ALK7基因敲除對小鼠心電圖的影響及可能機制

余太輝 胡曉軍 王 鑫 陳 卉 李 樂 唐艷紅

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ALK7基因敲除對小鼠心電圖的影響及可能機制

余太輝 胡曉軍 王 鑫 陳 卉 李 樂 唐艷紅

目的 探討ALK7基因敲除對小鼠心電圖的影響及可能機制。方法 采用8～10周的C57BL/6的野生型小鼠以及ALK7 基因敲除小鼠，使用自制皮下電極連接Powerlab系統記錄9:30～10時小鼠Ⅱ導聯心電圖，使用Labchart軟件直接分析RR間期、HR、PR間期、P波寬度、QRS寬度、QT間期以及QTc，并進一步免疫組化檢測PPAR-γ的表達。結果 與正常野生型小鼠相比，ALK7基因敲除小鼠的RR間期、HR、P波脈寬、PR間期、QRS間期無明顯差異(P>0.05)，然而QT間期明顯延長，QTc明顯增大(P<0.05)。免疫組化檢測ALK7基因敲除小鼠PPAR-γ的陽性表達率顯著減少(P<0.05)。結論 ALK7基因敲除小鼠PPAR-γ的減少可能影響小鼠心室復極變化，出現QT間期的延長。

ALK7 QT延長 復極異常

激活素受體樣激酶7(ALK7)是轉換生長因子-β(TGF-β)超家族的Ⅰ型受體。主要介導GDF-1、GDF-3 、Nodal和Activin B這些配體的生物學效應。ALK7所介導的信號通路在細胞的凋亡與增殖以及組織發育中發揮著重要的作用，并且參與了神經肌肉疾病、內分泌紊亂、肥胖、腫瘤等多種疾病[1～4]。ALK7相關的信號通路對機體有一些重要的調節作用。RGS5基因敲除可引起電壓依賴性的鉀電流的重構，延長了心臟的復極情況，增加了房性以及室性心律失常的易感性等[5, 6]。由此可見一些基因的異常可能影響心臟離子通道異常從而出現心電圖異常及心律失常。ALK7可能通過下游的多個信號通路以及效應因子來調節心臟組織重構和電重構，以及影響了心肌的離子通道的異常，因此可能通過多種效應產生抗心律失常等地一些作用。但ALK7在心血管疾病中的研究，特別是心律失常中的作用及其機制，國內外尚無報道。因此，本實驗擬探索ALK7敲除后對心電圖可能的影響及機制，為深入認識心律失常的分子調控機制提供理論基礎。

材料與方法

1.實驗動物:采用C57BL/6 品系的野生型小鼠、ALK7-/-小鼠(C57BL/6背景)各12只,8～10周。飼養環境符合了國家規定的實驗條件要求。實驗期間小鼠生長良好，飼養和實驗過程均遵循武漢大學人民醫院所屬的動物倫理委員會的規定。

2.主要儀器及試劑:PowerLab數據采集系統及LabChart分析軟件(澳大利亞ADInstruments公司), Olympas BX60 光學顯微鏡，SPOT2型數碼照相機，自制皮下電極, 兔抗鼠PPAR-γ一抗、DAB顯色劑(美國Sigma公司)，羊抗兔二抗、辣根酶鏈霉素(國產國藥試劑公司)。

3.實驗方法:(1)心電圖的記錄:納入的小鼠被分為ALK7基因敲除小鼠組(ALK7)以及野生小鼠組(WT)。所有小鼠在同一環境溫度下，盡量避免噪聲干擾影響，小鼠于早上9時開始記錄，直接用自制皮下電極記錄小鼠清醒狀態下標準Ⅱ導聯心電圖(右上肢連接負電極線，左下肢連接正電極線，左上肢為參比電極)。機器提前預熱后，連接Powerlab系統(所有記錄模式均采用同一濾波)，待心電圖穩定后，記錄小鼠心電圖并做好注釋，保存9:30～10:00的心電圖。(2)心電圖數據分析:使用Labchart軟件對記錄的心電圖信號進行標準化分析獲得下列指標：PR間期、HR、RR間期、P波脈寬、QRS脈寬、QT間期值以及QTc (用Bazett′s公式：QTc=QT/RR1/2)。

4.標本采集及免疫組化分析:實驗結束后，快速取出心臟置于4%的甲醛溶液中固定保存，經過常規脫蠟、脫水以及切片、封片后，將切片經過PPAR-γ一抗以及二抗反應顯色后(即常規免疫組化染色)在光鏡下觀察，PPAR-γ的細胞核被染成了棕褐色可認為陽性反應。隨機在每張玻片上取4個清晰地視野，計算PPAR-γ地陽性表達率：PPAR-γ細胞數占切片上所有的細胞數目計算的百分比。

結 果

1.ALK7基因敲除后心電圖的變化特點:正常野生型小鼠與ALK7-/-小鼠的心電圖測量(圖1)。小鼠的心電圖形態(圖1A)。與正常小鼠相比， ALK7-/-小鼠的P波脈寬、PR間期、QRS間期差異無統計學意義(P>0.05)，然而QT間期明顯的延長，QTc明顯增大(P<0.05,圖1B)。此外，小鼠的心率分布圖(圖2A)。與正常小鼠相比， ALK7-/-小鼠的RR間期及HR差異無統計學意義(圖2中B、C)。

圖1 ALK7基因敲除后小鼠心電圖變化A.小鼠的心電圖形態；B.小鼠的心電圖指標的測量；兩組相比，*P<0.05

圖2 小鼠的心率分布變化、RR間期比較與HR的比較A.小鼠的心率分布變化;B.小鼠RR間期比較;C.小鼠的HR的比較

2.小鼠心肌PPAR-γ免疫組化染色:正常小鼠與ALK7-/-小鼠PPAR-γ細胞核被染成了棕褐色(圖3)。與正常小鼠相比，ALK7-/-小鼠PPAR-γ的表達率是顯著減少的(P<0.05)。WT、ALK7小鼠的PPAR-γ的陽性表達率為34.9%±3.9%和27.9%±2.4%。

圖3 小鼠的PPAR-γ染色(免疫組化染色，×400)

討 論

心房的去極化電位變化產生了P波，而心房從去極化到心室開始去極化的時間為PR間期。心室去極的電位的改變產生了QRS波。心室去極化以及復極化的整個時程為QT間期。QT間期的延長易出現心律失常，然而導致QT的異常的原因很多。在本實驗中，筆者發現 ALK7基因敲除小鼠有更明顯延長的QT間期。此外,免疫組化發現PPAR-γ的表達率顯著減少。ALK7在體內有著重要的調節作用，可能通過下游多個信號通路和效應子調節心臟組織重構和電重構，以及影響相關的心臟離子通道，從而可能有多種效應最終產生抗心律失常的影響。而本研究顯示了ALK7基因敲除后小鼠心肌PPAR-γ的改變可能影響了心室的復極情況出現QT的延長改變。

在本研究中發現ALK7基因敲除小鼠P波、PR間期以及QRS間期、RR間期、HR沒有明顯變化，然而QT間期明顯有延長。說明了ALK7基因敲除后可能影響了心室的復極，對心房的除極和復極以及心室的去極可能沒有影響。實驗中所有小鼠在同一條件下采集心電圖，發現ALK7基因敲除小鼠的QT間期明顯延長，QTc顯著增大。因此認為ALK7小鼠的心室肌發生了復極化的延長。在長QT綜合征患者中因為IKs通道地密度的下降從而使心肌的跨室壁的動作電位發生了不一致地延長，而且明顯的增加了復極離散度，從而產生了EAD，因此極容易誘導發生TDP[7]。心室動作電位的時程(也就是QT間期)發生延長是激動以及折返的條件，最終會引起危及生命的惡性心律失常(比如TDP以及心室顫動等)。有報道β受體阻滯劑可以讓QT間期的改變伴隨著心率的變化而改變，如心率加快，則QT間期會減小，因此能顯著降低復極離散度，這可能是β受體阻滯劑在心血管病中有抗心律失常作用的機制[8]。心血管病的發生率以及病死率的上升與心肌復極的延長有關[9]。QTc(即心率的校正QT間期)是SCD發生心律失常的研究中常用的指標之一。有報道顯示SCD的危險因素有QTc的延長[10]。而遺傳性的QT間期的變異約為35%左右[11]。因此筆者的研究顯示了ALK7基因影響了小鼠心室的復極，可能是小鼠QT延長的一個影響情況，從而為惡性心律失常的研究提供新靶點。

PPARs是在體內調節基因表達的轉錄因子超家族成員中的配體激活受體，在生物體內有著重要的調節作用(如調節體內糖平衡, 影響腫瘤生長，抑制炎性因子生成及炎癥形成，以及保護心血管的效應[12，13]；此外還能影響脂肪細胞分化以及脂肪地生成, 增加對胰島素的敏感度[14])。主要有3個亞型：PPARα、PPAR β/δ、PPARγ。目前認為PPARγ是其中最重要的亞基之一。研究表明PPARγ在炎癥發生、動脈粥樣硬化、胰島素地抵抗和糖代謝調節、腫瘤以及肥胖等疾病中有著重要的調節作用[15～17]。ALK7可以誘導肝癌細胞的凋亡通過了激活Smad2/3和MAPK這兩條信號通路[18]。Zhang等[19]研究顯示，ALK7可以激活誘導胰腺β細胞的凋亡通過兩條獨立的信號通路：PI3K/Akt和Smad2/3信號通路。然而，Lu等[20]的研究發現抑制了磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路可以影響心肌細胞鈉、鉀、鈣等多個的離子通道，延長了細胞動作電位時程，是藥物誘導的長QT綜合征的重要機制。既往有研究證實，MAPK和PI3K/Akt等信號通路不僅參與了心肌肥大、凋亡、纖維化、炎癥等病理過程，還可調控細胞內下游離子通道[21]。心肌細胞動作電位是由氯、鈉、鈣以及鉀等一些地跨膜的離子流所產生的一種復雜的電位變化。如果離子通道蛋白的編碼基因產生了一些改變，則有一部分的離子通道的結構以及功能會有一些改變，而許多的內向以及外向的離子流會出現增加或者出現減少的改變，最終會引起心肌的去極化以及復極化異常，從而會出現一些惡性心律失常。因此鈉離子以及鈣離子地內流和鉀離子地外流地平衡情況可以影響復極的時間。當鈉離子和鈣離子內流發生增多，或者鉀離子的外流減少因此會引起細胞發生復極減慢，心電圖則表現為QT間期的延長。

ALK7/Smad2/3通路可通過下調PPAR-γ以及C/EBPα而減少脂肪分解，導致脂肪形成[22]。心臟中PPAR-γ細胞異常可能影響心臟鉀通道及鈉通道的改變。有研究顯示心臟特異性過表達PPAR-γ小鼠心肌細胞鉀通道表達降低，動作電位時程延長，產生嚴重的心肌復極異常并且自發了惡性危及生命的室性心律失常[23]。可見PPAR-γ在生物體內的調節可能引起心臟的復極異常。然而本研究中發現ALK7基因敲除小鼠復極異常，心肌PPAR-γ的表達明顯減少。PPAR-γ的激動劑有利于修復在心肌地缺氧復氧模型中產生的損傷。有研究顯示PPAR-γ激動劑有利于減少糖尿病相關的心肌障礙，影響鉀電流[24]。此外，有報道PPAR-γ激動劑對大鼠心臟鈉通道有影響。影響鉀鈉離子通道上離子流的微小變化都會出現動作電位的復極異常。因此，在本研究認為ALK7基因敲除小鼠可能通過PPAR-γ蛋白的變化影響了鉀鈉通道的改變從而出現心室的復極異常。

在本研究中通過記錄ALK7-/-小鼠及正常野生型小鼠的心電圖以及PPAR-γ細胞免疫組化染色，從而發現ALK7-/-小鼠有著顯著延長的QT間期，且QTc也是明顯的增大。此外，ALK7-/-小鼠PPAR-γ細胞在心室的陽性率顯著減少。考慮ALK基因敲除小鼠PPAR-γ蛋白的改變可能影響小鼠心室復極變化，出現QT間期的延長。QT間期的改變和惡性心律失常的發生有些聯系，從而為惡性心律失常的相關基因研究提供一些研究證據。

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(修回日期：2015-05-13)

ECG Characteristics in the ALK7-Null Mice and the Possible Mechanisms.

YuTaihui,HuXiaojun,WangXin,etal.

DepartmentofCardiology,HospitalsofTraditionalChineseandWesternMedicineinHubeiProvince,Hubei4300060,China

Objective To elucidate the effects of activin receptor-like kinase 7(ALK7) in ECG, and possible mechanism.Methods Male wildtype and ALK7-/-mice (C57BL/6 background) aged 8 to 10 weeks were used in the studies. ECG (Lead Ⅱ) was continuously recorded in consciously moving mice by homemade subcutaneous electrode from 9:30 to 10.The P-wave duration and, RR interval, PR interval and QRS duration,QT interval and QTc were measured with the Labchart software.In addition, expression of PPAR-γ were analysed by immunohistochemistry.Results There was no significant difference in P-wave duration,RR interval,PR interval and QRS duration between wildtype and ALK7-/-mice.But QT interval and QTc of ALK7-/-mice were prolonged obviously compared with wildtype mice.In addition,positive expression rate of PPAR-γ in ALK7-/-mice was significantly reduced compared with wildtype mice.Conclusion The abnormal ventricular repolarization in ALK7-/-mice may be due to reduce in expression of PPAR-γ, and results in prolonged obviously of QT interval.

ALK7-/-mice；QT interval；Abnormal repolarization

國家自然科學基金資助項目(81370282)

430060 武漢，湖北省中西醫結合醫院心血管內科(余太輝、胡曉軍、王鑫、陳卉、李樂)；430063 武漢大學人民醫院心血管內科(唐艷紅)

唐艷紅，主任醫師，碩士生導師，電子信箱: wurmheart@vip.163.com

R541

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.008

2015-04-22)