苦瓜藤黃酮的富集工藝及抗氧化性能

王剛+王東+饒力群

摘要：研究AB-8大孔樹脂富集苦瓜藤總黃酮工藝，并對(duì)苦瓜藤黃酮的抗氧化性能進(jìn)行初步研究。AB-8大孔樹脂富集苦瓜藤黃酮的工藝為：上樣液pH值為5，解析液為70%乙醇，解析液pH值為9，用量為3倍樹脂柱，洗脫速率為3 BV/h。富集后可使其含量提高40多倍，總黃酮純度達(dá)到35%左右，該方法流程安全，工藝簡(jiǎn)單。由此可見，苦瓜藤黃酮粗提物對(duì)豬油有一定的抗氧化效果，苦瓜藤黃酮粗提物與維生素C和維生素E有顯著的協(xié)同抗氧化作用。

關(guān)鍵詞：苦瓜藤;黃酮;大孔樹脂;富集;抗氧化

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0277-02

收稿日期：2014-11-18

作者簡(jiǎn)介：王 剛（1988—），男，湖南桃江人，碩士研究生，主要研究方向農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與利用。E-mail：wghunau@163.com。

通信作者：饒力群，博士，教授，主要研究方向植物天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。E-mail：raoliqun@163.com。

苦瓜（Momordica charantia L.）是葫蘆科苦瓜屬植物，在我國(guó)廣泛栽培。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，苦瓜性苦、寒，用于中暑發(fā)熱、煩熱口渴、痢疾、眼痛、胃氣痛等。近年來，已從苦瓜中分離到多種有效成分，發(fā)現(xiàn)其具有清熱、利尿、降血糖、抗病毒、抗腫瘤以及防癌抗癌等作用[1]。黃酮類化合物泛指2個(gè)苯環(huán)通過三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一類化合物，是植物光合作用產(chǎn)生的一大類化合物。黃酮類化合物常作為降血糖、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥物給予應(yīng)用，同時(shí)也是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑。本試驗(yàn)主要研究了大孔樹脂富集苦瓜藤黃酮的工藝以及苦瓜藤中黃酮提取物抗氧化能力，以期為進(jìn)一步開發(fā)苦瓜藤的提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜藤干粉：將本地新鮮苦瓜藤洗凈、晾干后于電熱鼓風(fēng)干燥箱50 ℃下烘干，然后用粉碎機(jī)打成粉末，過80～120目篩，混勻，于干燥的環(huán)境中備用。樹脂：101、102、（上海試劑廠生產(chǎn)）;D103、D201（南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)）;AB-8、HPD100（河北滄州寶恩化工有限公司生產(chǎn)）;蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物藥品檢定所;其他試劑均為分析純。UV-9600型紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司生產(chǎn);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司生產(chǎn);G258型電子天平：德國(guó)梅特勒公司生產(chǎn);l0l-AB電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn);YD-1008微型超聲波清洗機(jī)：江蘇省常州市佑達(dá)超聲波設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 苦瓜藤總黃酮的提取 采用60%乙醇加熱回流提取，提取時(shí)間45 min、提取溫度70 ℃、液料比為15 mL ∶ 1 g、提取液pH值為9、回流2次。混合2次提取液，過濾，石油醚萃取后，濃縮得黃酮粗提物。

1.2.2 苦瓜藤黃酮含量的測(cè)定 采用NaNO3-Al（NO3）3比色法[2]。

1.2.3 上樣液液制備 取20.00 g苦瓜藤黃酮提取物，200 mL 30%乙醇，超聲提取30 min，過濾，再次加200 mL 30%乙醇，超聲提取20 min，過濾，混均2次提取液，將液體pH值調(diào)至5，備用。

1.2.4 樹脂的篩選

1.2.4.1 樹脂預(yù)處理 所用樹脂均先用95%乙醇浸泡過夜，使樹脂顆粒充分溶漲，然后用95%乙醇洗滌至洗出液清澈為止，再用超純水洗至無醇味，然后用2%～3%鹽酸溶液浸泡2～3 h，然后用同樣濃度的5倍樹脂體積的鹽酸淋洗，再用超純水洗，直到洗液至中性。用5%NaOH與以上相同的方法浸泡2～4 h，并用6～7倍樹脂體積的堿液淋洗，最后用超純水沖洗，至洗液pH值為中性，備用。

1.2.4.2 樹脂篩選 量取經(jīng)過預(yù)處理的6種樹脂，每份 10 mL，設(shè)3個(gè)重復(fù)，于250 mL的三角瓶中，加入上樣液 30 mL 振蕩處理，頻率為100 r/min，振蕩24 h后，過濾，測(cè)定濾液中黃酮含量，計(jì)算吸附率。將過濾后的樹脂，風(fēng)干，在風(fēng)干后樹脂中加入70%乙醇各30 mL于振蕩器上振蕩，頻率為100 r/min，振蕩4 h測(cè)定解析液中黃酮的含量，計(jì)算各樹脂靜態(tài)解析率。

吸附率=吸附量/上樣量=（C前V前-C后V后）/C前V前×100%;

解析率=解析量/吸附量=C解V解/（C前V前-C后V后）×100%。

式中：C前、C后分別為吸附前、后溶液黃酮濃度;V前、V后為上樣液液吸附前、后溶液的體積。本試驗(yàn)中視吸附前、后液體積不變。C解、V解為解析后苦瓜藤總黃酮濃度與液體體積。

1.2.5 AB-8樹脂富集因素的影響 參照王剛等的方法[3]，測(cè)定AB-8樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，考察上樣pH值、解析液、解析液用量、解析液pH值、及其流速對(duì)富集的影響。

1.2.6 烘箱法測(cè)定過氧化值（POV） 將新鮮豬板油切成小塊，濕法熬煉，濾除殘?jiān)鋮s密封后置于冰箱冷藏備用。添加物用30%乙醇溶解，分別加入不同濃度或組合抗氧化劑于50 g新鮮豬油中，置于水浴鍋中緩慢加熱至50 ℃融化油樣，并在升溫過程中不時(shí)攪拌使之成均相。將添加抗氧化劑后的豬油于恒溫箱中（70±1） ℃強(qiáng)化保存，每隔12 h攪拌1次，并交換在烘箱中的位置，以確保環(huán)境條件相同。每24 h測(cè)定POV值。每次取樣后充分?jǐn)嚢枵駬u，以充分混入空氣。測(cè)定POV值[4-6]，計(jì)算不同抗氧化劑及其組合的抗氧化性。

X=（V1-V2）×C×1 000/m。

式中：X為樣品的過氧化值（meq/kg）;V1為樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）;V2為試劑空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）;C為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）;m為樣品質(zhì)量（g）。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的篩選

用靜態(tài)法來測(cè)定樹脂吸附與解析性能，綜合各項(xiàng)指標(biāo)來確定試驗(yàn)所用樹脂。由表1可見，101吸附能力最好，但是也不很容易解析下來，大孔樹脂 AB-8在所給的試驗(yàn)條件下對(duì)苦瓜藤總黃酮吸附量較大，且能夠把絕大部分解析下來，其他考察樹脂綜合指標(biāo)也不理想，因而確定用AB-8樹脂富集苦瓜藤總黃酮。

表1 不同吸附樹脂對(duì)苦瓜藤總黃酮吸附率和解析率

樹脂型號(hào) 樹脂極性 吸附率

（%） 解析率

（%）

101 非極性 89 64

102 非極性 71 74

D103 非極性 72 53

D201 非極性 79 68

AB-8 弱極性 85 90

HPD100 非極性 58 91

2.2 AB-8樹脂富集苦瓜藤總黃酮的工藝及效果

2.2.1 AB-8樹脂對(duì)苦瓜藤總黃酮的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 樹脂吸附苦瓜藤總黃酮速率是衡量樹脂富集苦黃酮的重要指標(biāo)之一。從圖1可以看出，上樣液加入樹脂后，吸附速度較快，吸附率迅速上升，2 h后，基本上可達(dá)到平衡。

2.2.2 上樣液pH值對(duì)吸附的影響 上樣液pH值影響苦瓜藤黃酮在大孔樹脂上的吸附，是通過溶液pH值改變黃酮在溶液中存在的形式而實(shí)現(xiàn)。在堿性條件下黃酮以鹽形式存在，不利于吸附，高堿條件下黃酮也會(huì)遭到破壞。因此，本試驗(yàn)著重考察了酸性條件下的吸附情況，結(jié)果顯示pH值為5時(shí)，吸附效果最好。

2.2.3 解析液對(duì)解析的影響 試驗(yàn)考察了解析液的用量、乙醇濃度與解析液pH值對(duì)解析的影響，結(jié)果表明，隨著解析液用量增加，解吸率提高，當(dāng)解析液用量在3 BV以上時(shí)，解吸率提高不明顯，從經(jīng)濟(jì)性考慮，選擇3 BV進(jìn)行解析。乙醇濃度對(duì)解析也有較大影響，隨著乙醇濃度升高，苦瓜藤總黃酮解析率增加，但乙醇濃度到達(dá)70%以上后，解析率上升緩慢，考慮到乙醇的用量，確定解析液乙醇濃度70%為佳。解析液pH值對(duì)苦瓜藤總黃酮解析的影響較大，在弱堿條件下，黃酮解析率隨著堿度增大而增大，但pH值為10時(shí)，解析率下降，可能是由于黃酮在較高堿性條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，如與溶液中的鐵等金屬離子發(fā)生絡(luò)合，或其他化學(xué)成分性質(zhì)的變化，導(dǎo)致苦瓜藤總黃酮解析率下降，當(dāng)解析液pH值為9時(shí)最佳。

2.2.4 解析液流速對(duì)解析的影響 基于循環(huán)式設(shè)備考慮，上樣濃度做到盡可能大，使樹脂可迅速飽和，縮短吸附時(shí)間，未考察上樣液流速。從圖2可以看出，解析液流速在3、4 BV/h時(shí)，AB-8樹脂富集苦瓜藤總黃酮純度可達(dá)到35%左右，綜合生產(chǎn)效率，若用于工業(yè)生產(chǎn)，建議采取3 BV/h流速進(jìn)行苦瓜藤總黃酮的富集。

2.3 苦瓜藤黃酮粗提取物抗氧化性能

2.3.1 苦瓜藤黃酮粗提取物抗氧化效 由圖3可見，苦瓜藤黃酮提取物對(duì)豬油的氧化有明顯的抑制作用。隨著提取物濃度的增加，抗氧化性初期表現(xiàn)為逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，當(dāng)添加量為0.1%時(shí)達(dá)到最佳抗氧化效果，但還是不如0.02%BHT和0.05%維生素C的效果;當(dāng)提取物添加量繼續(xù)增大時(shí)，抗氧化效果反而有所下降。

2.3.2 苦瓜藤黃酮與其他抗氧化劑的協(xié)同抗氧化作用 由圖4可見，苦瓜藤黃酮提取物與維生素C、維生素E有明顯的協(xié)同效應(yīng)，苦瓜藤黃酮提取物與維生素C按1 ∶ 1復(fù)配、與維生素C、維生素E以1 ∶ 1 ∶ 1比例復(fù)配，對(duì)豬油有非常顯著的協(xié)同抗氧化作用，2種復(fù)配組合抗氧化效果相近，但3者復(fù)配效果還要略好于二者復(fù)配。總之， 抗氧化劑協(xié)同作用效果優(yōu)

于所有單一抗氧化劑處理組。其協(xié)同抗氧化活性大大強(qiáng)于同濃度的提取物，也強(qiáng)于添加比例最佳的0.1%黃酮粗提物。并明顯好于單獨(dú)添加0.02%BHT，稍好于0.05%維生素C。

3 結(jié)論

AB-8吸附樹脂對(duì)苦瓜藤總黃酮有很高的吸附性能和解析率，適用于苦瓜藤總黃酮的富集研究，其富集工藝為：上樣液pH值為5，解析液為70%乙醇，解析液pH值為9，用量為3倍樹脂柱，洗脫速率為3 BV/h。苦瓜藤總黃酮經(jīng)AB-8樹脂富集后，黃酮含量提高了40倍左右，黃酮純度可達(dá)到35%左右，說明大孔吸附樹脂對(duì)苦瓜藤總黃酮的富集是可行的，而且流程安全，工藝較簡(jiǎn)單。試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦瓜藤黃酮粗提物對(duì)豬油有一定的抗氧化效果，其中添加0.1%黃酮粗提物的抗氧化效果最佳。苦瓜藤黃酮粗提物與維生素C和維生素E有顯著的協(xié)同抗氧化效應(yīng)，強(qiáng)于單獨(dú)添加黃酮粗提物和維生素C、BHT。

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