去乙酰化胃腸激素聯合G-CSF及bFGF促進糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的研究①

張立海，王 嬌，陳福軍，鐘 敏，金 松，王桂梅，王亞洲，王躍生

(佳木斯大學附屬第一醫院普外一科，黑龍江 佳木斯 154003)

去乙酰化胃腸激素聯合G-CSF及bFGF促進糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的研究①

張立海，王 嬌，陳福軍，鐘 敏，金 松，王桂梅，王亞洲，王躍生

(佳木斯大學附屬第一醫院普外一科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：研究去乙酰化胃腸激素(UAG)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)聯合堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的促進作用及作用機制。方法：以120例Wistar大鼠為研究對象，隨機將其劃分為A、B、C三組，并將每組40例進一步劃分出組1、組2，各組1均為正常后肢缺血模型、組2均為糖尿病后肢缺血模型。A1、A2組不予藥物干預；B1、B2組予G-CSF聯合bFGF干預；C1、C2組予UAG、G-CSF聯合bFGF干預。術后1周，每組取10只大鼠，檢測缺血區組織基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內皮生長因子(VEGF)的表達；術后4周，余大鼠行激光多普勒檢測后肢肌肉血流后，處死并檢測缺血區組織毛細血管數量。結果：MMP-9及VEGF表達均呈現C組>B組>A組、各組1>各組2趨勢，且C組與A組、B組與A組間差異有統計學意義，同時C2組MMP-9及VEGF表達均明顯高于B2組(P<0.05)；組內對比，A1、B1組分別明顯高于A2、B2組(P<0.05)。肌肉血流及毛細血管數量亦呈現C組>B組>A組、各組1>各組2趨勢，且C1組與A1組，B1組與A1組，C2、B2、A2間差異均有統計學意義(P<0.05)；組內對比A1、B1組分別明顯高于A2、B2組(P<0.05)。結論：UAG聯合G-CSF與bFGF可有效促進糖尿病大鼠缺血后肢血管新生，其機制可能與促進MMP-9、VEGF的表達有關。

糖尿病；肢體缺血；血管新生；基質金屬蛋白酶-9；血管內皮生長因子

WHO預測，2025年世界范圍內糖尿病患者可能達到3億，將嚴重影響居民生活質量[1]。糖尿病所致各種并發癥為其主要威脅，其中又以下肢缺血性病變較為常見，可進一步致死致殘，較具威脅。現階段對其的研究重點集中于促進血管新生，恢復下肢血流灌注，但糖尿病患者糖脂代謝紊亂、血管內皮細胞功能受損，常規促血管新生藥物可能難以發揮作用[2]。G-CSF能夠刺激內皮祖細胞的生長與分化[3]；局部應用bFGF則有助于改善局部細胞生長環境，促進內皮祖細胞向缺血組織趨化[4]；UAG有助于修復糖尿病患者EPC的活化缺陷。上述藥物聯用可能有助于缺血部位的血管新生，但尚需實驗探究，故我們開展本動物學研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

雄性Wistar大鼠120只，均購自華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心，年齡10～12個月，體重250～280g；鏈脲菌素(上海巖生)、水合氯醛(上海巖生)、UAG(美國BioLegend)、bFGF(美國Sigma)、G-CSF(美國Sigma)、MMP-9酶聯免疫試劑盒(武漢博士德)、VEGF酶聯免疫試劑盒(上海森林雄科)、CD34酶聯免疫試劑盒(武漢博士德)等；石蠟切片機(武漢博士德)、激光多普勒超聲儀(瑞典百靈威)、酶標儀(美國BioTek)等。

1.2 方法

1.2.1 分組方法：所有大鼠按體重編號，行隨機數字表法多層分組。首先分為A、B、C三組，每組40只；隨后各組劃分出組1、組2，各20例。共得A1、A2、B1、B2、C1、C2六組。

1.2.2 造模方法：各組1均制備糖尿病模型：禁食12h，腹腔注射鏈脲菌素(60mg/kg，溶于我院自制檸檬酸緩沖液)。一周后采集尾靜脈血，空腹血糖超過300mg/dL說明造模成功。所有大鼠均制備后肢缺血模型：術前禁食12h、常規進水，戊巴比妥腹腔麻醉，仰臥固定于恒溫操作臺；右側腹股溝做切口，至膝關節，分離肌層；隨后暴露并分離股動脈，結扎、電灼，切除下段及分支。

1.2.3 用藥方法：待模型建立完畢后，間隔6h開始給藥，藥物劑量：UAG隔日1次，每次腹腔注射30μmol/kg；G-CSF首7日每日一次，皮下注射10μg/kg；bFGF首7日隔日1次，共4次，缺血區肌注5μg/kg。A組予等量生理鹽水，參考上述劑量注射；B組予G-CSF聯合bFGF，按照上述計量注射；C組在B組基礎上聯合應用UAG。

1.2.4 觀察項目：常規觀察大鼠體重、毛色、大小便、后肢運動情況等；模型建立1周后，各組取10只大鼠，處死，取缺血區肌肉組織2g，分兩份，分別用于檢測MMP-9及VEGF，均采取ELISA檢測法，操作步驟嚴格參照試劑說明書；模型建立4周后，行多普勒超聲檢測余大鼠下肢血流，隨后處死，取缺血區組織，固定、包埋、切片后行ELISA法檢測CD34陽性血管數，以評價大鼠微血管數量。

1.3 統計學方法

P<0.05為差異具備統計學意義。

2 結果

2.1MMP-9及VEGF表達對比

兩者表達一般趨勢均為：C組>B組>A組，且各組1>各組2。A、B、C三組間MMP-9水平行q檢驗指出B1、C1組均明顯高于A1組(q=4.31，4.33；P<0.05)，B2、C2均明顯高于A2組(q=3.82，4.58；P<0.05)，C2明顯高于B2(q=4.28；P<0.05)；A、B、C三組組內對比，A1、B1分別明顯高于A2、B2組。其他項對比，未見明顯差異。VEGF表達統計學檢驗結果相同。見表1。

表1 大鼠MMP-9及VEGF表達對比

2.2 肌肉血流及微血管密度對比

兩指標一般趨勢亦為：C組>B組>A組，且各組1>各組2。A、B、C三組間肌肉血流PU值行q檢驗指出C1組、B1組均明顯高于A1組(q=4.05，4.97；P<0.05)，B2、C2均明顯高于A2組(q=3.47，3.99；P<0.05)，C2明顯高于B2(q=4.05；P<0.05)；A、B、C三組組內對比，A1、B1均明顯高于A2、B2組。其他項對比，未見明顯差異。微血管密度統計學檢驗結果相同。見表2。

表2 肌肉血流及微血管密度對比±s)

3 討論

有研究表明，骨髓間充質干細胞移植有助于促進糖尿病大鼠后肢缺血血管的新生，這可能是因為移植的干細胞中富含內皮祖細胞，其作為內皮細胞的前體細胞，能夠迅速分化為血管內皮，進而使血管新生[5，6]。本研究借鑒該結論，但試圖僅通過藥物注射達到相似的效果，對照組應用的G-CSF，能夠提升循環系統中內皮祖細胞數量，該藥物為骨髓干細胞動員劑，早期研究證實其能夠作用于中性粒細胞系，刺激粒細胞及單核巨噬細胞成熟并向外周血釋放，近期亦有研究表明其能夠促進內皮祖細胞增生，從而保證血管新生具有細胞基礎[7]；在此基礎上，對照組同時局部應用bFGF，其為促有絲分裂因子[8]，亦能誘導形態發生和分化，能夠為內皮祖細胞的生長提供物質基礎，進而促進內皮祖細胞向缺血區域趨化、歸巢，能夠提升靶向性，抑制其它組織的血管再生。本例中B組僅采用上述兩藥物聯用，對糖尿病及非糖尿病后肢缺血模型均有一定作用，但B組組內對比，亦可表明，B1作用效果明顯優于B2。這可能是由于糖尿病患者內皮祖細胞及早期循環內皮祖細胞動員受損所致。研究指出，內皮祖細胞的動員與血管內皮因子及MMP-9相關[9]，前者為血管內皮細胞有絲分裂原，與受體結合后，能夠選擇性地促進血管內皮祖細胞分裂增殖，為血管形成提供基質；后者則有助于膜結合型配體向松散型配體轉化。本例A1、B1組中MMP-9及VEGF的表達均明顯高于A2、B2組，能夠直接證實糖尿病患者血管新生能力明顯降低，術后4周觀察肌肉血流及微血管數量，亦證實G-CSF聯合bFGF的療效尚需提升。

本研究結果同時能證實，在上述兩類藥物的基礎上，聯用UAG可能達到更佳的療效，C2組大鼠MMP-9及VEGF水平均明顯高于B2組，與之一致，其術后4周肌肉血流及微血管數量亦明顯高于B2組。這可能說明UAG有助于修復糖尿病患者EPC活化的缺陷。既往有研究指出該藥物能夠抑制p53及p21的表達與堆積[10]，后兩者均為調節細胞衰老的主要因子，大量堆積將導致內皮祖細胞老化、血管再生能力下降。經過輸注UAG后，C1、C2組MMP-9及VEGF的表達量大體一致，能夠說明大鼠內皮祖細胞的增殖與動員能力已恢復至無糖尿病水平[11]；但C1組與B1組MMP-9與VEGF的表達基本一致，則提示在正常人群中，UAG可能無法繼續修復內皮祖細胞活化的缺陷，因此可以認為，對UAG僅適用于糖尿病相關下肢缺血癥狀的治療，在其它下肢缺血癥狀中的療效及作用機制尚需進一步探究[12]。總之，本研究說明G-CSF聯合bFGF能夠實現下肢缺血癥狀的血管再生，而對合并糖尿病患者，進一步聯用UAG能夠顯著提升療效。

[1]劉蔚,周翔海.用糖化血紅蛋白診斷糖尿病——WHO咨詢報告[J].中國糖尿病雜志,2011,19(1):2-10

[2]劉志國.糖尿病足潰瘍診治進展[J].中華損傷與修復雜志(電子版),2012,07(2):68-70

[3]JingYu,JunRen,Li-jundi,etal.MobilizationofPeripheralBloodStemCellsUsingRegimenCombiningDocetaxelwithGranulocyteColony-stimulatingFactorinBreastCancerPatients[J].ChineseJournalofCancerResearch, 2011, 23(1):49-53

[4]李海輝,蔡善君,宮鑫，等.藍光對人視網膜色素上皮細胞α1D亞基蛋白表達及分泌VEGF和bFGF的影響[J].中華眼科雜志,2014,50(11):814-819

[5]張曉梅, 徐忠燁, 朱曉峰.bFGF、EGF聯合應用對新生大鼠海馬神經干細胞分化的影響[J].黑龍江醫藥科學, 2002,25(5):4-6

[6]盛寶英, 魏春杰, 楊曉玉,等.bFGF和BDNF對MCAO大鼠海馬區神經干細胞原位增殖的影響[J]. 黑龍江醫藥科學，2010，33(3)：1-2

[7]金玉玲, 張曉梅, 朱曉峰.移植神經干細胞在腦缺血大鼠損傷腦區的定向分化及其對運動功能的影響[J].黑龍江醫藥科學,2005,28(1):1-3

[8]謝曉強,呂碧鋒,章振保，等.G-CSF動員骨髓干細胞向缺血-再灌注腎臟歸巢并促進腎臟修復的研究[J].中華急診醫學雜志,2012,21(5):491-496

[9]陳振波,趙儷梅,羅艷梅，等.共培養體系中卵巢癌細胞對內皮祖細胞成管及MMP-2和MMP-9表達的影響[J].第三軍醫大學學報,2013,35(10):956-960

[10]ElisaDied,LaviniaCasati,FrancescaPagani,etal.AcylatedandunacylatedghrelinprotectMC3T3-E1cellsagainsttert-butylhydroperoxide-inducedoxidativeinjury:pharmacologicalcharacterizationofghrelinreceptorandpossibleepigeneticinvolvement[J].Aminoacids, 2014, 46(7): 1715-1725

[11]金松，王翰銳. 堿性成纖維生長因子與血管內皮生長因子聯合對大鼠后肢動脈硬化閉塞血管再生作用機制的研究[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(3)：40-41

[12]金松，徐延森. 動脈硬化閉塞癥血漿白介素-18、單核細胞趨化蛋白-1水平的觀察急臨床意義[J].黑龍江醫藥科學，2010，33(3)：24-25

黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12521551。

張立海(1979～)男，黑龍江樺南人，碩士，主治醫師。

王躍生(1960～)男，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail：wys9906@163.com。

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1008-0104(2015)02-0019-02

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