鴨大腸桿菌與沙門氏菌混合感染的分離鑒定及藥敏試驗

李迎曉+安輝+焦鳳超+陳宏智

摘要：利用細菌分離、生化鑒定及藥敏試驗方法，從河南省信陽市鴨場病死鴨腦、脾臟中分離出鴨大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌各1株。藥敏試驗結果顯示，分離菌對頭孢曲松、黏桿菌素、左旋氧氟沙星、恩諾沙星、新霉素高度敏感;對磺胺甲基異惡唑、潔霉素、強力霉素耐藥。

關鍵詞：鴨;大腸桿菌;沙門氏菌;分離鑒定;藥敏試驗;人工感染試驗

中圖分類號： S858.32 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0224-02

收稿日期：2014-06-04

基金項目：河南省科技攻關項目（編號：122102110022）。

作者簡介：李迎曉（1981—），女，河南洛陽人，碩士，講師，從事病原微生物與免疫學研究。E-mail：liyingxiao81@163.com。

鴨大腸桿菌病是由某些致病性大腸桿菌引起的較為常見的細菌性疾病。各種年齡的鴨均可感染鴨大腸桿菌病，雛鴨最易感，2～6周齡多發(fā)，發(fā)病率和死亡率較高，在商品肉鴨中死亡率可高達50%左右，成年鴨和種鴨則出現零星死亡現象[1]。鴨沙門氏菌病別稱鴨副傷寒，是由鼠傷寒等幾種沙門氏菌所引起的疾病總稱，屬一種急性和慢性傳染病，主要引起雛鴨發(fā)病，常呈地方性流行，并可引起大批死亡[2]。2014年3月，養(yǎng)殖戶送檢的表現為神經癥狀、腹瀉、脾臟壞死的10日齡病死雛鴨，經細菌分離培養(yǎng)、生化試驗和致病性試驗確定為鴨大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌混合感染，本研究將對混合感染的菌株進行鑒定，并對其進行藥敏性試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌標準菌株ATCC25922、腸桿菌科生化鑒定管、藥敏片、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、伊紅美藍瓊脂、三糖鐵瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自浙江省杭州市天和微生物試劑有限公司;鮮血平板為在營養(yǎng)瓊脂基礎上加入5%無菌羊血配制而成;試驗所用的7日齡健康非免疫櫻桃谷肉雛鴨購自河南華英集團公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 尸體剖檢 對病死鴨進行尸體剖檢，記錄眼觀病理變化，無菌采集腦、脾臟、肝臟、心臟病料，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 在無菌條件下取病死雛鴨腦、脾臟病料并接種于鮮血平板和麥康凱平板上，再分別置于普通培養(yǎng)箱和燭缸中，37 ℃培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色和瑞氏染色后鏡檢;然后挑取單菌落接種于伊紅美藍瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面上，37 ℃培養(yǎng)20 h，革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.3 生化試驗 按腸桿菌科細菌生化鑒定管使用說明進行。

1.2.4 藥敏試驗 采用紙片擴散法（K-B法）進行[3]，以大腸桿菌標準菌株ATCC25922 為質控菌，取適量被檢細菌的培養(yǎng)物，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂表面，待菌液吸收后，貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察結果，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑判定細菌對藥物的敏感性。

1.2.5 人工感染試驗 挑取分離菌株純培養(yǎng)物并接種于普通肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，染色鏡檢后4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∥疵庖哌^疫苗的7日齡健康櫻桃谷鴨作為試驗對象（每組10羽，共30羽）。試驗組接種0.5 mL/羽分離菌純培養(yǎng)物，含菌數約為1.0億CFU，第3組為對照組，接種等量的生理鹽水。接種后觀察10 d，記錄發(fā)病和死亡情況。

2 結果與分析

2.1 病理剖檢結果

病死雛鴨外觀消瘦，被毛粗亂，主要表現為脾臟腫大、壞死，肝臟腫大、瘀血，部分病死雛鴨有輕微的肝周炎，腦膜充血。卵黃吸收不良，十二指腸、直腸黏膜充血。

2.2 細菌分離鑒定

從病死鴨腦和脾臟中分離出2株細菌，其中1株在麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形、隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大小菌落;三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基底層變黃，斜面變黃，同時產酸、產氣;在伊紅美藍瓊脂上形成黑色、具有金屬光澤的菌落;生化鑒定分離菌可引起葡萄糖產酸、產氣;靛基質、甲基紅、動力、產氣、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、木膠糖陽性，硫化氫、枸櫞酸鹽、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、尿素、側金花醇陰性，對照《腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊》判定為大腸桿菌。 另1株在麥康凱瓊脂上形成無色、圓形、隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大小菌落;三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基底層變黑，斜面變紅，同時產酸、產氣;在伊紅美藍瓊脂上形成無色菌落;生化鑒定分離菌可引起葡萄糖產酸、產氣;賴氨酸、鳥氨酸、硫化氫、枸櫞酸鹽、山梨醇、木膠糖、動力和產氣陽性，靛基質、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、尿素、側金花醇、甲基紅、棉子糖陰性，對照《腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊》判定為鼠傷寒沙門氏菌。

2.3 藥敏試驗

采用K-B法進行，具體結果見表1。

表1 藥敏試驗結果

藥物名稱

抑菌圈直徑（mm）

鴨沙門氏菌 鴨大腸桿菌

磺胺甲基異惡唑 6 5

潔霉素 6 0

黏桿菌素 25 17

左旋氧氟沙星 27 23

丁胺卡那 24 18

氟苯尼考 12 10

頭孢曲松 20 21

慶大霉素 18 14

恩諾沙星 22 24

新霉素 18 19

強力霉素 9 0

注：抑菌圈直徑10 mm 以下為耐藥（不敏感）;10～15 mm 為中度敏感;15 mm 以上為高度敏感。

2.4 人工感染試驗結果

大腸桿菌試驗組接種24 h后，開始出現精神沉郁、行動遲緩癥狀，72～120 h全部發(fā)病、部分病鴨死亡。剖檢死鴨有或輕或重的纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎;沙門氏菌試驗組接種24 h后，開始出現精神沉郁、腹瀉癥狀，72 h后全部發(fā)病，部分出現死亡，剖檢死鴨可見肝脾腫大、壞死及腦膜充血。對死亡鴨進行細菌分離、染色鏡檢，結果與前期指標符合。

3 結論與討論

藥敏試驗結果顯示，分離菌對頭孢曲松、黏桿菌素、左旋氧氟沙星、恩諾沙星和新霉素高度敏感;對氟苯尼考中敏;對磺胺甲基異惡唑、潔霉素和強力霉素耐藥。這和當地養(yǎng)殖戶喜歡使用氟苯尼考+強力霉素或復方磺胺的用藥方案有關。而分離菌雖然對左旋氧氟沙星和恩諾沙星高度敏感，但由于鴨群在使用氟喹諾酮類藥物以后，若劑量掌握不好，容易發(fā)生光敏作用而導致鴨群發(fā)生“喙畸形或變形”，因此養(yǎng)殖戶使用這些藥物比較謹慎。可見，定期開展常見病原菌的耐藥性監(jiān)測對于指導養(yǎng)殖戶科學用藥具有重要意義。

鴨大腸桿菌病和鴨沙門氏菌病是雛鴨常發(fā)病，具有較高的發(fā)病率和死亡率。信陽市是河南省主要的水禽集散地，近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖品種的復雜化，以及種源病原凈化不徹底等因素，當地的養(yǎng)殖環(huán)境特別是水體環(huán)境逐漸惡化，再加上飼養(yǎng)管理不規(guī)范、抗菌藥物的不合理使用，導致鴨大腸桿菌病、鴨沙門氏菌病和鴨疫里氏桿菌病等疾病的發(fā)生呈現常態(tài)化、復雜化。而一些新發(fā)傳染病如鴨脾壞死癥在實驗室接診的病例中出現的比例不斷擴大，更增加了疾病診斷和防控的難度[4]。綜合以上因素，雛鴨大腸桿菌病、沙門氏菌病等傳染病的防治有賴于潔凈的種源、規(guī)范的飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)管理措施、血清型對應的免疫接種程序以及規(guī)范的藥物使用制度。

參考文獻：

[1]蔣新華，張文波，熊莉娟，等. 一株鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥分析[J]. 中國家禽，2012，34（5）：20-22.

[2]陳伯倫. 鴨病[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2008.

[3]桂炳東，孫 敬，徐建民.細菌藥物敏感性試驗測定手冊[M]. 南昌：江西科學技術出版社，2001.

[4]丁孟建，陳 績，趙青劍，等. 雛鴨沙門氏菌病病原分離鑒定及耐藥性檢測[J]. 中國家禽，2013，35（11）：45-46.endprint