攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌的耐藥譜研究

楊永長，肖代雯，喻 華，姜 偉，陳 亮，胡洪華，周 薇，黃文芳(四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌的耐藥譜研究

楊永長，肖代雯，喻 華，姜 偉，陳 亮，胡洪華，周 薇，黃文芳
(四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

目的 比較攜帶與未攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的耐藥譜，為治療MRSE引起的感染提供理論依據。方法 收集臨床分離并經過全自動微生物奠定系統準確鑒定的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)165株，通過PCR擴增esp和mecA基因，準確鑒定和區分甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)和MRSE。擴增psm-mec，fudoh和p221片段確認攜帶psm-mec基因的MRSE菌株，比較分析攜帶與未攜帶psm-mec 基因MRSE的耐藥譜。結果 83.64%的臨床分離S.epidermidis為MRSE，其中29株攜帶psm-mec基因，攜帶率為17.58%，且僅分布于MRSE中。臨床分離MRSE易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、復方新諾明和克林霉素耐藥，未發現對利奈唑胺、呋喃妥因、普丁/達福、萬古霉素和替加環素耐藥菌株。攜帶psm-mec基因MRSE對環丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明的耐藥率明顯高于未攜帶psm-mec基因MRSE。結論 攜帶psm-mec基因MRSE易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、克林霉素、環丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明耐藥。

耐甲氧西林表皮葡萄球菌；psm-mec；耐藥譜

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)是人體皮膚正常菌，可引起慢性感染和導管相關性感染，難以治愈，已引起醫學界廣泛關注[1～6]。甲氧西林耐藥是院內感染S.epidermidis的主要特征之一，從全球范圍來看，臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)占75%～90%[7]。國外研究發現，引起院內感染的S.epidermidis常對氨基糖苷類和大環內酯類抗生素、四環素、氯霉素和克林霉素耐藥，但對新出現的抗生素均敏感[2]。雖然出現了萬古霉素中介菌株，但高水平萬古霉素耐藥菌株的傳播尚未見報道[8]。近年來，研究者發現SCCmec III型和IV型與抗生素耐藥譜之間存在一定關系[9]。前期預實驗研究提示，攜帶psm-mec基因MRSE的SCCmec型別主要為以II型和/或III型為主要結構的混合型。我們猜想，攜帶psm-mec基因的MRSE可能表現出特有的抗生素敏感性。因此，本研究收集臨床分離S.epidermidis，采用分子生物學方法區分和鑒定攜帶psm-mec基因MRSE，通過藥敏結果分析攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜，為臨床治療MRSE引起的感染提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 2012年3月至2014年3月四川省人民醫院住院患者分離的165株S.epidermidis，所有菌株采用全自動微生物鑒定系統鑒定，其中血液分離128株，痰液分離15株，中段尿液分離5株，傷口分泌物分離7株。

1.2 試劑和儀器 細菌DNA提取試劑(廣州達安)；2×Taq Master Mix(北京康為世紀)；100 bp DNA Ladder (北京天根)；血平板(鄭州安圖生物)；瓊脂糖(Biowest)，Tris堿(Novon)；PCR擴增儀PTC-200、凝膠成像儀(Bio-Rad)；生物安全柜、細胞培養箱(Heal Force)；電泳儀(Sanvant)；紫外分光光度計、高速低溫離心機(Eppendorf)；esp、mecA、psm-mec、fudoh和p221片段擴增的引物由上海Invitrogen公司合成。

1.3 細菌培養與基因組DNA提取 接種單個菌落至3 ml LB液體培養基，37 ℃ 220rpm培養過夜。取1 ml菌液，離心收集細菌，棄上清。沉淀加入100 μl DNA提取液，100 ℃ 10 min，10000 rpm離心5 min，上清即為S.epidermidisDNA，-20 ℃保存備用。

1.4 PCR擴增esp和mecA區分MRSE和MSSE

采用PCR擴增esp和mecA進一步區分MRSE和MSSE。esp基因的引物序列為esp F：5'-CCAGGGTAACCAGTAACAGT-3'，esp R：5'-GAGCTAAGGGTAA TCCAAGA-3'，PCR產物長度為244 bp；反應體系：2×Taq Master Mix 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：93 ℃預變性2 min，93 ℃變性30 s，42 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，進行30個循環，最后72 ℃延伸2mim。mecA基因的引物序列為mecAF：5'-GGGATCATAGCGTCATTA TTC-3'，mecAR：5'-AACGATTGTGACACGATAGCC-3'，PCR產物長度為527bp。反應體系：2×Taq Master Mix 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，進行30個循環；最后72 ℃延伸3 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

1.5 擴增psm-mec，fudoh和p221基因片段 MRSE psm-mec引物序列為：psm-mec F 5′-CGAAAGCCTGAA TGCAAGTCT-3′，psm-mec R5′-GGATTTCACTGGTGTTATTACAAGC-3′，產物大小為130 bp。反應體系：2×Taq Master Mix 5 μl，上下游引物各0.25 μl，DNA 1.5 μl，ddH2O 3 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，進行30個循環，最后72 ℃延伸5mim。fudoh基因位于SCCmec上，序列包含psm-mec全長及其上下游區域，fudoh基因擴增引物序列F：5′-CAATTCACTTGTCTTAA ACTTTGTAGAAAA AGAAG-3，R：5′-TATTTTATTTTCCATAATTGCCTACCC CATAAG-3′，產物大小為530bp。反應體系：2×Taq Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，最后72 ℃延伸5 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

1.6 抗生素敏感試驗 采用BioMerieux藥敏分析系統進行藥敏實驗，比較攜帶與未攜帶psm-mec MRSE耐藥譜的差異。

1.7 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理。計數資料比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床分離細菌 PCR擴增產物電泳結果顯示，165株臨床分離細菌均可擴增出esp基因片段，說明這些菌株均為S.epidermidis，與臨床微生物學鑒定相符。mecA陽性138株，mecA陰性27株。提示MRSE占臨床分離S.epidermidis的83.64%。其中血液、痰液、尿液和傷口分泌物分離MRSE分別占65.45%、6.06%、3.03%和3.03%，提示不同來源分離的S.epidermidis均以MRSE為主(圖1)。

圖1 不同標本來源MRSE和MSSE分布情況

2.2 攜帶psm-mec基因MRSE的篩選和驗證 PCR擴增psm-mec、fudoh基因和p221片段的凝膠電泳結果如圖2所示，165株臨床分離S.epidermidis中有29株均可擴增出psm-mec、fudoh基因和p221片段，攜帶率為17.58%。進一步分析發現，所有psm-mec陽性標本均存在MRSE中，而27株MSSE未擴增出psm-mec，提示psm-mec基因僅存在MRSE中。

圖2 psm-mec fudoh、p221 PCR擴增凝膠電泳結果 1：MSSE菌株；2：攜帶psm-mec 的MRSE菌株；3：攜帶psm-mec 的MRSE菌株；4：100bp DNA Ladder；5：fudoh 陽性菌株；6：p221 陽性菌株；7：psm-mec 陽性菌株

2.3 MRSE的耐藥譜 藥敏試驗結果顯示，59株MRSE中，未發現對利奈唑胺、呋喃妥因、普丁/達福、萬古霉素、替加環素耐藥菌株，苯唑西林(100%)、青霉素(100%)、紅霉素(89.83%)、復方新諾明(72.88%)與克林霉素(71.19%)最易耐藥，而對環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、四環素的耐藥率分別為45.76%、35.60%、11.86%、5.08%、27.12%和22.03%。同時發現15.25%環丙沙星和54.24%左氧氟沙星中介菌株(圖3)。

2.4 攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜 29株攜帶psm-mec基因MRSE對環丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明的耐藥率分別為68.97%、58.62%、51.72%和86.21%。30株未攜帶psm-mec 基因MRSE對環丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明的耐藥率分別為23.33%、13.33%、3.33%和60.00%(表1)。攜帶psm-mec基因MRSE對環丙沙星、慶大霉素、利福平以及復方新諾明的耐藥性明顯高于未攜帶psm-mec 基因MRSE。

圖3 不同菌株藥物敏感性結果

表1 攜帶與未攜帶psm-mec 基因MRSE的耐藥譜分析

3 討論

定植人體皮膚表面的S.epidermidis是一種重要的院內感染條件致病菌，免疫抑制患者中大部分慢性感染和導管相關感染均由S.epidermidis引起[1]。在美國，22% ICU患者的血流感染和13%人造瓣膜心內膜炎歸咎于S.epidermidis。據估計，每年用于治療S.epidermidis感染的費用大約需要20億美元[2]。我國一項涉及15個城市、17家醫院的調查顯示，80%以上臨床分離S.epidermidis為MRSE[3]。近年來，MRSE的檢出率越來越高，已成為全球院內感染的重要病原菌[4，5]。

甲氧西林耐藥由可移動遺傳元件SCCmec介導，2009年Queck等[12]在院內感染甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)中發現一種新基因psm-mec，同時攜帶該基因的菌株主要為SCCmec II型與III型。預實驗結果顯示，該基因也存在院內感染MRSE中，且主要以SCCmecII和/或III型結構為主。研究發現，某些型別的SCCmec具有獨特的抗生素耐藥譜[11]。我們推測攜帶psm-mec基因的MRSE在抗生素敏感性上具有一定的特征。

本研究通過PCR擴增psm-mec、fudoh基因和p221片段證實165株臨床分離S.epidermidis中，攜帶psm-mec基因的菌株為29株，在MRSE中占21%。為了探討攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜，本文首先分析了臨床分離MRSE的耐藥情況，結果顯示，除利奈唑胺、萬古霉素和替加環素等敏感外，其它抗生素均有不同程度耐藥，與國內研究結果一致[13～15]。接下來比較了攜帶和未攜帶psm-mec基因MRSE在抗生素敏感性上的差異，結果發現，攜帶psm-mec基因MRSE易對環丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明耐藥。但其具體的機制仍需進一步研究。

綜上所述，臨床分離攜帶psm-mec基因的MRSE在抗生素敏感性上具有明顯特征，易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、克林霉素、環丙沙星、慶大霉素、利福平和復方新諾明耐藥，本研究為治療MRSE引起的感染提供了理論依據。

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R446.5

A

1672-6170(2015)06-0031-04

2015-09-07；

2015-09-10)