高溫脅迫下菜心SSH cDNA文庫的建立

郭培國，王直亮，夏巖石，許蘭桂，李榮華，黃紅弟，張 華，鄭巖松

（1.廣州大學生命科學學院，廣東廣州 510006；2.廣州市農業科學研究院，廣東廣州 510308）

高溫脅迫下菜心SSH cDNA文庫的建立

郭培國1，王直亮1，夏巖石1，許蘭桂1，李榮華1，黃紅弟2，張 華2，鄭巖松2

（1.廣州大學生命科學學院，廣東廣州 510006；2.廣州市農業科學研究院，廣東廣州 510308）

為發現與菜心耐熱性相關的差異表達基因，該研究以耐熱性強的“四九19號菜心”和耐熱性弱的“3T6”作實驗材料，采用抑制差減雜交（SSH）技術，構建了一個高溫脅迫下在“四九19號菜心”中特異表達的SSH cDNA基因文庫.該文庫共有154個contigs，經測序和拼接獲得99條unique ESTs.這些EST序列長度在122～819 bp之間，平均344 bp.BLAST分析發現99條ESTs代表81個基因，其中68個基因有功能注釋、9個無功能注釋和4個未匹配的新基因.這些基因可能與菜心的耐熱性相關.

菜心；耐熱；SSH cDNA文庫；基因

菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis var. utilis Tsen et Lee）又稱菜薹，是華南地區栽培面積最大、具有優勢和標志性的蔬菜種類之一［1］，為十字花科蕓薹屬（Brassica）白菜亞種的一個變種，喜冷涼，屬耐寒和半耐寒性蔬菜［2］.但在盛夏秋初，菜心的生長常常遭遇到不同程度的高溫脅迫，嚴重影響了菜心的正常生長和發育，導致產量和品質下降［3］.因此高溫季節菜心的生產成為難題，形成供應的淡季.認識菜心耐熱性的生理特性和耐熱性的分子機理，可為采用適宜的措施提高菜心的耐熱性、輔助選育出耐熱性強的菜心品種提供理論基礎.近年來，已有研究發現一些菜心的形態性狀和生理特性與菜心的耐熱性相關［3－4］，這對認識和了解菜心的耐熱性起到積極作用，但未見開展探討與菜心耐熱性相關基因等從事分子機理研究的報道.

就發現與某一性狀相關基因的方法來講，抑制差減雜交（Suppression subtractive hybridization，SSH）被認為是一種較為適合的技術，可在轉錄水平上發現兩材料間差異表達的基因［5－6］.該技術利用mRNA逆轉錄后的cDNA作材料，通過兩次差減雜交消除兩材料共同cDNA、兩次PCR擴增富集低豐度差異表達的cDNA，從而達到分離差異表達基因的cDNA的目的［5，7］.自1996年報道SSH的方法以來，已成功應用在多種動植物上，發現了多個與表型性狀相關的功能基因，并成功揭示了動植物中一些生命活動的分子機理［6－9］.

本研究選用在耐熱性上具顯著差異的2個菜心品種（系）作材料，提取高溫脅迫處理后的mRNA，以耐熱性強的菜心材料的cDNA作檢測樣品（Tester）、耐熱性弱的菜心材料的cDNA作為參照樣品（Driver），采用SSH方法建立cDNA基因文庫，測定和分析文庫中的cDNA序列從而發現與菜心耐熱相關的基因，并從整體上對所發現耐熱相關基因進行初步的基因功能分析.研究結果可為菜心耐熱相關基因的確定、從分子水平上探究菜心耐熱性機理以及功能基因輔助菜心耐熱品種的選育提供理論和應用基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試的2份菜心材料“四九19號菜心”和“3T6”的種子由廣州市農業科學院提供.其中“四九19號菜心”為耐熱性強的菜心品種，“3T6”為耐熱性弱的菜心品系［4］.

1.2 高溫脅迫處理

2份菜心材料的種子播種于盛有培養基質分格的育苗盤中（每格的長寬深分別為6 cm×6 cm×7cm），置于人工氣候箱中萌發和生長.人工氣候箱光溫條件：白天25℃、12 h 400 μmol·m－2·s－1的光照，晚上20℃；人工氣候箱內的相對濕度控制在70%～80%.出苗后及時疏苗，保留每格1株，待幼苗長到3葉1心期，選取生長一致的幼苗移栽至直徑為16 cm、高為20 cm的種植盆中，每盆1株.

待菜心長到現蕾初期，將兩菜心材料移至溫度為38℃、光強為400 μmol·m－2·s－1、相對濕度為70%～80%的人工氣候箱中進行高溫脅迫處理，脅迫處理6 h后，收獲薹莖上第3片完全展開葉的葉片，置于液氮中速凍，之后保存在－80℃冰箱中備用.

1.3 總RNA和mRNA的提取

選用Invitrogen公司的Trizol試劑（Catalog No：15596－026）及其操作說明提取高溫脅迫后“四九19號菜心”和“3T6”葉片中的總RNA；使用Promega公司的PolyATract?mRNA Isolation system III試劑盒及操作說明書從提取的總RNA中純化出mRNA.利用Thermo Scientific NanoDrop超微量紫外分光光度計檢測提取的總RNA和mRNA的濃度，保存在－80℃冰箱中備用.

1.4 SSH cDNA文庫的構建

選用Clontech的PCR-SelectTM cDNA subtraction Kit，以耐熱性強的菜心品種“四九19號菜心”作為測試樣品（Tester），以耐熱性弱的菜心品系“3T6”作為參照樣品（Driver），按照使用說明書的操作步驟開展2個樣品間的抑制差減雜交.其操作流程簡述如下：取Tester和Driver的mRNA各2 μg，經逆轉錄和聚合反應生成雙鏈cDNA，使用RsaI核酸內切酶切割雙鏈cDNA并利用2個接頭連接切割后的產物，經過兩輪雜交以除去共同cDNA片段，再經兩輪PCR擴增（其中第2次為巢式PCR）富集出差異性表達基因片段；巢式PCR的產物與Promega公司的pGEM-T Easy載體連接形成重組載體，用熱激法將重組載體轉化到大腸桿菌DH5α的感受態細胞中；運用Ampicillin培養基除去未轉化成功的大腸桿菌，采用藍／白斑篩選方法鑒別出具有重組載體的白色菌落，用牙簽挑取白色菌落并振蕩培養12 h，取部分菌液加入適量甘油貯存于－80℃冰箱備用，獲得SSH cDNA文庫.

1.5 SSH cDNA文庫的cDNA片段大小與DNA序列分析

為檢測SSH cDNA文庫中各個cDNA片段的大小，利用pGEM-T Easy載體的操作說明中提供的T7啟動子檢測引物（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和SP6啟動子檢測引物（5′-TATTTAGGTGACACTATAG-3′）對各個克隆進行菌液PCR，使用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產物的大小.

將菌落PCR擴增產物為唯一條帶的克隆送至生物工程有限公司進行測序，測序后的序列數據應用DNAStar 7.0軟件去除接頭序列和載體序列，并進行拼接聚類，獲得拼接后unique ESTs序列.利用GenBank（http：／／www.ncbi.nih.gov／genbank）和KEGG（http：／／www.genome.jp／kegg／）對所有ESTs進行同源匹配檢索的Blast分析［10－11］.

2 結果與分析

2.1 總RNA及mRNA的質量分析

總RNA的完整性和純度是構建SSH文庫的關鍵步驟之一［10］.本研究提取到的2個菜心材料的總RNA經瓊脂糖電泳，可以清楚地觀察到總RNA中3條邊緣清晰無彌散的28S、18S和5S的RNA條帶，且28S RNA條帶亮度明顯高于18S RNA（圖1）；使用紫外分光光度計檢測2樣品總RNA的A260／A280的比值均在2.0左右.表明提取出的高溫脅迫下“四九19號菜心”和“3T6”菜心材料的總RNA未出現降解，RNA的完整性高、質量好.

圖1 “四九19號菜心”和“3T6”菜心材料總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Image of agarose gel electrophoresis for the total RNAs of“Sijiu 19 caixin”and“3T6”

在此基礎上，利用提取的總RNA，采用mRNA純化試劑盒純化各材料的mRNA，純化后的mRNA經NanoDrop超微量紫外分光光度計分析，其A260／A280比值在2.0左右，表明mRNA純度較好，符合構建SSH cDNA基因文庫的要求.

2.2 抑制差減雜交效果分析

抑制差減雜交效果是建立高質量SSH cDNA文庫的核心［6］.從圖2的瓊脂糖凝膠電泳圖可見，第一次PCR中未差減樣品cDNA片段擴增產物的大小主要集中在300～700 bp，而差減樣品的擴增產物主要集中在320～600 bp，表明差減過程有效地除去了非差異表達片段，而富集了低豐度差異表達的片段.第二次PCR是根據接頭序列設計引物進行的巢式PCR，差減和未差減樣品擴增產物片段的大小基本一致；因第二次PCR擴增產物不含部分載體序列，與第一次PCR相比其擴增產物大小稍微減少，主要集中在200～480 bp，這與預期結果一致；另外，從圖2中還可觀察到未差減樣品擴增產物的熒光強度明顯高于差減樣品，表明未差減樣品擴增產物的量高于未差減樣品，進一步說明了差減樣品中主要為差異表達的片段.為了檢測差減效率，利用差減和未差減樣品的第二次PCR產物作為模板，分析不同PCR循環次數下持家基因RPS6（核糖體蛋白S6，引物1：5′-TCTCTCTTGTGGCTGTAGTC-3′，引物2：5′-CCTGACATCATCCTCCTTAA-3′）的擴增產物；電泳檢測結果表明，差減樣品為模板經33次循環的擴增產物量與未差減樣品為模板經23次循環的擴增產物的量相當（圖3）.這一結果表明SSH方法的差減效果好、差減效率高，同時也表明了本研究開展的抑制差減雜交實驗獲得成功.

圖2 抑制差減雜交的第一次和第二次PCR擴增產物的凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis image of PCR products at the first and second rounds of SSH

圖3 差減效率的PCR評價Fig.3 Evaluation of subtraction efficiency by PCR

2.3 SSH cDNA文庫的建立

將第二次PCR擴增產物與載體連接，經轉化、鋪平板和過夜培養后，依據藍白斑篩選的原理，對在含有氨芐青霉素平板上白色的陽性克隆進行篩選、確認和編號，共發現有161個白色克隆.這些克隆經菌落PCR擴增后，擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.結果見圖4，所得克隆擴增產物主要集中在300～900 bp之間.由于Promega T Easy載體空載體中T7引物到SP6引物之間有179 bp，因此插入到載體中的cDNA片段的大小還要扣除179 bp.有少數克隆無擴增條帶或擴增出多個條帶，無擴增條帶的克隆將再次采用PCR擴增核實，具多個條帶的克隆將再次鋪平板分離和PCR核實.最后，確定出具有1個擴增條帶的克隆154個，這些克隆所攜帶的cDNA信息即為本研究所得的cDNA基因文庫.

2.4 SSH cDNA文庫的測序與分析

選取文庫中154個具有唯一擴增條帶克隆的菌液PCR擴增產物，送樣給生工生物工程（上海）有限公司進行DNA序列分析.根據154個克隆樣本的測序結果，除去接頭和載體序列，分析發現154個ESTs中，最短的EST序列長度為122 bp，最長的EST為785 bp，平均325 bp.

進一步利用DNAStar軟件對所有EST序列進行拼接聚類，共獲得99個unique ESTs.這些EST序列長度在122～819 bp之間，平均344 bp.運用Genbank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genbank／）和KEGG（http：／／www.genome.jp／kegg／）的蕓薹屬植物油菜基因組及EST數據庫，對99個EST序列進行BLAST相似性比較，發現只有4個ESTs在數據庫中未發現類似的序列，它們可能屬于新的基因序列；其余95個ESTs序列與Genbank和KEGG中公布的數據序列具有相似性.分析發現95個 ESTs序列中有18個ESTs是一些全長基因的部分序列可進一步拼接，拼接后代表77個基因.這77個基因中有9個無功能注釋，其余68個基因有功能注釋（表1）.有功能注釋的基因主要與光合作用、信號傳導、活性氧清除、細胞生長與分化、植物抗逆反應等相關.這些有功能注釋的68個基因、無功能注釋的9個基因及4個未發現相似序列的基因可能與菜心的耐熱性相關.

圖4 篩選出白色克隆的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Image of agarose gel electrophoresis for the PCR products of the partially screened white clones

表1 SSH cDNA文庫中unique EST Blast分析結果Table 1 Result of Blast analysis for unique ESTs at the SSH cDNA library

續表1

3 討 論

SSH技術被認為是一種能較好發現差異表達基因的方法［6，8，12］，總RNA質量、酶切割、低拷貝cDNA片段的富集、陽性克隆篩選等操作該技術的關鍵步驟［6］.從本研究實驗結果來看，2菜心材料總RNA電泳圖顯示上樣孔干凈、3個RNA（28S、18S和5S）條帶清晰、OD260／280比值在2.0左右，表明總RNA質量好.抑制差減雜交和稀有表達片段的富集效果經電泳檢測的結果顯示，非差異表達的cDNA片段被有效的除去，低豐度差異表達的cDNA片段得到富集，表明抑制差減雜交獲得成功.所建立的具有154個陽性克隆（代表99個unique ESTs）的文庫，測序分析表明陽性克隆插入的cDNA片段大小在122～785 bp之間，平均325 bp.因為理論上四堿基核酸識別酶RsaI每256 bp會有1個酶切位點，且RsaI酶切片段一般小于600 bp［13］.因此，文庫中cDNA片段的大小符合RsaI切割片段長度大小的范圍，表明切割效果較好.就文庫的大小和文庫中EST片段長度來講，與他人在其他植物如油菜［14］、甘藍［15］、辣椒［16］、小麥［6］和角蒿［12］等建立的SSH文庫基本一致.上述表明，本研究成功建立了一個在菜心耐熱材料中差異表達的SSH cDNA基因文庫，能較好地發現熱脅迫下耐熱菜心材料中差異表達基因.

Blast分析99個unique ESTs，發現4個未匹配、9個無功能注釋和68個有功能注釋的基因.有功能注釋基因中有相當部分基因編碼與光合作用相關的蛋白，如oxygen-evolving enhancer protein、chlorophyll a-b binding protein、photosystem I reaction center subunit和ribulose bisphosphate carboxylase等，這表明高溫脅迫后耐熱性強的“四九19號菜心”光合相關的基因表達量高于耐熱性弱的“3T6”，這與Crafts-Brandner和Salvucci［17］研究得出高溫脅迫首先傷害植物光合器官的結果一致.另外，這些有功能注釋基因的產物還與保護細胞免受傷害的抗逆反應（如HSP90-like protein GRP94、Metallothionein和peroxidase等）、決定細胞生死的代謝（如ubiquitin conjugating enzyme）、調控細胞生長和分化（如Rho GTPase activation protein）及信號傳導（如CIPK1 interacting protein）等有關，無功能注釋和未匹配的基因可能屬于新的功能基因，需進一步研究了解其可能的功能.所有這些基因可能與菜心的耐熱性相關.

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Preliminary study for investigation of heat-tolerant related genes in flowering Chinese cabbage

GUO Pei-guo1，WANG Zhi-liang1，XIA Yan-shi1，XU Lan-gui1，LI Rong-hua1，HUANG Hong-di2，ZHANG Hua2，ZHEN Yan-song2
（1.School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Academy of Agricultural Science，Guangzhou 510308，China）

In order to investigate differentially expressed genes related to heat tolerance in flowering Chinese cabbage，two genotypes“Sijiu 19 caixin（heat tolerance）”and“3T6（heat sensitive）”were chosen as plant materials，a cDNA library comprising the cDNA fragments of differentially expressed genes under heat stress in“Sijiu 19 caixin”was constructed by utilizing the technique of suppression subtractive hybridization（SSH）. The library contains 154 contigs which represent 99 unique ESTs through sequencing and assembling.The lengths of the ESTs range from 122 to 819 bp，with an average length of 344 bp.Blast analysis shows the 99 ESTs stand for 81 genes；among them，68 genes were annotated，9 genes were non-annotated，and 4 novel genes did not match any entry in the databases.These genes may be heat-tolerant related genes in flowering Chinese cabbage.

flowering Chinese cabbage；heat tolerance；SSH cDNA library；gene

S 634.5

A

【責任編輯：周 全】

1671-4229（2015）01-0043-07

2014－11－10；

2014－11－19

廣州市科技計劃資助項目（1212011541，2014J4100123）；廣州市屬高校科技計劃資助項目（1201420621）

郭培國（1963－）男，教授.E-mail：guopg＠yahoo.com