CD40L對單純皰疹病毒2型DNA疫苗的免疫增強作用研究

胡如西 陶 薇 傅 婷 何卓晶 賈 嵐 洪 艷 陳 勇

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CD40L對單純皰疹病毒2型DNA疫苗的免疫增強作用研究

胡如西 陶 薇 傅 婷 何卓晶 賈 嵐 洪 艷 陳 勇

目的 研究重組質粒pcDNA3-Kan/CD40L輔佐HSV-2 DNA疫苗增強小鼠體液免疫和細胞免疫的作用效果，探討其作為HSV-2 DNA疫苗佐劑的潛力。方法 (1)構建鼠CD40L基因的重組真核表達質粒pcDNA3-Kan/CD40L。(2)體外細胞實驗：檢測重組質粒pCD40L刺激小鼠外周血淋巴細胞增殖情況和脾細胞分泌IFN-γ的能力。(3)體內動物實驗：48只雌性BALB/c小鼠隨機分為4個免疫組pK組、pgD組、pcCD40L+pgD組和pK+pgD組。小鼠后腿肌內注射，共免疫2次，間隔3周。末次免疫3周后，每組隨機取4只小鼠進行致死劑量攻毒實驗驗證疫苗的保護作用。 ELISA檢測小鼠血清抗HSV-2 IgG抗體水平和趨化因子RANTES；流式細胞術檢測全血中CD4+和CD8+T細胞百分率以及分泌IFN-γ和IL-4的T細胞的百分率；MTS法檢測小鼠脾臟T細胞的增殖能力。結果 (1)體外實驗結果：重組質粒pcDNA3-Kan/CD40L對小鼠外周血淋巴細胞的增殖能力和刺激脾細胞分泌IFN-γ的能力均顯著大于空質粒pcDNA3-Kan(P<0.05)。(2)體內實驗結果：小鼠血清抗HSV-2 IgG水平、趨化因子RANTES、脾淋巴細胞刺激指數和外周血CD4+T細胞數和分泌IFN-γ的Th1細胞數均高于其他免疫組(P<0.05)。pcDNA3-Kan/CD40L+pgD組預防小鼠感染HSV-2效果好于其他免疫組。結論 (1)重組質粒pcDNA3-Kan/CD40L能夠誘導外周血淋巴細胞增殖并刺激脾細胞分泌IFN-γ具有作為疫苗佐劑的潛力。(2)pcDNA3-Kan/CD40L可以輔助HSV-2 DNA疫苗誘導BALB/c小鼠產生特異性抗HSV-2的體液免疫和細胞免疫，具備作為HSV -2 DNA疫苗免疫佐劑的能力。

CD40配體(CD40L) 單純皰疹病毒2型(HSV-2) 疫苗佐劑

單純皰疹病毒(HSV)的感染是人類比較常見的感染性疾病之一，包括HSV-1和HSV-2型[1]。目前，市面上還沒有能夠有效控制HSV的特效藥，研制有效的疫苗是控制HSV感染的關鍵。隨著分子生物學技術的發展，多肽疫苗和DNA疫苗的研制成為近年來研究的熱點，其中DNA疫苗因具有誘導全面免疫應答的高效性而備受青睞，本研究涉及的HSV-2核酸疫苗是由筆者所在課題組研究開發，動物實驗結果顯示該疫苗對于小鼠具有很好的免疫原性和保護效力[2]。為了尋求更高的體液免疫和細胞免疫效果，DNA疫苗可以利用各種免疫佐劑與之相配合[3]。

CD40L屬于腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)，是一種39kDa的Ⅱ型膜糖蛋白，主要活化T細胞表面的協同刺激分子，特別是CD4+T細胞，其分布廣泛，主要表達于活化T細胞表面，特別是活化CD4+T細胞[4～6]。CD40L在機體免疫應答方面扮演著重要角色，其可直接刺激B細胞和樹突狀細胞(DCs)以增強T細胞反應和抗體產生；能夠增強活化B細胞分化，促進免疫生發中心形成；也能夠激活DCs啟動細胞毒性CD8+T細胞反應[7]；還能夠與受體CD40相互作用。這些免疫刺激功能使得CD40L具有作為疫苗佐劑的潛力。

本研究構建了含有鼠CD40L基因的重組真核質粒pCD40L，通過體外細胞實驗研究CD40L是否具有核酸疫苗免疫佐劑的潛能，再經體內動物實驗研究CD40L輔佐HSV-2 DNA疫苗增強小鼠體液免疫和細胞免疫的能力，考察其作為核酸疫苗免疫佐劑的可能性。

材料與方法

1.質粒、菌種和病毒：質粒載體pK(pcDNA3-kan質粒)由本實驗室改建了pcDNA3質粒， 將Kan抗性基因代替了Amp基因，得到了真核表達質粒載體pcDNA3-kan(pK質粒)、重組質粒pgD(含單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白gD基因的卡那霉素抗性真核表達質粒pgD，為本實驗室構建的HSV-2 DNA疫苗)、HSV-2病毒(LD50=10-1.88/0.1ml)由本實驗室培養保存。DH5α感受態細胞購自康為世紀公司。

2.實驗動物：清潔級BALB/c 小鼠，體重18～22g，購自浙江省實驗動物中心。

3.實驗試劑：限制性內切酶EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ和T4DNA連接酶購自Thermo公司；Tap PCR Master Mix Kit、UltraSYBR Mixture和Rneasy Mini Kit購自Qiagen公司，第1鏈cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司；單溶液細胞增殖檢測試劑盒(MTS)購自Promega公司；100bp DNA 標志物、DM10000 DNA 標志物、高純度質粒小提試劑盒、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自康為世紀公司。離子霉素(iono mycin)，佛波酯(phorbol 12-myristatc 13-acetate，PMA)，刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)皆購自Sigma公司；紅細胞裂解液、流式抗體FITC -CD4、PE -CD8a、FITC-IFN-γ、PE-IL-4和流式固定破膜試劑盒購自美國BD公司；Mouse RANTES (受激活調節正常T細胞表達和分泌因子，Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor)試劑盒為eBioscience公司產品;小鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；胎牛血清FBS、RPMI1640培養基購自GIBCO BRL公司；辣根過氧化物酶(HRP) 酶標羊抗鼠抗體購自鼎國生物生物技術公司；其他試劑為國產或進口分析純試劑。

4.方法：(1) pCD40L質粒的構建：利用RT-PCR方法從BALB/c 小鼠脾細胞中獲得CD40L基因并將其克隆至pK質粒中, 經酶切、測序驗證得到pCD40L質粒[8]。(2)細胞實驗-SYBR green QPCR：無菌條件下制備小鼠脾細胞懸液，按濃度梯度分別加入空質粒pK和重組質粒pCD40L。37℃，5%CO2條件下培養3天。用Rneasy Mini Kit提取總RNA, 以Oligod(T)n為引物，反轉錄生成cDNA。本實驗選用β-actin作為內參。IFN-γ的上游引物：5′-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGA-3′，下游引物：5′-CTGGCTCTGCAGGATTTTCAT-3′(GeneBank: NC-000076.6)；內參β-actin的上游引物：5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′(GeneBank: NM-007393.3)。取1μl上述反應合成的cDNA為模板進行real-time PCR的擴增。其擴增條件為95℃10min；預變性95℃ 15s，退火60℃ 1min，循環40個周期。所得數據采用Roto-Gene QPCR自帶軟件進行分析，mRNA相對含量分析采用2-ΔΔCt法[ΔΔCT=(CT,Target- CT,Actin)處理- (CT,Target- CT,Actin)對照]。(3)細胞實驗-MTS比色法：無菌條件下采集小鼠眼球靜脈血，用小鼠淋巴細胞分離液試劑盒分離淋巴細胞(按試劑盒說明書操作)。然后加入含10%FBS的RPMI1640培養基重懸細胞，按每孔5×105細胞接種于96孔細胞板，按濃度梯度分別加入空質粒pK和重組質粒pCD40L。37℃，5%CO2條件下培養3天，加入40μl MTS溶液，繼續培養4h，用酶標儀檢測490nm下的吸光度(A)值。細胞增殖率用刺激指數(stimulation index ，SI)表示，SI=(實驗組A值-空白組A值)/(陰性對照組A值-空白組A值)。(4)動物實驗-動物免疫和攻毒實驗：48只雌性BALB/c小鼠隨機分為以下4組：①空載體pK組(100微克/只)；②空載體pK+重組質粒pgD組[(50微克+100微克)/只]；③重組質粒 pgD組+重組質粒p CD40L組[(100微克+50微克)]/只；④重組質粒 pgD組(100微克/只)，小鼠后腿肌內注射100微升/只，隔21天加強免疫1次，劑量相同。免疫第42天，每組隨機選取4只小鼠進行攻毒實驗。腹腔注射200微升/只20×LD50HSV-2病毒懸液，每天觀察并記錄小鼠死亡數，觀察14天。(5)動物實驗-免疫小鼠樣本的收集：每次免疫后14天收集小鼠尾靜脈血200μl分離血清，所有樣本于-20℃保存。末次免疫后21天剖殺小鼠，無菌取小鼠脾臟，經200目尼龍紗布網濾過制備單個細胞懸液備用。(6)動物實驗-間接ELISA法檢測小鼠血清中IgG抗體：采用滅活HSV-2病毒包被酶聯反應板，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，按常規ELISA法檢測血清中IgG抗體A值。被檢血清A450 /陰性對照A450≥2.1 為陽性，否則為陰性。(7)動物實驗-流式細胞儀檢測外周血中CD4+和CD8+T細胞百分率：經2次加強免疫的4組BALB/c小鼠最后1次免疫的14天后眼眶取血，肝素鈉抗凝處理收集的血液，分別與FITC標記的單抗CD4+和PE標記的單抗CD8+避光孵育30min，PBS 洗滌3次后，流式細胞儀分析CD4+和CD8+百分率。實驗結果使用Cellquest軟件進行分析。(8)動物實驗-MTS比色法檢測小鼠脾臟T淋巴細胞增殖能力：小鼠加強免疫21天后各組小鼠按常規方法制備脾臟細胞，調節細胞濃度至5×106個/毫升，細胞100微升/孔。將細胞培養板分為3部分：分別為特異性抗原刺激孔-50μg/ml滅活單純皰疹病毒；非特異性抗原刺激孔-10μg/ml Con A；對照孔-RPMI 1640完全培養液。將細胞培養板置于37℃，5%CO2，細胞培養箱中培養68h，加細胞活力檢測試劑40微升/孔繼續培養4h，酶標儀測A值。計算刺激指數SI=(實驗組A值-空白組A值)/(陰性對照組A值-空白組A值)。(9)動物實驗-小鼠血清中趨化因子RANTES的檢測：經2次加強免疫的4組BALB/c 小鼠最后1次免疫的14天后眼眶取血，分離血清，樣本保存于-20℃。按ELISA 試劑盒說明檢測RANTES的含量。(10)動物實驗-流式細胞儀檢測外周血分泌IFN-γ和IL-4的T的表達水平：加強免疫35天后的小鼠肝素抗凝全血加入RPMI1640完全培養液(含20ng/ml佛波酯、1μmol/L離子霉素和0.7μl/ml莫能霉素)刺激培養4h；100μl培養液加2ml紅細胞裂解液室溫裂解10min后離心；染色緩沖液洗滌后離心；加固定透化液室溫避光孵育20min，BD緩沖液洗滌后離心；加鼠流式抗體IFN-γ和IL-4室溫避光染色30min，BD緩沖液洗滌后離心；加PBS500微升/管重懸細胞，流式細胞儀分析IFN-γ、IL-4的表達水平。實驗結果使用Cellquest軟件進行分析。

結 果

1.pCD40L重組質粒的構建：CD40L片段大小約為723bp，與預期的783bp相符。重組質粒pCD40L經EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后，顯示為5.4 kb和783bp左右的片段(圖1)。該質粒經DNA測序后，插入片段與GeneBank BC119225.1的鼠CD40L序列中l～783堿基序列完全相符。結果表明CD40L已成功地克隆到真核表達載體pK質粒中。

圖1 pcDNA3-Kan/CD40L質粒酶切鑒定結果1.DM10 000 DNA標志物；2.pcDNA-Kan經EcoRⅠ和XhoⅠ 雙酶切；3.pcDNA3-Kan/CD40L經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切；4.CD40L(約783bp)；5.100bp DNA Ladder

2.細胞實驗:(1)小鼠脾臟IFN-γ mRNA水平:不同濃度pCD40L(1、5、10、25、50、75和100μg/ml)在誘導脾細胞表達IFN-γ的能力與空質粒相比有統計學意義(P<0.05，圖2)。(2)淋巴細胞增殖能力：當重組質粒pCD40L濃度在1、5、10、25μg/ml時，體外誘導大鼠外周,血淋巴細胞增殖能力(SI)與空質粒pK無明顯差異。當濃度達到50、75μg/ml時，重組質粒組的SI值顯著增加(P<0.05)，表明外周血淋巴細胞明顯增殖，而空質粒的SI值并無明顯變化。當濃度達到100μg/ml時，重組質粒組的SI值顯著下降(圖3)。此外不同濃度的空質粒體外誘導大鼠外周血淋巴細胞增殖能力差異無統計學意義。

圖2 小鼠脾臟IFN-γ mRNA水平

圖3 淋巴細胞增殖能力

3.動物實驗：(1)小鼠血清中抗HSV-2抗體的ELISA檢測結果：初次免疫14天后，pCD40L+pgD組、pK+pgD組和pgD組產生的IgG的水平顯著大于pK組(P<0.05),pCD40L+pgD組刺激產生的IgG的水平明顯大于其他各組刺激產生的IgG的水平(P<0.05)。35天后除pK組外，其他3組的IgG均有明顯的上升，并且各組間差異有統計學意義，特別是pCD40L+pgD組的IgG上升的最為明顯(P<0.01)，高于初次免疫14天后的特異性IgG A值的2倍之多。初免42天后，各組的IgG與第35天無明顯變化，跟第2次接種14天差別不大(表1)。(2)動物實驗-小鼠外周血中CD4+和CD8+T細胞百分率：初次免疫42天后的全血刺激培養液的流式檢測結果顯示，pCD40L+pgD組的CD4+細胞的百分率略高于不加佐劑組，與pK組相比差異有統計學意義(P<0.05)，但其他兩組間兩兩t檢驗，差異無統計學意義；加pCD40L+pgD組的CD8+細胞百分率略高于pK組 (P<0.05)；其他3組間兩兩比較，差異無統計學意義(圖4)。(3)小鼠T細胞增殖能力：加pCD40L佐劑組的ConA刺激指數和滅活單純皰疹病毒刺激指數均高于其他各組，差異有統計學意義(P<0.05)；其他3組間兩兩比較，差異均有統計學意義(圖5)。(4)小鼠血清中RANTES含量：ELISA 法分析經2次免疫后小鼠血清中RANTES 的產生。pK組、pK+pgD組、pCD40L+pgD組、pgD組RANTES含量分別為10.034、201.633、676.633和170.204pg/ml。結果顯示經2次免疫后，pCD40L+pgD組的RANTES含量最高，含量達到了676.633pg/ml，明顯高于其他3組，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。(5)小鼠外周血分泌IFN-γ和IL-4 T的表達水平：pCD40L+pgD組的IFN-γ的表達水平顯著高于其他各組(P<0.05); 其他3組兩兩比較，差異均有統計學意義。加pCD40L+pgD組的IL-4 的表達水平均低于其他各組(P<0.05)；其他3組兩兩比較，差異無統計學意義(圖6)。(6)疫苗對小鼠的保護性：HSV-2病毒攻毒14天后，空質粒組小鼠全部死亡；pCD40L+pgD組存活3只，保護率為75%；pK+pgD組和pgD組的保護率僅為50%(圖7)。

表1 小鼠血清抗HSV-2IgG吸光度值

圖4 小鼠外周血中CD4+和CD8+T細胞百分率

圖5 小鼠T細胞增殖能力

圖6 外周血分泌IFN-γ和IL-4 T的表達水平

圖7 疫苗對小鼠的保護性

討 論

CD40L是一種有著良好應用前景的新型免疫刺激劑。最近研究發現， CD40L的重組質粒作為病毒DNA疫苗的免疫佐劑在人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)等感染的相關臨床疾病中均能夠增強DNA疫苗細胞免疫或體液免疫應答[9～11]。Sin等[12]做了類似研究，證明CD40L有作為疫苗佐劑的能力。但是，真核表達質粒pcDNA3為Amp抗性質粒，現在有研究發現如果終產品中有殘留Amp，可能會對青霉素過敏的接種者不安全。本研究中，筆者采用了本實驗室pK質粒。筆者的研究也獲得了與其他研究者相似的研究結果。在體外實驗中，筆者發現CD40L重組質粒具有誘導細胞免疫的能力。本研究利用CD40L重組質粒直接作用小鼠外周血淋巴細胞和脾臟淋巴細胞。SYBRgreen QPCR實驗結果顯示重組質粒pCD40L組小鼠脾臟IFN-γ mRNA水平顯著增高，這說明CD40L能促進小鼠脾臟T細胞向Th1型細胞分化。在淋巴細胞增殖實驗中，重組質粒pCD40L能促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，說明它對于淋巴細胞的免疫功能具有一定的積極影響。當重組質粒pCD40L濃度為50μg/ml和75μg/ml時，它對外周血淋巴細胞的促分裂作用比低濃度的作用顯著增高；當其濃度為100μg/ml時，外周血淋巴細胞增殖能力反而下降，這說明重組質粒pCD40L促外周血淋巴細胞分裂活性在一定的濃度范圍內才發揮作用。在本研究中，重組質粒pCD40L刺激外周血淋巴細胞增殖的最佳濃度為75μg/ml。

在動物實驗中，重組質粒pCD40L能夠輔佐HSV-2 DNA疫苗刺激小鼠產生抗HSV-2的細胞免疫和體液免疫。在第2次免疫后第14天，pCD40L和HSV-2 DNA疫苗組可以誘導機體產生較高A值的IgG抗體，其A值是其他各組的2倍之多(P<0.05)，誘導機體產生強烈的體液免疫。流式細胞儀檢測結果顯示，pCD40L和HSV-2 DNA疫苗組CD4+T細胞和分泌IFN-γ的Th1細胞百分率高于其他組(P<0.05)；在小鼠脾臟T淋巴細胞增殖結果顯示，pCD40L的特異性抗原和非特異性抗原的刺激指數都顯著高于其他3組(P<0.05)，以上結果均說明重組質粒pCD40L能夠輔佐HSV-2 DNA疫苗刺激小鼠產生抗HSV-2的細胞免疫。此外，pCD40L和HSV-2 DNA疫苗組能刺激產生更高量的趨化因子RANTES。趨化因子RANTES是CD40L調節巨噬細胞和DC細胞表達產生。趨化因子RANTES的高表達，可募集未激活的CD4+記憶T細胞、刺激CD4+T和CD8+T的活化，參與不成熟DCs細胞的募集、促進Th1型細胞因子IFN-γ的產生，趨化炎癥細胞到達炎癥部位，發揮多種作用參與機體對病毒的免疫[13]。在動物保護性實驗中，由于與本實驗室曾經所用的病毒效價(LD50)不一樣，實驗結果不盡相同，但是都說明了HSV-2 DNA疫苗pgD質粒及其佐劑pCD40L質粒對感染單純皰疹病毒后的小鼠的存活率有一定的提高。

總之，本研究構建的質粒pCD40L能夠輔佐HSV-2 DNA疫苗刺激小鼠產生特異性的細胞免疫和體液免疫，特別是其在提高細胞免疫方面的能力，具有作為疫苗佐劑的潛力。在后續研究中，我們將圍繞CD40L做進一步的探索，為研發HSV-2 的治療性疫苗提供可靠的依據。

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(修回日期：2015-07-21)

Plasmid CD40L Enhances Immune Response of HSV-2 DNA Vaccine.

HuRuxi,TaoWei,FuTing,etal.

WenzhouMedicalUniversitySchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,Zhejiang325035,China

Objective To detect HSV-2-specific humoral immunological response and cellular immunological response in BALB/c mice which were induced by plasmid CD40L-adjuvanted HSV-2 DNA vaccine. Methods ①The murine CD40L gene transcript was inserted into the pcDNA3 vector to obtain the recombinant plasmid pcDNA3-Kan/CD40L. ②In vitro study: MTS colorimetric method was employed in the detection of the rat peripheral blood lymphocytes proliferation and SYBRgreen qPCR assay was used to test the IFN-γ secretion ability of spleen cells. ③In vivo study: Forty eight female BALB/c mice were randomly divided into four groups: pKan, pgD, pCD40L+pgD and pKan+pgD, and inoculated through intramuscular immunization at the weeks 0 and 3. After 6 weeks the protection given to the mice was assayed by a fatal dose of HSV-2. The humoral immunological response and the cellular immunological response were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), MTS colorimetric assay and flow cytometry (FCM). Results ①The ability of stimulation lymphocytes proliferation of rat PBMC and IFN-γ level in spleen cells of cDNA3-Kan/CD40L group were significantly better than that of pK group (P<0.05).②The level of anti-HSV-2 IgG, RANTES, stimulation index (SI), CD4+and IFN-γ in pCD40L+pgD group were significantly higher than anther groups. Furthermore，mice of pCD40L+pgD group were prophylactically protected from challenge with a high dose of HSV-2. Conclusion ①The potential of pcDNA3-Kan/CD40L could be used as an adjuvant in vaccines.②The potential of pCD40L-adjuvantd HSV-2 DNA vaccine could induce systemic humoral immune responses and cellular immune responses intramuscular vaccinated mice.

CD40 ligand (CD40L); Herpes simplex virus type 2 (HSV-2); Vaccine adjuvant

浙江省自然科學基金資助項目(LY12H19009)

325035 溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院(胡如西、陳勇)；310013 杭州，浙江省醫學科學院(陶薇、傅婷、何卓晶、賈嵐、洪艷)

洪艷，陳勇，電子信箱: hongy1008@163.com

R3

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.009

2015-07-07)