金黃色葡萄球菌生物被膜形成與生物被膜相關基因的調查研究

賀建忠+陳宏偉+王貴強+王永+白萬勝+郭新懷+王勇

摘要：以分離自全國9個省（市、區）的102株奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌為研究對象，應用剛果紅法（congo red agar，CRA）和半定量黏附試驗（semi quantitative adherence assay，SQAA）檢測了生物被膜形成情況，應用PCR法檢測了8種生物被膜相關基因分布情況。結果發現，攜帶7種基因的菌株占有絕對優勢，其次是攜帶6種基因的菌株;最流行的基因組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高達66.7%;北京、內蒙古、寧夏、甘肅、廣西、上海等地生物被膜形成與生物被膜相關基因的分布高度一致。以上研究結果表明，多種生物被膜相關基因組合是奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌流行的主要特點，生物被膜形成和生物被膜相關基因的分布在大多數地區表現高度一致性，rbf和SigB基因可能在金黃色葡萄球菌生物被膜形成和乳房感染過程中發揮著重要作用。本研究結果將為金黃色葡萄球菌性乳房炎的防治提供一定的科學參考。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌;生物被膜;奶牛乳房炎;生物被膜相關基因

中圖分類號： S852.61+1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0055-04

收稿日期：2014-04-15

基金項目：國家自然科學基金地區基金（編號：31260628）;塔里木畜牧科技兵團重點實驗室開放課題（編號：HS201204）。

作者簡介：賀建忠（1977—），男，內蒙古五原人，碩士，副教授，研究方向為臨床獸醫學。E-mail：talimuhe_he@126.com。

通信作者：白萬勝，副教授，研究方向為臨床獸醫學。E-mail：bwsdky@126.com。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是奶牛乳房炎（bovine mastitis）的主要病原之一，防治困難，常給乳業造成巨大的經濟損失。SA易形成生物被膜（biofilm，BF），BF對抗生素治療以及宿主免疫均可產生較強的抵抗力，因此被認為是乳房炎發病機制中一個重要毒力因子[1-2]。生物被膜形成受多種基因調控，這些調控基因統稱為生物被膜相關基因（biofilm-associated genes，BAGs）。例如icaA和icaD的表達可促進BF的形成[3]，icaR通過抑制ica的轉錄而抑制BF的形成。此外，rbf、bap、sarA、SigB和SasG等均可直接或間接調節BF的形成。

對于BF形成及BAGs分布多有報道，但對于BF形成和BAGs關系的研究卻鮮有報道。為此，本研究以全國9個省（區）102株SA為研究對象，進行了BF及BAGs分布情況調查，旨在分析地域性差異，為SA性發乳房炎的進一步防治提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株背景 102株SA均分離自亞臨床性乳房炎乳樣。菌株為本實驗室鑒定、保存。鑒定程序包括溶血性觀察、革蘭氏染色、觸酶試驗、凝固酶試驗、生化鑒定及SA特異性基因nuc的PCR檢測等。鑒定后的菌株在含20%甘油的 Luria-Bertani（LB）肉湯中于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

菌株分離自全國9個省（市、區），共102株，其中河北省37株、北京市14株、內蒙古自治區7株、甘肅省7株、寧夏自治區11株、新疆維吾爾自治區7株、河南省6株、上海市5株、廣西壯族自治區7株。

1.1.2 主要試劑與儀器 胰蛋白胨大豆胨肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、腦心侵液（BHI）瓊脂/肉湯購自北京奧博星生物技術有限責任公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，剛果紅購自天津科密歐試劑有限公司，蔗糖購自天津市致遠化學試劑有限公司，磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）分別購自國藥集團化學試劑有限公司和北京化學試劑有限公司，瓊脂糖、Taq mix和Marker購自北京艾德萊生物科技有限公司，引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成。

臺式微量高速離心機（TG-16S）：四川蜀科儀器有限公司;氣浴恒溫振蕩器（THZ-82A）：金壇市醫療儀器廠;數顯電熱培養箱（HPX-9052MBE）：上海博訊實業有限公司醫療設備廠;電泳儀（DYY-6D）：北京市六一儀器廠;凝膠成像分析系統（Tanon-4100）：上海天能科技有限公司;DNM-9602酶標分析儀：北京普朗新技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BF檢測 剛果紅法（congo red agar，CRA）：將36 g蔗糖和0.8 g剛果紅溶于1 L腦心浸液培養基（BHI）中，121 ℃高壓滅菌15 min，傾倒平板（CRA平板），備用。挑取復蘇后的單菌落接種于CRA平板，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后觀察菌落形態。凡粗糙、干燥、水晶樣的黑色菌落均為生物被膜陽性株（biofilm-positive strains）;而紅色的光滑型菌落為生物被膜陰性株（biofim-negative strains）。

半定量黏附試驗（semi-quantitative assay，SQAA）：挑取復蘇后的單菌落接種于BHI肉湯，37 ℃恒溫振蕩器中過夜培養。取過夜培養的BHI肉湯，用含20 g/L葡萄糖的BHI肉湯按1 ∶ 100的比例稀釋。用微量移液器吸取200 μL稀釋后的菌液轉移到96孔板。每組設3個重復，以BHI肉湯作陰性對照。將96孔板置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，將96孔板中的液體移除，用PBS液清洗2遍，以除去剩余的浮游菌。倒置自然干燥后，加入100 μL 95%乙醇固定 5 min，再用100 μL 1%結晶紫染色5 min。染色后，用滅菌蒸餾水清洗3遍，以除去剩余的染液。自然干燥后，用酶標儀測定570 nm下的D值。凡D570 nm≥0.1的為生物被膜陽性株，D570 nm<0.1的為生物被膜陰性株。D值取3組的平均值。

1.2.2 BAGs檢測 按照索萊寶細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提供的步驟進行。提取的DNA模板保存于-20 ℃冰箱中備用。8個生物被膜形成相關基因（icaA、icaD、icaR、sigB、sarA、bap、rbf、sasG）采用PCR法進行檢測，引物序列、退火溫度、產物大小及參考文獻見表1。PCR反應體系（20 μL）分別含有1 μL上下游引物、7 μL ddH2O、10 μL Taq Mix和1 μL DNA模板。PCR反應條件如下：95 ℃ 預變性8 min;95 ℃ 變性30 s，相應的退火溫度（表1）退火30 s，72 ℃ 延伸10 min，30個循環。含0.5 μg/mL溴乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，PCR產物在凝膠成像系統中觀察。

表1 引物設計

基因 引物序列（5′→3′） Tm

（℃） 目的片段長度

（bp） 參考文獻

icaA CCTAACTAACGAAAGGTAG;AAGATATAGCGATAAGTGC 56 1 315 [4]

icaD ATGGTCAAGCCCAGACAGG;CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA 56 198 [5]

bap CCCTATATCGAAGGTGTAGAATTG;GCTGTTGAAGTTAATACTGTACCTGC 60 971 [6]

icaR CAATAATCTAATACGCCTGAG;AGTAGCGAATACACTTCATCT 54 246 [5]

sarA TTTTTTTACGTTGTTGTGCATTAACA;CATTTAAACTACAAACAACCACAAGTTG 56 135 [7]

rbf ACGCGTTGCCAAGATGGCATAGTCTT;AGCCTAATTCCGCAAACCAATCGCTA 62 164 [8]

SasG CGGATCCGGTGTGACAATCAGTATGAC;CGGAATTCGCGACATTTATGTGGATACAC 55 937 [9]

2 結果與分析

2.1 BAGs的分布情況

BF相關基因廣泛分布于乳房炎性SA分離株中，所有的102株SA至少攜帶1種BAG。相比較而言，同時存在7種基因的菌株最多，所有菌種陽性菌株Total（t）、CRA檢測BF陽性菌株CRA（+）、SQAA檢測BF陽性菌株SQAA（+）、CRA和SQAA檢測均為陽性的菌株CRA（+）& SQAA（+）比例分別為66.7%、725%、65.3%、63.6%。其次，同時攜帶6種基因的菌株較多，且SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）比例最高。所有被測菌株均未擴增出bap基因，因此沒有同時存在8種被測基因的菌株。

本研究共檢測了8種BF相關基因，出現的組合形式共20種，其中比例最高的是7種基因的組合，最少的僅有1種基因存在。最流行的組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高達66.7%;SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-rbf-SasG的比例分別是6.9%、3.9%、2.9%、29%、2.0%、2.0%;其余組合均為1.0%，即組合形式僅出現1次（表2）。

表2 BF相關基因組合的流行情況

相關基因組合

SigB icaR icaA icaD sarA rbf SasG

比例

（%）

+ + + + + + + 66.7

+ + + - + + + 6.9

+ - + + + + + 3.9

+ + - + + + + 2.9

+ - - - - - - 2.9

- + + + + + + 2.0

+ - + - - + + 2.0

- + - - - - - 1.0

- - - - - + + 1.0

+ - - - - + - 1.0

+ - - + - + - 1.0

+ - - + - + + 1.0

+ + + - - + - 1.0

+ - - + + + - 1.0

- - + + - + + 1.0

+ - + - + + + 1.0

+ + + - + + - 1.0

- + + + - + - 1.0

+ + + + + - + 1.0

+ + + + + + - 1.0

2.2 BF的檢測結果

由圖2可以看出，河北省BF陽性株BAGs的比例均低于菌株總數。寧夏和甘肅BF陽性株BAGs的比例均高于或等于菌株總數，而且SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）全部為100%，說明BAGs和SQAA+存在完全的一致性。除了北京市的icaD基因和內蒙古的icaR基因，這2個地區BAGs在SQAA（+） 和 CRA（+）& SQAA（+）中均高于或等于菌種總

數中的比例。新疆除SigB和rbf2個基因外，其他的變化趨勢與河北相似。

由圖3可以看出，河南BAGs在CRA（+）和菌株總數中的比例全部相同，BAGs在SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）中的比例也全部相同。廣西和上海BAGs在SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）中均為100%，BAGs分布與BF形成表現出很好的一致性。就全國范圍總體而言，CRA（+）中BAGs的比例均高于菌種總數和其他BF陽性株，說明CRA（+）在全國范圍內與BAGs的符合度較高。

3 討論

SA是引發臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎最主要的病原之一[10]，可降低牛奶質量，造成嚴重的經濟損失，是影響奶業發展的主要問題[11]。SA具有多種毒力因子，其中BF形成被認為是引發慢性感染的主要原因[12]。BF的形成與BAGs的分布密不可分，本研究結果顯示，BF陽性株均存在較高比例的BAGs，其中同時存在7種和6種被測基因的占有絕對優勢。在20種流行組合中，最流行的組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高達66.7%，其次是SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG（6.9%）、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG（3.9%）、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG（29%）、SigB（2.9%）、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG（2.0%）和SigB-icaA-rbf-SasG（2.0%）。以上結果表明，多種BAGs組合是我國乳房炎性SA流行的重要特征之一，同時這些基因可能在BF形成過程發揮重要作用。icaA和icaD共同表達增加N-乙酰葡糖胺轉移酶活性，促進BF的形成[13]，而icaR可通過限制ica表達抑制BF的形成。SigB、rbf與SasG的表達能夠促進BF的形成[14-16]，而SarA的表達能夠限制BF的形成[17]，迄今，盡管bap基因表達能夠促進SA在乳房內的黏附和BF的形成[18]，但是在本研究所有被測菌株中均未擴增出該基因，說明該基因在我國乳房炎性金黃色葡萄球菌BF形成和發病機制中居于次要地位。

不同地區BF形成與BAGs分布的一致性存在一定差別。廣西、上海、北京、內蒙古、寧夏和甘肅7個省（市、區） BAGs分

布BF形成保持高度一致性，而河北、河南和新疆BAGs分布和BF形成的一致性相對降低，提示在BF形成和乳房炎發病機制中發揮重要作用的可能是本研究未檢測的某些基因。具體到基因種類，rbf和SigB分布最廣，在大多數省份均為100%，提示這2個基因在SA性乳房炎發病機制中可能發揮著重要作用。Rbf可抑制icaR的表達，能夠間接激活icaADBC的表達，促進BF的形成，但是并不依賴于ica通路[16]。sigB能夠促進不同毒力因子表達的調控，促進BF形成的同時能夠調節抗生素耐藥性[19]。因此，通過rbf和SigB基因功能調節入手，研究我國乳房炎性SA的致病機制，可能是一種新的思路。

綜上所述，多種BAGs組合流行是我國乳房炎性SA流行的主要趨勢，各地區金黃色葡萄球菌BF形成和BAGs分布存在一定的差異。

參考文獻：

[1]Brady R A，Omay G A，Leid J G，et al. Resolution of staphylococcus aureus biofilm infection using vaccination and antibiotic treatment[J]. Infection and Immunity，2011，79（4）：1797-1803.

[2]Vergara-Irigaray M，Valle J，Merino N，et al. Relevant role of fibronectin-binding proteins in staphylococcus aureus biofilm-associated foreign-body infections[J]. Infection and Immunity，2009，77（9）：3978-3991.

[3]Manuela O F. Invasive potential of biofilm-forming staphylococci bovine subclinical mastitis isolates[J]. J Vet Sci，2011，12（1）：95-97.

[4]Vasudevan P，Nair M K，Annamalai T，et al. Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation[J]. Veterinary Microbiology，2003，92（1/2）：179-185.

[5]Chaieb K，Mahdouani K，Bakhrouf A. Detection of icaA and icaD loci by polymerase chain reaction and biofilm formation by Staphylococcus epidermidis isolated from dialysate and needles in a dialysis unit[J]. Journal of Hospital Infection，2005，61（3）：225-230.

[6]Cucarella C，Tormo M A，Knecht E，et al. Expression of the biofilm-associated protein interferes with host protein receptors of Staphylococcus aureus and alters the infective process[J]. Infection and Immunity，2002，70（6）：3180-3186.

[7]Rode T M，Langsrud S，Holck A，et al. Different patterns of biofilm formation in Staphylococcus aureus under food-related stress conditions[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，116（3）：372-383.

[8]Cue D，Lei M G，Luong T T，et al. Rbf promotes biofilm formation by Staphylococcus aureus via repression of icaR，a negative regulator of icaADBC[J]. Journal of Bacteriology，2009，191（20）：6363-6373.

[9]李 麗，楊宏軍，劉代成，等. 奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成及相關基因分析[J]. 中國農業科學，2011，44（1）：160-166.

[10]Demon D，Ludwig C，Breyne K，et al. The intramammary efficacy of first generation cephalosporins against Staphylococcus aureus mastitis in mice[J]. Veterinary Microbiology，2012，160（1/2）：141-150.

[11]Graber H U，Pfister S，Burgener P，et al. Bovine Staphylococcus aureus：diagnostic properties of specific media[J]. Research in Veterinary Science，2013，95（1）：38-44.

[12]Valle J，Solano C，Garcia B，et al. Biofilm switch and immune response determinants at early stages of infection[J]. Trends in Microbiology，2013，21（8）：364-371.

[13]Atshan S S，Shamsudin M N，Karunanidhi A，et al. Quantitative PCR analysis of genes expressed during biofilm development of methicillin resistant Staphylococcus aureus （MRSA）[J]. Infection Genetics and Evolution，2013，18：106-112.

[14]Mitchell G，Brouillette E，Séguin D L，et al. A role for sigma factor B in the emergence of Staphylococcus aureus small-colony variants and elevated biofilm production resulting from an exposure to aminoglycosides[J]. Microbial Pathogenesis，2010，48（1）：18-27.

[15]Geoghegan J A，Corrigan R M，Gruszka D T，et al. Role of surface protein SasG in biofilm formation by Staphylococcus aureus[J]. Journal of Bacteriology，2010，192（21）：5663-5673.

[16]Lim Y，Jana M，Luong T T，et al. Control of glucose-and NaCl-induced biofilm formation by rbf in Staphylococcus aureus[J]. Journal of Bacteriology，2004，186（3）：722-729.

[17]Reyes D，Andrey D O，Monod A，et al. Coordinated regulation by AgrA，SarA，and SarR to control agr expression in Staphylococcus aureus[J]. Journal of Bacteriology，2011，193（21）：6020-6031.

[18]Latasa C，Solano C，Penadés J R，et al. Biofilm-associated proteins[J]. Comptes Rendus Biologies，2006，329（11）：849-857.

[19]Pfrtnera H，Burian M S，Michalik S，et al. Activation of the alternative sigma factor SigB of Staphylococcus aureus following internalization by epithelial cells：an in vivo proteomics perspective[J]. International Journal of Medical Microbiology，2014，304（2）：177-187.