鵝PRL基因克隆及在繁殖相關組織中的表達規律

楊廷桂+段修軍+董飚+孫國波+紀榮超+卞友慶

摘要：以浙東白鵝為研究對象，采用克隆、測序技術獲得浙東白鵝PRL基因789 bp的cDNA序列，包括了690 bp的編碼區，編碼229個氨基酸。并與其他物種進行同源性比較，發現該基因序列與其他鵝PRL序列相比發生了A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A突變;其中A170G發生了氨基酸H→R的變化，C318T處發生了氨基酸 H→N 的變化，G617A發生了氨基酸R→H的變化。與禽類PRL基因核苷酸和氨基酸序列同源性均在92.9%以上，與人和哺乳動物同源性在51.8%～77.2%之間。利用實時熒光定量PCR技術檢測鵝產蛋期到就巢期PRL基因在相關組織中的表達變化。在產蛋期和就巢期，垂體中PRL基因表達量顯著高于其他3個組織，下丘腦、卵巢、輸卵管3個組織之間PRL基因mRNA表達量沒有顯著性差異。就巢期組織中PRL基因表達量極顯著高于產蛋期同一組織中 mRNA 表達量。

關鍵詞：浙東白鵝;PRL基因;基因克隆;mRNA表達;繁殖;產蛋期;就巢期

中圖分類號： S835.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0024-03

收稿日期：2014-05-14

資助項目：江蘇省泰州市科技項目。

作者簡介：楊廷桂（1954—），男，江蘇揚州人，教授，主要從事水禽育種與疾病防治研究。E-mail：tgy@126.com。

自然狀態下，禽類產蛋到一定階段就會產生就巢行為，這是禽類重要母性表征之一，也是禽類得以繁衍和進化的保證。在世界眾多家禽品種中，大多數家禽仍然保持著或強或弱的就巢性。我國具有豐富的鵝遺傳資源，部分地方品種就巢性均較強。我國一些地方鵝種體型大，就巢性強，一般1年中產蛋3～4次，每次產蛋8枚左右就開始就巢孵化。如浙江省的浙東白鵝、安徽省的皖西白鵝、湖南省的溆浦鵝、廣東省的獅頭鵝、江蘇省的洪澤湖鵝等，這些鵝品種都是人類長期選育而得，是優良的地方品種。擴大這些品種的飼養量，是發揮其優良特性的有效手段，但是就巢性影響了其快速擴大的步伐。隨著鵝蛋人工孵化技術成熟，不需要鵝進行就巢孵化。如何降低鵝的就巢行為、提高繁殖性能是廣大研究者關注的問題之一。

禽類就巢性的遺傳機理比較復雜，具體遺傳機理還不清楚。目前普遍認為，就巢性是由環境、內分泌系統、基因型相互作用的結果。下丘腦-垂體-卵巢軸是一個完整而協調的神經內分泌系統，它的每個環節均有其獨特的神經內分泌功能，并且相互調節、相互影響。它的主要生理功能是控制雌性動物的性功能，涉及到多種激素的作用，這些激素又是由基因控制的。催乳素（prolactin，PRL）是垂體前葉嗜酸細胞分泌的多肽類激素，對動物的繁殖和泌乳、新陳代謝等起著調節作用[1]。催乳素的早期研究是測定禽類不同繁殖時期血液中催乳素的含量，發現雞、火雞、鴨、鵝就巢性的發生和維持都受到PRL的調控，在就巢期間PRL水平明顯上升，就巢結束時下降[2-3]。獅頭鵝在就巢期血清中PRL濃度最高，遠遠高于其他繁殖階段[4]。郭軍等利用抑制消減雜交技術發現母鵝就巢時PRL基因表達上調，推斷PRL基因是影響就巢性的關鍵基因[5]。汪峰等發現雪山草雞種雞垂體中PRL基因的表達與其繁殖性能呈顯著負相關[6]。張學余等發現PRL基因調控區的插入/缺失（24 bp）能顯著影響72周齡白耳雞的產蛋數[7]。前人的研究均顯示催乳素基因在禽類生殖周期中起著重要的作用。

本研究擬以浙東白鵝為材料，設計引物，克隆浙東白鵝PRL基因，并分析其與GenBank中登錄的部分動物PRL基因的同源性;采集產蛋期和就巢期垂體、下丘腦、卵巢、輸卵管組織，采用實時熒光定量PCR方法檢測PRL在浙東白鵝繁殖過程中的表達規律，以進一步豐富鵝就巢性分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為產蛋和就巢期的浙東白鵝（在第2個產蛋期期間）。在2個時間段內隨機選取5只母鵝。屠宰放血后，采集下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管組織置液氮速凍，-80 ℃凍存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計 根據GenBank中公布的禽類PRL基因序列，用DNAMAN進行比較，尋找保守區設計引物，引物送上海桑尼生物技術有限公司進行合成。引物序列及信息見表1，其中引物A1用于PRL基因克隆，A2、A3分別用于實時熒光定量PCR時用于擴增PRL、β-actin基因。

表1 基因克隆和mRNA表達所用引物信息表

引物名稱 引物序列（5′→3′） 作用

A1 F：CTTTCTGGCAGAGCAAGTC PRL基因克隆

R：TGGCAAAGCA ACAAGAACAC

A2 F：TGAAAGGTTTGTTGCTGGTGG 實時熒光定量PCR

R：GGGCAGATAGGCAAGGAGGT

A3 F：CCCATCTATGAGGGCTACGC β-actin

R：TGATGTCACGGACGATTTCC

1.2.2 RNA提取及反轉錄 采用Trizol法提取浙東白鵝組織中總RNA，利用核酸濃度測定儀檢測RNA濃度和純度。按照Takara逆轉錄試劑盒操作說明書進行cDNA合成，以適量RNA為模板，以Oligo（DT）為引物在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。

1.3 PCR擴增

以cDNA為模板，用引物A1進行擴增獲得PRL序列。PCR反應體系為25 μL：10×PCR 緩沖液 （無Mg2+）2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 2 μL，MgCl2 （25 mmol/L）1.5 μL，上、下游引物 （10 pmol/L）各 1 μL，rTaq 聚合酶 （5 U/μL，Takara Tokyo，Japan）0.2 μL，cDNA模板 1 μL，dH2O 15.8 μL。

1.4 克隆及測序

PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，對PCR產物進行純化回收。回收的PCR產物與pMD19-T載體連接。重組子轉化感受態細胞DH5-α，涂在含氨芐青霉素的LB培養基上，37 ℃培養12 h。隨機挑取菌落，用菌液PCR法和酶切法篩選陽性克隆，每個基因挑選2～3個陽性克隆送上海桑尼生物技術有限公司測序。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

嚴格按照LC-480熒光定量PCR儀說明書進行試驗操作。用UltraSYBR Mixture（with Rox）進行擴增，程序為：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。RealTime反應體系為：UltraSYBR Mixture 10 μL，上游引物（10 μmol/L） 0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，模板 2 μL，加入滅菌蒸餾水至20 μL。

1.6 序列分析與數據分析

基因序列用NCBI上的Blast進行序列比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.BLAST/），用DNAMAN 6.0生物軟件進行序列的翻譯和作圖。實時熒光定量結果采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。SPSS 17.0統計分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 PRL基因克隆和序列分析

2.1.1 PRL基因PCR擴增結果 對浙東白鵝垂體、卵巢等組織提取的總RNA進行反轉錄合成cDNA，以A1為引物進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，結果見圖1。由圖1可知，PCR擴增產物長度為800 bp左右，與引物設計時參照其他物種推測的長度相符，初步斷定其可能是PRL基因的序列。

2.1.2 序列分析結果 經克隆測序獲得1個擴增片段的cDNA序列，序列長度為789 bp（圖2）。進一步序列分析，發現這段序列包括690 bp的編碼區，編碼229個氨基酸。將這段核苷酸序列編碼區與GenBank中的東北籽鵝（FJ527782）、皖西白鵝（DQ062571）、萊茵鵝（DQ066733）、馬 崗 鵝（DQ345783）的序列進行比較，發現該PRL基因在編碼區序列中存在6個點突變，分別為A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A;其中A170G發生了氨基酸H→R的變化，C318T處發生了氨基酸H→N的變化，G617A發生了氨基酸R→H的變化。

2.1.3 不同物種間序列同源性比較 表2是根據PRL基因編碼區核苷酸、氨基酸序列采用軟件DNAMAN分析不同物種間同源性結果。由表2可知，浙東白鵝編碼區序列與野鴨（AB158610）、雞（NM_205466）、人（NM_000948）、小鼠（NM_011164）、豬（NM_213926）、牛（NM_173953）等動物PRL基因序列核苷酸序列同源性為61.8%～98.8%，其中與野鴨同源性最高，與小鼠的同源性最低。進一步進行氨基酸序列比較可知，浙東白鵝與禽類中野鴨、雞的同源性較高，均在93.9%以上，與哺乳動物豬的同源性也達到了77.2%，與小鼠的同源性僅有51.8%。

表2 浙江白鵝與不同動物PRL基因氨基酸及核苷酸序列的相似性

指標

相似性（%）

野鴨 雞 人 小鼠 豬 牛

核苷酸序列 98.8 92.9 70.1 61.8 73.1 68.7

氨基酸序列 99.1 93.9 68.3 51.8 77.2 68.4

2.2 PRL基因在組織中表達

本試驗采用Real-Time PCR方法檢測了PRL基因在浙東白鵝垂體、下丘腦、卵巢、輸卵管4個組織中產蛋期和就巢期2個時期表達規律（表3）。由表3可知，無論在產蛋期還是在就巢期，垂體中PRL基因mRNA表達量顯著性高于其他3個組織，其他3個組織中之間PRL基因mRNA表達量沒有顯著性差異。與產蛋期相比，就巢期組織中PRL基因表達量極顯著高于產蛋期的同一組織中mRNA表達量（圖3）。

表3 浙東白鵝PRL基因在繁殖調控組織中的表達結果

組織 產蛋期表達量 就巢期表達量

垂體 9.19±0.98a 27.50±2.21a

下丘腦 1.36±0.21b 5.32±0.37b

卵巢 1.87±0.21b 5.68±0.46b

輸卵管 0.83±0.06b 6.02±0.48b

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

3 討論

浙東白鵝是我國優良的肉用白鵝，其體型較大，廣受養殖者和消費者的青睞，但是其產蛋量有限，年產蛋量在30枚左右，每次產蛋8枚左右就開始出現就巢現象，就巢時間約為產蛋期的2倍，同時就巢時卵巢和輸卵管退化，嚴重影響了浙東白鵝的產蛋量，制約了產業的發展壯大。PRL通過下丘腦-垂體-卵巢軸引發禽類的就巢行為，是就巢行為發生和維持的重要基因之一。本研究首次從浙東白鵝卵巢組織中提取RNA，通過反轉錄、克隆、測序獲得了浙東白鵝PRL基因的cDNA序列，包含了完成的編碼區，共編碼229個氨基酸。通過序列比較，發現浙東白鵝PRL在不同鵝品種中存在6個點突變，分別為A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A，其中第1、第4、第6處的點突變引起了氨基酸序列發生了變化，表明鵝 PRL序列存在單核苷酸多態性，這些堿基變異導致了氨基酸殘基的差異，這是否是不同鵝品種就巢性和產蛋性能差異的原因，還需要進一步試驗證實。

禽類的繁殖性能主要由卵泡發育數量和排卵頻率決定的，受到性腺軸的調控，分為下丘腦的長調控、垂體的中調控和卵巢的短調控作用。催乳素（PRL）是產蛋期、就巢期的重要功能基因，通過抑制下丘腦分泌促性腺激素釋放激素來實現對繁殖的抑制作用。下丘腦PRL表達的增加說明其通過反饋調節系統調節催乳素的自分泌或旁分泌機制，進一步增加催乳素表達。本試驗采用Real-Time PCR方法檢測了PRL基因在垂體、下丘腦、卵巢、輸卵管4個組織中產蛋期和就巢期2個時期表達規律。在4個組織中，垂體中PRL基因的表達量一直處于最高位置，其他3個組織之間表達量沒有顯著性差異，這可能是由于垂體是催乳素的分泌器官。就巢期組織中PRL基因表達量極顯著高于產蛋期的同一組織中表達量，說明從產蛋期進入就巢期鵝通過體內內源性PRL表達增加來維持就巢性狀，這與張響英等在獅頭鵝、魏茹華在皖西白鵝中的研究結果[4，8]一致，也與Kansaku在火雞[9]和Lea等在雞[10]上的試驗結果相同。

禽類就巢性的發生是家禽的內分泌激素、遺傳和環境等諸多因素共同作用的結果，其遺傳力低，通過常規的選育方法難以完全剔除就巢性。本研究克隆了浙東白鵝PRL基因編碼區序列，發現PRL基因在就巢期表達量顯著增加，說明PRL基因在禽類就巢時的重要性;通過與其他鵝品種的序列比較，發現不同鵝品種序列之間存在點突變，本研究為開展PRL基因能否作為剔除就巢性的候選基因進行了有益探索。

參考文獻：

[1]Goffin V，Binart N，Touraine P，et al. Prolactin：the new biology of an old hormone[J]. Annual Review of Physiology，2002，64：47-67.

[2]Sharp P J，Sterling R J，Talbot R T，et al. The role of hypothalamic vasoactive intestinal polypeptide in the maintenance of prolactin secretion incubating bantam hens：observations using passive immunization radiommunoassay and immunohistochemistry[J]. The Journal of Endocrinology，1989，122（1）：5-13.

[3]陳 杰，盧立志，陳偉華，等. 四季鵝繁殖周期中血漿某些生殖激素水平的變化[J]. 南京農業大學學報，1991，14（4）：76-80.

[4]張響英，唐現文，王利剛，等. 實時熒光定量RT-PCR檢測獅頭鵝繁殖周期中PRL mRNA的表達[J]. 江蘇農業科學，2012，40（9）：50-52.

[5]郭 軍，湯青萍，章雙杰，等. 利用抑制消減雜交技術篩選鵝就巢行為相關基因[J]. 畜牧獸醫學報，2011，42（10）：1477-1484.

[6]汪 峰，何宗亮，賈曉旭，等. 雪山草雞PRL基因的表達差異及其對繁殖性能的影響[J]. 畜牧獸醫學報，2009，40（6）：813-817.

[7]張學余，李國輝，韓 威，等. PRL和POU1F1基因及基因聚合對白耳雞產蛋數的效應分析[J]. 安徽農業大學學報，2010，37（2）：249-252.

[8]魏茹華. 鵝生殖周期催乳素基因（PRL）mRNA表達規律的研究[D]. 合肥：安徽農業大學，2009：15-18.

[9]Kansaku N，Shimada K，Suzuki T，et al. Genetic variation in the chicken prolactin promoter[J]. Biology of Reproduction，1999，60（1）：253-254.

[10]Lea R W，Dods A S，Sharp P J，et al. The possible role of prolactin in the regulation of nesting behaviour and the secretion of luteinizing hormone in broody bantams[J]. The Journal of Endocrinology，1981，91（1）：89-97.