植物開放式組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展及發(fā)展前景

摘要：從抑菌劑種類和濃度、蔗糖濃度、有機(jī)物質(zhì)、培養(yǎng)容器、接種條件及培養(yǎng)方式幾個(gè)方面綜述了植物開放式組織培養(yǎng)的發(fā)展與應(yīng)用，并展望了未來發(fā)展的前景。

關(guān)鍵詞：開放式組織培養(yǎng);植物;抑菌劑;培養(yǎng)容器;有機(jī)物質(zhì);接種條件;培養(yǎng)方式

中圖分類號： Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0011-03

收稿日期：2014-05-17

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（編號：13KJB180004）;江蘇開放大學(xué)、江蘇城市職業(yè)學(xué)院“十二五”規(guī)劃項(xiàng)目（編號：12SEW-Y-026）。

作者簡介：曾云英（1976—），女，重慶長壽人，碩士，副教授，主要從事園林植物與觀賞園藝、生態(tài)規(guī)劃方面的研究。E-mail：yuniny@sina.com。

自1902年德國著名植物生理學(xué)家和植物學(xué)家Haberlandt提出了植物細(xì)胞具有全能性的理論之后，植物組織培養(yǎng)作為一種高效的植物快速繁殖技術(shù)顯示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值。時(shí)至今日，植物組織培養(yǎng)技術(shù)以其特有的優(yōu)勢在理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用上不斷被深入改進(jìn)和創(chuàng)新，各種植物幾乎都有進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道。植物組織培養(yǎng)技術(shù)要求嚴(yán)格的無菌環(huán)境，需要特定的儀器設(shè)備（超凈工作臺、高壓滅菌鍋和人工氣候箱），因而生產(chǎn)成本很高，且繁雜的操作程序?qū)ぷ魅藛T的技術(shù)都有一定的要求，這大大地限制了該技術(shù)的應(yīng)用和推廣。為了降低成本，簡化工作程序，學(xué)者們一直在努力探索一種能高品質(zhì)和規(guī)模化生產(chǎn)試管苗的新技術(shù)。隨著研究的不斷深入，“開放式組織培養(yǎng)”理念被提出。植物開放式組織培養(yǎng)是指在抑菌劑的作用下，使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺，用普通容器代替組培瓶，在自然、開放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)[1]。開放式組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)相比，有成本低、操作環(huán)節(jié)簡單等優(yōu)點(diǎn)，因而受到研究者們的喜愛，更是規(guī)模化生產(chǎn)試管苗的必然趨勢;但由于整個(gè)操作過程沒有在無菌的條件下進(jìn)行，防止污染也成了植物開放式組織培養(yǎng)研究中的主要任務(wù)。崔剛等采用中醫(yī)理論，從多種植物中提取了具有殺菌、抗菌的活性物質(zhì)，成功研制出了具有廣譜性殺菌能力的抗菌劑，并利用這一技術(shù)成功地建立了葡萄外植體培養(yǎng)體系，同時(shí)還開展了多種植物開放式組織培養(yǎng)研究工作[2]。隨后研究者們在多種植物上進(jìn)行了開放式組織培養(yǎng)的嘗試并取得了成功，主要有香蕉[3-4]、魔芋[5-6]、荸薺[7]、馬鈴薯[8]、梅花[9]、紅豆杉[10]、白菜[11]等植物，已建立開放式組織培養(yǎng)技術(shù)體系的植物種類見表1。研究主要集中在抑菌劑種類的選擇和濃度的確定、培養(yǎng)方式以及培養(yǎng)基中有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)碳這幾方面。本文從抑菌劑、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基成分等方面綜述了植物開放式組織培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景，以期為該技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用及推廣提供一定的理論支撐。

表1 植物開放式組織培養(yǎng)的應(yīng)用

試驗(yàn)材料 基本培養(yǎng)基 抑菌劑 作者 發(fā)表時(shí)間

香蕉 MS 次氯酸鈉 莫廷輝等 2011、2012

荸薺 MS 次氯酸鈉 吳桂容等 2013

魔芋 MS H198 趙青華等 2011

梅花 MS 特制消毒液 陳瑞丹等 2007

紅豆杉 MS 山梨酸鉀 王丹等 2010

白菜 B5 大蒜素、代森錳鋅 王趙玉等 2012

馬鈴薯 YEB、PDA YI-1 張薪薪等 2005

葡萄 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

蘋果 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

紅櫨 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

香花槐 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

蝴蝶蘭 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

地被菊 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

1 抑菌劑

在植物開放式組織培養(yǎng)中，由于培養(yǎng)基不經(jīng)過高溫高壓滅菌，外植體處于開放、自然的有菌環(huán)境中，所以能防止污染又不影響外植體生長的抑菌劑就成了研究者們的研究重點(diǎn)。抗生素是植物組織培養(yǎng)中用來防止污染的傳統(tǒng)試劑，是組織培養(yǎng)中常用的一種抑菌劑。但其在抑菌的同時(shí)有一定的抑菌譜且容易使微生物產(chǎn)生耐藥性，對外植體的分化和生長有一定的影響。王春發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯培養(yǎng)基中添加20 mg/L的硫酸鏈霉素能完全抑制細(xì)菌浸染且對組培苗的生長發(fā)育無不良影響[12]。閻志紅等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50 mg/L的青霉素能夠有效地抑制培養(yǎng)基的污染，但長期在含有此濃度青霉素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的西瓜的伸長生長與生根明顯受到抑制[13]。簡興等在紅掌的培養(yǎng)基中加入300 mg/L青霉素與180 mg/L鏈霉素混合液，比單一使用一種抗生素抑菌效果更好[14]。隨后研究者們嘗試使用其他物質(zhì)作為抑菌劑并獲得了試管苗，報(bào)道有農(nóng)藥（代森錳鋅）、食品添加劑（山梨酸鉀）、家用消毒液（次氯酸鈉）、植物提取物（大蒜素、特制消毒液）等作為抑菌劑。在香蕉的開放式組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，解輝等通過向培養(yǎng)基中添加不同濃度的次氯酸鈉溶液作為抑菌劑，發(fā)現(xiàn)0.01%以上濃度的次氯酸鈉可有效抑制培養(yǎng)基的污染，濃度超過002%時(shí)外植體的存活率降低，試管苗的生根率低于傳統(tǒng)組培苗[4]。可能是由于次氯酸鈉加入培養(yǎng)基后產(chǎn)生的次氯酸對外植體的生長有一定的影響且使培養(yǎng)基pH值降低影響了外植體對植物生長調(diào)節(jié)劑的吸收。吳桂容等在荸薺的開放式組織培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)次氯酸鈉濃度為1.0%時(shí)的污染率最低，誘導(dǎo)率最高，但都低于對照組[7]。次氯酸鈉穩(wěn)定性差，易受熱、光和pH值的影響，這可能是導(dǎo)致以上2個(gè)試驗(yàn)所用次氯酸鈉濃度差別大的主要原因。王趙玉等自制生物農(nóng)藥大蒜素及化學(xué)農(nóng)藥代森錳鋅對白菜種子進(jìn)行開放式組培，試驗(yàn)結(jié)果表明，0.10～017 g/mL的大蒜素抑菌效果較好且對植物生長影響較小，代森錳鋅0.1～0.7 g/L抑菌效果較好且對植物的根和芽生長有明顯的促進(jìn)作用[11]。趙青華等用6種不同的抑菌劑對魔芋進(jìn)行開放組培，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑菌劑對愈傷組織的分化影響較大，容易引起愈傷組織褐變，濃度越低影響越小，且分化的試管苗長勢也比傳統(tǒng)組織培養(yǎng)試管苗弱[6]。王丹等首次運(yùn)用食品添加劑山梨酸鉀作為開放組培的抑菌劑，發(fā)現(xiàn)0.02 g/L的山梨酸鉀能有效抑制紅豆杉開放組培中培養(yǎng)基的污染[10]。

目前利用次氯酸鈉、山梨酸鉀、代森錳鋅、大蒜素等作為開放式組織培養(yǎng)的抑菌劑均獲得了組培苗（表2）。

表2 植物開放式組織培養(yǎng)中抑菌劑的應(yīng)用情況

試驗(yàn)材料 抑菌劑種類 抑菌劑濃度 外植體生長狀況

香蕉繼代叢生芽 次氯酸鈉 0.01%

荸薺莖芽 次氯酸鈉 1.0%

魔芋 H198 400倍液 比傳統(tǒng)試管苗弱

梅花莖段 特制消毒液 0.7%

紅豆杉三年生葉片 山梨酸鉀 0.02 g/L 污染率較高，存活率低

馬鈴薯試管苗 YI-1 62.5 g/mL 苗粗壯、葉片多、顏色綠、擴(kuò)展

葡萄莖段 特制消毒液 0.2% 苗生長健壯，分化率較高

白菜種子 大蒜素 0.10～0.17 g/mL 種子萌發(fā)率80%以上，芽的生長與對照組無顯著性差異

白菜種子 代森錳鋅 0.1～0.7 g/L 種子萌發(fā)率88%以上，芽的生長與對照組無顯著性差異

2 培養(yǎng)容器

傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)所用容器為錐形瓶，以塑料膜封口或用棉球塞封口，且容器要求能耐高溫高壓。而開放式組織培養(yǎng)采用培養(yǎng)基中添加抑菌劑代替高溫高壓滅菌，所以容器的選擇范圍大。為了降低成本，簡化程序，報(bào)道的試驗(yàn)所用培養(yǎng)容器均為一次性塑料杯，以保鮮膜封口。但趙青華等在對魔芋進(jìn)行開放式組織培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行了不同培養(yǎng)容器的對比試驗(yàn)，結(jié)果表明，一次性塑料杯由于質(zhì)量過輕，操作起來不方便，且長期使用成本高，傳統(tǒng)的培養(yǎng)容器如錐形培養(yǎng)瓶和方形培養(yǎng)盒雖然一次性投入高，但能反復(fù)使用，且外植體生長良好，是開放式組織培養(yǎng)的最佳選擇[6]。

3 無機(jī)碳和有機(jī)物質(zhì)

蔗糖是外植體生長發(fā)育的碳源和能量來源，沒有能量和碳源任何細(xì)胞都不能生長，植物不能進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂與組織分化。當(dāng)生長素水平恒定時(shí)，2%蔗糖有利于分化出木質(zhì)部，4%蔗糖則有利于分化出韌皮部，3%的蔗糖則可以分化出二者，所以3%是植物組織培養(yǎng)常用的蔗糖濃度。植物組織培養(yǎng)中蔗糖是碳源和能量的供給物，同時(shí)也是微生物孳生的主要原因。為了降低污染率，研究者們采用降低蔗糖濃度、無糖培養(yǎng)等方式進(jìn)行。有關(guān)蔗糖濃度與開放式組織培養(yǎng)中污染率之間的關(guān)系少有報(bào)道。吳桂容等在荸薺的開放式組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度為2%時(shí)污染率最低而誘導(dǎo)率高，雖然隨著蔗糖濃度的提高，誘導(dǎo)率升高，但污染率也隨之升高[7]。在磨芋的開放式組織培養(yǎng)中，趙青華等通過4個(gè)蔗糖濃度對比試驗(yàn)，結(jié)果表明，3%的蔗糖濃度有利于魔芋的誘導(dǎo)培養(yǎng)[6]。

無糖培養(yǎng)是采用人工環(huán)境控制手段，用CO2代替蔗糖作為碳源，提供植株生長適宜的光、溫、水、氣、營養(yǎng)等條件，促進(jìn)植株的光合作用，從而促進(jìn)植物的生長發(fā)育。張偉在紅掌的快繁中發(fā)現(xiàn)，如果不具備上述的無糖培養(yǎng)條件，僅在培養(yǎng)基中不添加蔗糖，雖然接種后由于無糖作為污染源，污染率大大降低，但外植體不會(huì)發(fā)生愈傷組織，增殖率很低，增殖系數(shù)只有1.81，且生長緩慢;而繼代培養(yǎng)的植株由于有了完整的莖、葉，具備一定的自養(yǎng)能力，不加蔗糖也能存活但植株基本無變化[15]。

有機(jī)成分在生物生長發(fā)育過程中參與了生物體的新陳代謝，是所有生物體不可缺少的重要營養(yǎng)物質(zhì)。曹善東等對影響草莓組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)的有機(jī)物因素進(jìn)行了對比試驗(yàn)，結(jié)果表明，甘氨酸是影響草莓繁殖系數(shù)的主要有機(jī)物因子，且濃度以2.0 mg/L為最適宜[16]。張清霞等將B5-10培養(yǎng)基中的有機(jī)物加倍，發(fā)現(xiàn)有機(jī)物加倍對某些大白菜品種花藥培養(yǎng)的出胚率無影響，而對一些難誘導(dǎo)出胚的品種則有促進(jìn)作用;添加絲氨酸使花藥培養(yǎng)的出胚率降低，而添加0.4 g/L谷酰胺對一些品種的胚誘導(dǎo)效果好[17]。有機(jī)物質(zhì)與污染率有一定的關(guān)系，荸薺的開放式組織培養(yǎng)中，去掉培養(yǎng)基中的有機(jī)成分能有效降低污染率，尤其是去掉甘氨酸后，污染率最低[7]。

4 培養(yǎng)方式

培養(yǎng)方式對開放式組織培養(yǎng)的影響鮮見報(bào)道。吳桂容等在荸薺的開放式組織培養(yǎng)中進(jìn)行了培養(yǎng)方式對其污染率和誘導(dǎo)率的影響試驗(yàn)，結(jié)果表明，培養(yǎng)室內(nèi)污染率最低，玻璃溫室和塑料溫室的污染率都較高[7]。固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)對開放式組織培養(yǎng)的影響還未見報(bào)道，僅王趙玉等在B5的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中加入了不同的抑菌劑對白菜種子進(jìn)行開放式組培[11]，但未進(jìn)行固體與液體培養(yǎng)基對開放式組培的影響的對比。張慎等認(rèn)為循環(huán)流動(dòng)的液體培養(yǎng)基不易受微生物的侵蝕，比固體培養(yǎng)基更適合于植物開放式組織培養(yǎng)[1]。

5 接種條件

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中，接種用的工具如鑷子、刀片等均采用高溫高壓滅菌或乙醇燈灼燒滅菌或?qū)Ｓ媒臃N滅菌器滅菌。而開放式組織培養(yǎng)中，省掉了高溫高壓滅菌這一過程，崔剛等將接種工具用75%乙醇擦洗后放在抑菌劑中浸泡1 h，接種過程中鑷子和刀片一直浸泡在抑菌劑中，這樣可有效防止接種工具引起的污染[2]。趙青華等通過試驗(yàn)表明在魔芋的開放式組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)瓶不需要進(jìn)行特殊的殺菌處理，接種盤、鑷子和刀片用抑菌劑浸泡處理即可達(dá)到滅菌效果[6]。

6 發(fā)展前景

植物開放式組織培養(yǎng)技術(shù)對環(huán)境無嚴(yán)格的無菌要求，操作程序簡化，成本降低，是未來植物組織培養(yǎng)發(fā)展的主要方向。既能抑菌又不影響外植體生長的抑菌劑是植物開放式組織培養(yǎng)技術(shù)的核心，故尋找有效的抑菌劑是研究者們工作的重點(diǎn)。抗生素抗菌效果較好，但有一定的抗菌譜且對外植體生長有一定的影響。化學(xué)農(nóng)藥及家用消毒劑的加入對外植體的生長發(fā)育有一定的影響。利用生物提取物制成的中藥混合物作為抑菌劑一直是研究者們比較認(rèn)同的有效抑菌劑，但是中藥的選擇及提取過程比較繁瑣。一些具有抗菌作用的蛋白質(zhì)如乳鐵蛋白和溶菌酶等，對外植體無任何副作用且不誘導(dǎo)微生物的抗性，可能是將來開放組培中抑菌劑的主要成分。

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