異丙酚預(yù)處理對(duì)擬阿爾茨海默病模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)和p38和caspase-3的影響①

鄧 萌，王景霞，張 巖，余立榮，鄧文偉

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

異丙酚預(yù)處理對(duì)擬阿爾茨海默病模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)和p38和caspase-3的影響①

鄧 萌1，王景霞2，張 巖3，余立榮3，鄧文偉3

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

異丙酚；阿爾茨海默病；大鼠；caspase-3

阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是老年人中發(fā)病率高、危害性大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。異丙酚(propofol)為目前最為常用的靜脈全麻醉藥物,因其苯環(huán)上的結(jié)構(gòu)與天然的抗氧化劑維生素E相似,因而具有一定的清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用[1],一些在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明異丙酚具有腦保護(hù)效應(yīng)[2～5]。本研究利用擬AD大鼠模型,觀察了用異丙酚預(yù)處理海馬組織中p38及caspase-3表達(dá)的影響,并結(jié)合行為學(xué)檢測(cè),評(píng)價(jià)異丙酚的腦保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供清潔級(jí)Wistar大鼠50只；體重(225±25)g，隨機(jī)分為4組：青年組10只、假手術(shù)組12只、模型組14只、異丙酚組14只；標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，自由飲水。除青年組大鼠外，其他各組按照60mg/kg體重腹腔連續(xù)注射D-半乳糖42d后，行手術(shù)。手術(shù)前檢測(cè)水迷宮，按照380mg·kg-1體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，前囟后3.8mm，中線右2mm，腦表面進(jìn)針3mm，緩慢注射2min，假手術(shù)組注射生理鹽水2μL，Aβ對(duì)照組、異丙酚組大鼠注射2μL凝聚態(tài)Aβ1-40(10μg·μL-1)，留針10min，緩慢拔出，縫合切口，術(shù)后大鼠在低溫下蘇醒。15d后，行水迷宮檢測(cè)，然后斷頭處死，取腦組織備用。異丙酚預(yù)處理組大鼠于擬AD模型制作前30min,腹腔注射異丙酚100mg/kg,對(duì)照組、擬AD模型組用同樣方法腹腔注射生理鹽水。

1.2 大鼠行為學(xué)檢測(cè)

采用1984年提出的Morris水迷宮法用于評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。每天訓(xùn)練5次，持續(xù)6天，在第7天后24h內(nèi)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄60s內(nèi)大鼠跨越平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)等，作為空間探索能力的指標(biāo)。觀察記錄大鼠自入水到找到平臺(tái)所游路徑，所需要的時(shí)間(即逃避潛伏期)作為學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)。本實(shí)驗(yàn)中Morris水迷宮檢測(cè)分別在D-半乳糖注射42d、手術(shù)后15d后進(jìn)行，其中Aβ注射后學(xué)習(xí)記憶成績(jī)下降30%以上的大鼠為AD造模成功。

1.3 標(biāo)本采集和準(zhǔn)備

大鼠于乙醚麻醉后，采用主動(dòng)脈插管，生理鹽水灌洗后，再用10%多聚甲醛灌注約30min，至組織變白后，在前囟后4mm處腦組織行石蠟包埋，SABC法免疫組化染色檢測(cè)p38、caspase-3。

1.4p38、caspase-3表達(dá)的檢測(cè)

在光鏡下，p38、caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿呈棕黃色。陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍視野(×400)，在病理圖像分析儀下分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率(陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模前后及給藥后逃避潛伏期的測(cè)定

大鼠連續(xù)腹腔注射D-半乳糖42d后(手術(shù)前)，行注射Aβ后(手術(shù)后)，大鼠在定位航行中的逃避潛伏期(尋找平臺(tái)時(shí)間)檢測(cè)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠逃避潛伏期的變化及異丙酚對(duì)其影響±s)

注：與手術(shù)前比較※P<0.05，※※P<0.01；與假手術(shù)組比較

△P<0.05，△△P<0.01；與Aβ對(duì)照組比較▲P<0.05；與青年組比較■P<0.01。

表2 AD模型大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)及異丙酚對(duì)其影響±s)

2.2 大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)及有效區(qū)次數(shù)的檢測(cè)

AD模型制作前后大鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中跨越

平臺(tái)及有效區(qū)次數(shù)測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表2。

假手術(shù)組、Aβ對(duì)照組、異丙酚組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)較青年組明顯減少(P<0.05)；模型制作后Aβ對(duì)照組和異丙酚組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，且均顯著少于手術(shù)前(P<0.01)，而且較假手術(shù)組均有顯著差異(P<0.01)；異丙酚組大鼠顯著增加平臺(tái)跨越次數(shù)，與Aβ對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)。

2.3 海馬CA1區(qū)p38和caspase-3表達(dá)

見(jiàn)表3。

表3 各組海馬CA1區(qū)p38和caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞率

與青年組和假手術(shù)組相比，p38陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增多，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。異丙酚組與模型組相比，p38陽(yáng)性細(xì)胞率下降，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

凋亡發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程[6]。在caspase家族中，caspase-3 是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[7]。多種刺激因素啟動(dòng)的信號(hào)激活caspase-3 使胞質(zhì)、胞核及細(xì)胞骨架的主要蛋白質(zhì)降解失活，caspase-3 在神經(jīng)元凋亡中扮演著關(guān)鍵分子的角色，其在胞質(zhì)激活，迅速轉(zhuǎn)移到胞核執(zhí)行凋亡。Morris水迷宮是目前評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)與記憶能力最廣泛使用的方法，主要檢測(cè)與海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)的記憶功能，對(duì)AD動(dòng)物模型尤為適用[8]。本實(shí)驗(yàn)顯示，與假手術(shù)組、異丙酚干預(yù)組相比，模型組上臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)次數(shù)下降，說(shuō)明Aβ對(duì)大鼠的空間記憶獲取與保持能力具有損害，證明模型成功；異丙酚干預(yù)組與模型組比較，其上臺(tái)潛伏期明顯縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)有顯著的提升，提示異丙酚對(duì)于Aβ致AD大鼠的空間記憶獲取與保持能力有明顯的改善。本實(shí)驗(yàn)顯示:模型組CA1區(qū)p38細(xì)胞陽(yáng)性率增加，異丙酚組p38細(xì)胞陽(yáng)性率降低。由此推測(cè):Aβ1-40的沉積促進(jìn)p38的活化，p38的活化可磷酸化tau蛋白、介導(dǎo)炎癥、凋亡反應(yīng)及通過(guò)介導(dǎo)IL-1使突觸泡蛋白的合成減少，導(dǎo)致AD發(fā)生、發(fā)展。異丙酚可能通過(guò)抑制p38的活性，保護(hù)神經(jīng)元、改善學(xué)習(xí)記憶能力。 本研究結(jié)果表明,擬AD模型建立前30min異丙酚預(yù)處理能改善擬AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,降低p38和caspase-3的表達(dá),可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

[1]MurphyPG,MyersPS,DaviseMJ,etal.Theantioxidantpo-teotialofpropofol(2,6-diiosoproopylphenol) [J].BrJAnaesth, 1992,68(6):613-618

[2]楊靜,李天佐,張炳熙,等.異丙酚對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2005,25(12):917-918

[3]KodakaM,MoriT,TanakaK,etal.Depressiveeffectsofpropofolonapoptoticinjuryanddelayedneuronaldeathafterforebrainischemiaintherat-comparisonwithnitrousoxide-oxy-gen-isoflurane[J].Masui, 2000,49(2):130-138

[4]甘國(guó)勝,姜立,陳利民,等.異丙酚預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠損傷和神經(jīng)行為學(xué)的影響[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(38): 79-81

[5]陳婷婷,王剛,周琪,等.異丙酚和異氟烷在瓣膜置換術(shù)中對(duì)腦保護(hù)作用的比較[J].中國(guó)體外循環(huán)雜志,2007,5(2):91-93

[6]AlbrechtS,BourdeauM,BennettD,etal.Activationofcaspase-6inagingandmildcognitiveimpairment[J].AmJPathol, 2007, 170(4):1200-1209

[7]RissmanRA,PoonWW,Blurton-JonesM,etal.Caspase-cleavageoftauisanearlyeventinAlzheimerdiseasetanglepathology[J].JClinInvest, 2004, 14(1):121-130

[8]朱秋雙，任春清，包利澤，等.何首烏對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2011,34(3): 8-9

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：12541791。

鄧萌(1988～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

鄧文偉(1963～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:dengww@163.com。

R749.2+

A

1008-0104(2015)01-0021-02

2014-12-26)