of recombinant protein of chicken leptin receptor extracellular domain mature peptide and the preparation of its polyclonal antibody

LEI Ming-ming1, WU Si-qian2, LI Xiao-wei2, SHI Zhen-dan1
(1.Laboratory of Animal Breed Improvement and Reproduction,Institute of Animal Science,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014, China;2.College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Two pairs of primers designed based on the chicken leptin receptor gene(LEPR)mature peptide sequence(GenBank:NM_AB033383)were used to amplify two cDNA sequence fragments of chicken LEPR extracellular domains(ECD)mature peptides with chicken liver cDNA as the template.The two cDNA sequence fragments were cloned into the BamH I and Hind III sites of the plasmid pRSET-A to generate the expression vector pR-LEPR1 and pR-LEPR2,which were further transformed into bacterium Escherichia coli BL21(DE3).The transformed bacteria were induced to produce recombinant proteins LEPR1 and LEPR2 with the expected molecular mass of 2.62×104and 2.86×104by IPTG.The recombinant LEPR1 and LEPR2werepurifiedandmixedintomineraloil adjuvant to immunize growing chickens to produce anti-LEPR1 and anti-LEPR2 antibodies.Antisera with high anti-LEPR1 and anti-LEPR2 titers were obtained after three immunizations.

leptin receptor;mature peptide;cloning and expression;polyclonal antibody

S831.2

A

1000-4440(2015)05-1105-05

雷明明,吳思謙,李孝偉,等.雞瘦素受體胞外域成熟肽重組蛋白質的表達以及多克隆抗體的制備[J].江蘇農業學報,2015,31 (5):1105-1109.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.05.025

2015-03-05

國家自然科學基金項目(31501946);江蘇省自然科學基金項目(BK20150544)

雷明明(1977-),女,湖北赤壁人,博士,研究方向為動物遺傳與繁殖內分泌。(Tel)025-84390772;(E-mail) mm0529@163.com

施振旦(1964-),(Tel)025-84390956;(E-mail)zdshi@ mail.jaas.ac.cn