二苯乙烯苷對低氧肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

張志勇 楊水珍

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二苯乙烯苷對低氧肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

張志勇 楊水珍

目的 探討二苯乙烯苷對低氧肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖的影響及其機制。 方法 SD大鼠PASMCs經低氧及TSG干預24h后， CCK-8檢測細胞增殖及TSG的細胞毒作用，流式細胞儀分析細胞周期，實時定量PCR(RT-PCR)檢測HIF-1α mRNA的表達，酶標儀檢測活性氧(ROS)的產生。結果 二苯乙烯苷能夠抑制低氧PASMCs增殖，阻滯細胞周期于G0/G1～S期，并且實驗濃度的二苯乙烯苷無明顯細胞毒作用，進一步的研究發現二苯乙烯苷能夠抑制HIF-1α mRNA的表達及ROS的產生。結論 二苯乙烯苷可抑制低氧PASMCs增殖，其機制可能與抑制HIF-1α mRNA的表達及ROS產生有關。

低氧 肺動脈平滑肌細胞 二苯乙烯苷 增殖

低氧肺血管結構重構是慢性低氧肺動脈高壓的重要病理生理基礎，其對低氧肺動脈高壓的發生、發展以及預后具有重要意義。低氧肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的異常增殖、遷移以及細胞外基質的異常沉積，可導致肺血管壁變厚、管腔狹窄順應性降低是導致肺血管重構的基礎，低氧肺血管重構的機制目前尚未完全闡明[1,2]。二苯乙烯苷(2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside，TSG)是從中藥何首烏分離的一種主要有效活性成分單體，研究表明TSG可通過調節NO、血管內皮生長因子、MMP-2/9等的表達，抑制血管的內膜增厚及脂質沉積[3,4]。研究還發現，TSG通過調節ERK1/2和NO/cGMP/PKG信號通路，抑制血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖，起到抑制動脈粥樣硬化的作[5,6]。有關TSG在低氧PASMCs增殖中的作用及其機制未見相關研究。本研究通過觀察低氧條件下TSG對大鼠PASMCs增殖影響，從細胞水平探討TSG對低氧肺血管重構的影響及其機制。

材料與方法

1.材料：SD大鼠(150～200g)購自武漢大學實驗動物中心；Ⅰ膠原酶、溴化乙錠(PI)、RNA酶、DCFH-DA購自Sigma公司； CCK-8試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；DMEM/F12培養基、0.25%胰酶、雙抗(青霉素+鏈霉素)、胎牛血清等購自Hyclone公司； HIF-α抗體以及GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司。低氧培養箱購自Coylab公司，熒光酶標儀購自Bio-Tek公司。

2.SD大鼠PASMCs原代培養：采用0.2% Ⅰ膠原酶消化分離PASMCs，細胞傳至第3代時經SM-α-actin免疫細胞化學染色法進行血管平滑肌細胞鑒定(純度>95%)，使用0.25%的胰酶消化PASMCs并以1∶2的比例傳代，4～10代細胞生長穩定用于本研究。

3.實驗分組：①空白對照組;②低氧組;③10μmol/L TSG低氧組;④20μmol/L TSG低氧組;⑤50μmol/L TSG低氧組。常氧組采用95%空氣+5%CO2培養，低氧培養采用低氧培養采用 3%O2、92%N2和 5%CO2培養，當細胞融合度達到70%左右時，采用不含血清的培養基饑餓細胞24h，完全排除血清的影響后，分別進行常氧或低氧培養，其中TSG干預組給予不同濃度的TSG預處理2 h后進行低氧培養。

4.PCR檢測HIF-1α：細胞生長于6孔板，冷PBS洗滌兩次，每孔加入1ml TRIzol提取細胞的總RNA，采用紫外分光光度法測定其含量與純度。 取大約5μl總RNA，使用羅氏反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。PCR擴增后采用GAPDH比較得出標準化值。引物序列為：GAPDH：上游引物：5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下游引物：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；HIF-1α：上游引物：5′-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3′，下游引物：5′-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3′。

5.CCK-8檢測細胞增殖及細胞毒作用：將細胞接種至96孔板中，各組低氧或常氧培養24h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續在培養箱中孵育3h，測定450nm吸光度。

6.細胞周期檢測：細胞接種至6孔板中，各組低氧或常氧培養24h后，胰酶消化并收集細胞，70%乙醇(無水乙醇+PBS)于4℃固定過夜。1500r/min離心5min，1ml的PBS洗細胞2次， 加入485μl PBS重懸細胞、Triton X-100 1μl、1mg/ml RNase 5μl、 1mg/ml溴化乙錠(PI)10μl，4℃避光孵育30min后，通過流式細胞儀分析細胞周期。

7.ROS的檢測：將細胞以100μl，5×103/孔均勻接種于96孔板中，置于培養箱培養，細胞融合度達到70%時，將培養基更換為無血清的培養基饑餓24h，然后采用不同處理因素干預24h，將96孔板中的培養基換為用無血清培養液稀釋終濃度為10μmol/L DCFH-DA，繼續孵育20min之后將培養基吸出，使用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以排除未進入細胞內部的DCFH-DA的影響，最后再次加入磷酸鹽緩沖液(PBS)100μl，置于酶標儀下檢測，激發光波長為485nm，發射光波長為525nm。

結 果

1.TSG能夠抑制低氧PASMCs增殖：低氧刺激24h能夠促進PASMCs增殖 (P<0.05)，TSG(10、20、50μmol/L)抑制低氧誘導的PASMCs增殖具有濃度依賴性(P<0.05，圖1)。

圖1 TSG對低氧PASMCs增殖的影響(n=6)與對照組比較，#P<0.05，與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組比較，*P<0.05

2.TSG對PASMCs存活率無影響：結果顯示，與對照組相比，3種藥物濃度(10、20、50μmol/L)二苯乙烯苷干預24h對PASMCs的存活率差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。

圖2 TSG對PASMCs存活率的影響(n=6)

3.TSG可抑制PASMCs細胞周期于G0/G1期：低氧刺激PASMCs 24h后，處于G0/G1細胞比例減少，S期細胞比例增加，G2/M期細胞比例增加。與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組相比TSG(10、20、50μmol/L)可使G0/G1細胞比例增加，S期細胞比例增加(P<0.05)，對G2/M期細胞比例無明顯影響(P>0.05)。結果表明TSG可阻滯PASMCs細胞周期于G0/G1(圖3)。

圖3 TSG對PASMCs細胞周期的影響(n=6)

4.TSG可抑制HIF-1α mRNA的表達：與對照組相比，低氧刺激PASMCs 24 h后，PASMCs內HIF-1α mRNA的表達增加(P<0.05)。與0μmol/L二本乙烯苷+低氧組相比，TSG(10、20、50μmol/L)可抑制PASMCs內HIF-1α mRNA的表達，且具有濃度依賴性(P<0.05，圖 4)。

圖4 TSG對HIF-1αmRNA的表達的影響(n=6)與對照組比較，#P<0.05;與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組比較，*P<0.05

5.TSG可抑制ROS產生：與對照組相比，低氧刺激PASMCs 24h后，PASMCs內ROS增加(P<0.05)，與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組相比，TSG(10、20、50μmol/L)可抑制PASMCs內ROS產生，且具有濃度依賴性(P<0.05，圖 5)。

圖5 TSG對ROS產生的影響(n=6)與對照組比較，#P<0.05；與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組比較，*P<0.05

討 論

本研究發現， TSG抑制低氧PASMCs增殖，并且實驗濃度的TSG對PASMCs無明顯毒性作用。本研究還表明TSG是通過阻滯細胞周期于G0/G1期抑制低氧PASMCs增殖。進一步的研究表明，TSG抑制PASMCs增殖的機制是通過降低細胞內HIF-1α表達及ROS產生來實現的。這些結果提示，TSG可抑制PASMCs增殖，繼而低氧肺血管重構。

低氧能夠使肺動脈壁各層細胞一系列結構和功能的變化，尤其是中膜層PASMCs的異常增殖在低氧肺血管重構中發揮關鍵作用[7,8]。細胞增殖受細胞周期的嚴格調控，正常生理情況下PASMC處于靜止G0期，肺血管重構時需要處于靜止G0期PASMCs進入和通過細胞周期各階段[9]。本研究表明TSG可抑制PASMCs細胞周期于G0/G1期，從而抑制低氧PASMCs增殖。

HIF-1是低氧條件下廣泛表達于哺乳動物和人體的一種轉錄因子，由一個由調節性亞基HIF-1α和一個構成性亞基HIF-1β組成，HIF-1α決定HIF-1的活性，HIF-1α常氧條件下會經泛素途徑降解而喪失活性，低氧時HIF-1α表達上調，并進入細胞核與HIF-1β結合形成二聚體后調節相關靶基因的轉錄，是細胞適應低氧的核心調控因子，與低氧性肺動脈高壓和肺動脈平滑肌細胞增殖關系密切[10]。HIF-1α可增加細胞內Ca2+濃度的以及調節多種活性介質的表達，進而刺激肺動脈平滑肌細胞增殖[11]。活性氧族(reactive oxygen species, ROS)是起源于線粒體呼吸鏈和電子傳遞鏈的反應分子和自由基，作為細胞內信號分子，參與細胞增殖及凋亡的調控。低氧條件下PASMCs內ROS產生增加，運用抗氧化劑清除ROS，可以抑制低氧PASMCs增殖[12]。研究表明ROS可能是通過調節HIF-1α表達及活性來調控低氧PASMCs增殖[12,13]。另外ROS還可以通過調控ERK1/2信號通路促進低氧PASMCs增殖[14]。本研究發現低氧能夠促進PASMCs 內HIF-1α mRNA的表達及ROS產生，而TSG可抑制PASMCs內HIF-1α mRNA的表達及ROS產生。因此，推測TSG抑制低氧PASMCs增殖機制可能與抑制HIF-1α mRNA的表達及ROS產生有關。TSG有可能對低氧肺血管重構起到抑制作用。

1 Luo C, Yi B, Bai L,etal. Suppression of Akt1 phosphorylation by adenoviral transfer of the PTEN gene inhibits hypoxia-induced proliferation of rat pulmonary arterial mooth muscle cells [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 397(3): 486-492

2 Leggett K, Maylor J, Undem C,etal. Hypoxia-induced migration in pulmonary arterial smooth muscle cells requires calcium-dependent upregulation of aquaporin 1 [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2012, 303(4): L343-L353

3 Zhang W, Xu XL, Wang YQ,etal. Effects of 2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene 2-O-beta-D-glucoside on vascular endothelial dysfunction in atherogenic-diet rats [J]. Planta Med, 2009, 75(11): 1209-1214

4 Zhang W, Wang CH, Li F,etal. 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside suppresses matrix metalloproteinase expression and inflammation in atherosclerotic rats [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2008, 35(3): 310-316

5 Xu XL, Huang YJ, Chen XF,etal. 2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside inhibits proliferation of vascular smooth muscle cells: involvement of NO/cGMP/PKG pathway [J]. Phytother Res, 2012, 26(7): 1068-1074

6 Xu XL, Huang YJ, Wang YQ,etal. 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside inhibits platelet-derived growth factor-induced proliferation of vascular smooth muscle cells by regulating the cell cycle [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2011, 38(5): 307-313

7 Yi B, Cui J, Ning J,etal. Over-expression of PKGIα inhibits hypoxia-induced proliferation, Akt activation, and phenotype modulation of human PASMCs: the role of phenotype modulation of PASMCs in pulmonary vascular remodeling [J]. Gene, 2012, 492(2): 354-360

8 易斌，陸俊羽，白莉，等. 野生型蛋白激酶GIα腺病毒抑制低氧肺動脈平滑肌細胞表型轉換及細胞增殖 [J]. 中華內科雜志, 2010, 49(5): 385-388

9 Fouty BW, Grimison B, Fagan KA,etal. p27(Kip1) is important in modulating pulmonary artery smooth muscle cell proliferation [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2001, 25(5): 652-658

10 李熾觀，戴愛國，嚴鵬科．低氧誘導因子l在低氧致肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用[J]．中國病理生理雜志, 2007，23(7)：1301-1305

11 Aaronson PI. TRPC Channel upregulation in chronically hypoxic pulmonary arteries: the HIF-1 bandwagon gathers steam[J]. Circ Res, 2006, 98(12): 1465-1467

12 Zhao J,Zhou Z,Hu H,etal. The relationships among reative oxtgen species,hypoxic factor lαand cell proliferation in rat pulmonary arterial smooth muscle cells Unner hypoxic [J]. Physiologica Sinica, 2007, 59(3): 319-324

13 Sanders KA, Hoidal JR. The NOX on pulmonary hypertension [J]. Circ Res, 2007, 101(3): 224-226

14 湯娜娜， 劉先勝，徐永健， 等． 活性氧和ERKl/2信號通路在缺氧大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡中的作用[J]. 中國病理生理雜志， 2009， 25(1)：36-41

(修回日期：2015-02-26)

Effect of 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on the Proliferation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells Induced by Hypoxia.

ZhangZhiyong，YangShuizhen.

ZhongxiangPeople′sHospital,Hubei431900,China

Objective To investigate the effects of the 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on the proliferation of PASMCs induced by hypoxia, in orde to search new drugs for the treatment and prevention of hypoxic pulmonary vascular remodeling. Methods 3% O2hypoxia was used to induced the proliferation of PASMCs. After hypoxic and TSG treatment for 24h, cell growth was determined by cell counting kit-8 (CCK-8), cell cycle was analysed by flow cytometry, the mRNA expression of HIF-1α was measured by quantitative real-time PCR, and the reactive oxygen species (ROS) production was determined by the fluorescence microplate reader. Results TSG can block the proliferation of PASMCs through G0/G1to S phase of the cell cycle arrest without cell cytotoxicity. Further experiments showed that TSG blocking the proliferation of PASMCs was associated suppression the mRNA expression of HIF-1α and the production of intracellular ROS in hypoxia- stimulated-PASMCs. Conclusion TSG can inhibit the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells induced by hypoxia through suppression the mRNA expression of HIF-1α and the production of intracellular ROS.

Hypoxia; Pulmonary artery smooth muscle cells; 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside; Proliferation

431900 鐘祥市人民醫院耳鼻喉科(張志勇)，呼吸科(楊水珍)

張志勇，電子信箱：zhangzhiyong2014@163.com

R3

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.043

2015-02-05)