APE1在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及其與預后的關系

奚 蕾 應明真 曹向明 沈偉生 王雅杰 劉寶瑞

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APE1在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及其與預后的關系

奚 蕾 應明真 曹向明 沈偉生 王雅杰 劉寶瑞

目的 了解脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況，分析其與患者臨床病理學參數之間的關系，探討APE1蛋白表達與乳腺浸潤性導管癌患者預后的關系。方法 收集2002年1月～2012年12月東南大學附屬江陰醫(yī)院，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院經治的病理確診的乳腺浸潤性導管癌患者組織標本133例。免疫組化法檢測癌組織中APE1蛋白表達情況，并對其與臨床病理參數的相關性進行分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗。結果 133例患者失訪14例，有效隨訪病例為119例。患者中位年齡53歲， APE1蛋白陽性表達者96例(72.18%)，陰性表達者37例(27.82%)。APE1蛋白陽性表達和雌激素受體狀態(tài)、Her2表達以及分子分型相關(P<0.05)，和年齡、腫瘤大小、有無淋巴結轉移及組織學分級無關(P>0.05)。生存分析提示APE1蛋白陰性患者的總生存時間(OS)優(yōu)于陽性表達患者(P<0.05)。結論 乳腺浸潤性導管癌患者APE1蛋白表達與雌激素受體表達、Her2表達、分子分型相關。相比于APE1陰性表達患者，陽性表達提示預后不良。

脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶1 乳腺浸潤性導管癌 預后

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其中浸潤性導管癌是乳腺癌最常見的病理類型。近年來，乳腺癌在我國的發(fā)生率呈逐年上升趨勢。目前乳腺浸潤性導管癌的主要治療手段包括手術、放化療、分子靶向治療和內分泌治療等，有很多研究探討乳腺癌的基因治療，嘗試尋找新的基因作為靶點來提高治療效果。脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE 1)已經被證實存在于多種惡性腫瘤組織中，是脫嘌呤/嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)內切酶的主要活性部分，APE1的表達增高和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后有著密切的關系[1]。有研究證實，乳腺浸潤性導管癌的放化療耐受與腫瘤組織DNA損傷修復過程密切相關，APE1作為關鍵酶參與DNA堿基切除修復途徑(base excision repair BER)，起到了耐受DNA損傷的重要作用[2，3]。因此，針對APE1的分子靶向治療或許能使乳腺浸潤性導管癌放化療耐受成為可能。本研究旨在探討APE1在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況及其與預后的關系，為進一步的研究提供臨床病理依據。

資料與方法

1.一般資料：收集2002年1月～2012年12月東南大學附屬江陰醫(yī)院，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院經治的病理確診的乳腺浸潤性導管癌癌患者組織標本133例，患者年齡31～84歲，中位年齡53歲。所有患者均接受了規(guī)范、系統性的局部和(或)全身治療，包括手術、放療、化療、內分泌治療等。收集和整理全部乳腺癌患者的臨床、病理資料，按照年齡、TNM分期、激素受體狀態(tài)、組織學分級、近似分子分型等指標進行分類統計分析。

2.免疫組織化學方法：133例乳腺癌浸潤性導管癌組織及癌旁正常組織石蠟標本切片后應用En-vision免疫組織化學法檢測APE1的表達情況，鼠抗人APE1單克隆抗體購于Santa Cruz公司(1∶200)，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。

3.結果判定：病理結果判讀采用雙盲法，分別由兩位高年資的病理專科醫(yī)生獨立判定結果，當出現判定結果不一致時需要進行復判，最終確定結果。APE1陽性產物定位于細胞質和(或)細胞核。二級計分法用于陽性細胞結果判定，根據細胞染色陽性率和染色強度結果綜合判斷計分，具體標準如下，細胞染色陽性率：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度計分：陰性為不著色計0分，弱陽性(+)為淡棕黃色計1分，強陽性(+++)為深棕褐色為計3分，強陽性和弱陽性之間為(++)計2分。兩者分值相乘得到總分，5～12分定義為陽性，0～4分為陰性。

4.隨訪：對象為納入研究的133例浸潤性導管癌患者，隨訪時間從病理確診之日開始算起。其中失訪14例，有效隨訪119例。中位隨訪時間為85個月，死亡24例。隨訪截止時間為2014年10月。

5.統計學方法：應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，分類變量相關性分析使用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法評估乳腺癌患者生存率，使用Log-rank檢驗對組間生存率曲線進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.乳腺浸潤性導管癌組織中APE1表達情況：根據二級計分法，納入本研究的133名乳腺浸潤性導管癌患者中，癌組織APE1表達陽性率顯著高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義(P=0.000，表1)。在癌組織APE1表達陽性患者中，7.29%(7/96)為胞質表達陽性為主，其余均主要為胞核表達陽性(圖1)。

表1 乳腺浸潤性導管癌組織與癌旁正常組織APE1蛋白的表達比較

圖1 APE1在乳腺浸潤性導管癌中的表達A.強陽性;B.弱陽性;C.陰性

2.APE1表達與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理學參數之間的相關性：研究結果顯示，乳腺浸潤性導管癌組織APE1的表達和組織雌激素受體(ER)表達、孕激素受體(PR)表達、人類表皮生長因子受體2(Her2)表達以及分子分型相關，與年齡、腫瘤大小、有無淋巴結轉移及組織學分級不相關。ER表達陽性、PR表達陽性或Her2表達陰性的乳腺浸潤性導管癌表達APE1的陽性率高。在分子分型中，Luminal A型浸潤性導管癌患者APE1表達的陽性率高(表2)。

3.APE1表達與預后的關系：119例乳腺浸潤性導管癌患者的中位OS為85個月。其中，APE1陽性患者的中位OS為85個月，APE1陰性患者的中位OS為93個月。經過Log-rank檢驗分析顯示兩組間生存率的差異具有統計學意義(χ2=3.919，P=0.048,圖2)。乳腺浸潤性導管癌APE1表達陰性患者與APE1表達陽性的患者相比具有更好的OS。

表2 乳腺浸潤性導管癌中APE1蛋白的表達與患者臨床病理學參數之間的關系

圖2 APE1表達和生存時間的關系

討 論

APE1基因包括4個內含子和5個外顯子，定位在14號染色體長臂11.2～12區(qū)。研究表明APE1在正常組織中也有表達，且表達的胞內定位存在差異。在多數正常組織中APE1表達定位于胞核，而在一些高增殖率的細胞如淋巴細胞、肝細胞中，APE1可呈現胞質定位[4]。在惡性腫瘤組織中，APE1的表達出現增強，Yang等[5]發(fā)現惡性黑色素瘤細胞系的APE1蛋白水平高出正常黑色素細胞數倍。至于惡性腫瘤細胞中APE1表達的胞內定位，Sheng等[6]發(fā)現卵巢癌組織中常呈現胞核、胞質共同表達，且胞質表達常提示預后不佳。Kim等[7]對結腸癌的APE1表達研究也得到了類似的結果。在本研究中，筆者發(fā)現133例乳腺浸潤性導管癌患者的癌組織有72.18%呈APE1陽性表達，顯著高于癌旁正常組織(3.76%)，但是癌組織中僅有7例是胞核、胞質共表達，其余均為胞核表達。受限于本研究中胞核胞質共表達患者例數較少，且目前APE1表達定位的生物學機制和其相關影響仍不明確，故仍需要更深入的研究去揭示其原因。

本研究發(fā)現APE1在乳腺浸潤性導管癌中的表達與ER、PR、Her2表達及分子分型相關，與年齡、腫瘤大小、是否有淋巴結轉移及組織學分級不相關。筆者推測APE1可能與ER、PR、Her2存在交互作用，參與細胞生物學行為的調節(jié)。就ER而言，Curtis等通過對一株乳腺癌細胞株的研究發(fā)現，APE1可以與ER發(fā)生相互作用，還可以增強ERɑ與含雌激素反應元件(ERE)的DNA的結合，且這些效應均是借助于APE1的氧化還原能力實現的。而APE1與PR、Her2的相互作用方式尚未見諸報道。近年來，腫瘤內部異質性相關的探索成為了腫瘤領域的新熱點[8]。現有研究發(fā)現，同一患者腫瘤病灶內的細胞之間存在差異，這種差異體現在從基因水平到蛋白水平的各個方面，并且這種差異會隨著腫瘤的進展與治療的干預發(fā)生動態(tài)變化。對于乳腺癌而言，Her2蛋白的表達情況已經被證實并非一成不變。由此筆者推測，APE1作為可能與Her2發(fā)生相互作用的蛋白之一，或許同樣存在伴隨腫瘤發(fā)展及治療干預而發(fā)生動態(tài)變化的現象，相信這必將是值得后續(xù)深入研究探討的新課題。

通過生存分析，筆者發(fā)現APE1在乳腺浸潤性導管癌中的表達與預后相關，APE1陽性表達患者的預后差于陰性表達患者。目前的研究已經證實APE1蛋白兼具有AP內切酶活性和轉錄因子激活能力。APE1占AP內切酶活性總體的95%，是DNA堿基切除修復(BER)的限速酶。而BER作為DNA烷化劑及輻射損傷后的主要修復方式，其能力的強弱與腫瘤細胞的放化療耐受相關。因此研究者推斷，APE1的陽性表達可能導致腫瘤細胞放化療耐受的形成，進而影響患者預后。另外，除AP內切酶活性，APE1還具有激活多種轉錄因子的能力。APE1的N端區(qū)域為氧化還原結構域，通過氧化還原可以激活NF-kappaB、ATF、myb、Pax、HIF-α等。有研究證實APE1的氧化還原功能對維持和促進卵巢癌細胞的增殖具有重要作用，運用APE1的低分子抑制劑E3330可以明顯抑制卵巢癌細胞的增殖。因此筆者推測，除了參與DNA修復誘導放化療耐受，APE1的氧化還原活性同樣對促進乳腺浸潤性導管癌細胞增殖具有重要意義，這可能也是APE1陽性表達患者預后不佳的原因之一。

筆者發(fā)現APE1在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性率顯著高于癌旁正常組織。癌組織APE1表達情況和雌孕激素受體的表達、Her2的表達及分子分型相關，提示APE1可能與這些受體及相應信號通路間存在一定的交互作用。筆者同時還發(fā)現APE1陽性表達的乳腺浸潤性導管癌患者的預后比陰性表達者差，推測其可能與APE1誘導的治療耐受相關，這些現象的內在機制仍有待于進一步研究探索，可考慮進一步擴大樣本量來驗證APE1對預后價值。

1 Yang S, Meyskens FL. Apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox effector factor-1(APE/Ref-1): a unique target for the prevention and treatment of human melanoma[J]. Antioxid Redox Signal，2009,11(3):639-650

3 Tell G,Quadrifoglio F,Tiribelli C,etal.The many functions of APE1/Ref-1:not only a DNA repair enzyme[J]. Antioxid Redox Signal， 2009 ,11(3):601-620

4 Luo M, He H, Kelley MR,etal. Redox regulation of DNA repair: implications for human health and cancer therapeutic development[J]. Antioxid Redox Signal， 2010,12(11):1247-1269

5 Yang S, Irani K, Heffron SE,etal. Alterations in the expression of the apurinic/apyrimidinic endonuclease-1/redox factor-1 (APE/Ref-1) in human melanoma and identification of the therapeutic potential of resveratrol as an APE/Ref-1 inhibitor[J]. Mol Cancer Ther， 2005,4(12):1923-1935

6 Sheng Q, Zhang Y, Wang R,etal. Prognostic significance of APE1 cytoplasmic localization in human epithelial ovarian cancer[J]. Medical Oncology，2012，29(2):1265-1271

7 Kim JS, Kim JM, Liang ZL,etal. Prognostic significance of human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE/Ref-1) expression in rectal cancer treated with preoperative radiochemotherapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012,82(1):130-137

9 Burrell RA, McGranahan N, Bartek J,etal. The causes and consequences of genetic heterogeneity in cancer evolution [J]. Nature，2013，501(7467):338-345

(修回日期：2015-03-16)

Expression of APE1 in Breast Invasive Ductal Carcinoma and Its Relationship with Prognosis.

XiLei,YingMingzhen,CaoXiangming,etal.

NanjingMedicalUniversity,Jiangsu210029,China

Objective To understand the expression of APE1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1) in breast invasive ductal carcinoma, analyze the intrinsic relationship between APE1 expression and clinical pathological data, and evaluate the prognosis with Pro APE1. Methods Data from 133 patients diagnosed with breast invasive ductal carcinoma between January 2002 and December 2012 in Jiangyin Hospital Affiliated to Southeast University Medical School and Changhai Hospital of Second Military Medical University were reviewed retrospectively.The expression of Pro APE1 was tested with Immunohistochemistry method, and a correlation analysis with pathological data was made. Survival function was done withKaplan-Meierestimator, the survival distributions withLog-ranktest was and compared. Results We missed 14 patients at the end of study and median age of the rest patients was 53 years old. 96 of them manifested positive Pro APE1 expressing (72.81%) and 37 of them manifested negative APE1 expressing (27.82%).Estrogen receptor positive (P<0.05), HER-2 positive (P<0.05), the molecular typing (P<0.05) were statistically related to Pro APE1, while age (P>0.05), size of tumor (P>0.05), lymph node situation (P>0.05), and historical stage (P>0.05) were not significantly related. Survival function shows that patients with negative Pro APE1 expressing had a longer OS than who had positive expressing (P<0.05). Conclusion Expression of geneAPE1in invasive ductal breast cancer was associated to estrogen receptor, HER-2 and molecular typing. Compared with patients of APE1 negative expressing, patients of APE1 positive expressing suggested a poor prognosis.

Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1); Breast invasive ductal carcinoma; Prognosis

210029 南京醫(yī)科大學 (奚蕾、曹向明、沈偉生);210008 南京醫(yī)科大學附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心(劉寶瑞)；200433 上海，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院腫瘤科(應明真、王雅杰)

劉寶瑞，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，電子信箱：baoruiliu@nju.edu.cn

R73

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.032

2015-01-15)