氰基丙烯酸正丁酯納米載體促進紫杉醇粒抗腦膠質瘤作用的實驗研究①

李明軍，李英夫，吳 雁，楊福義，王維峰，宣兆博

(1.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003;2.中科院國家納米中心，北京 100000)

氰基丙烯酸正丁酯納米載體促進紫杉醇粒抗腦膠質瘤作用的實驗研究①

李明軍1，李英夫1，吳 雁2，楊福義1，王維峰1，宣兆博1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003;2.中科院國家納米中心，北京 100000)

目的：動物實驗水平研究聚氰基丙烯酸正丁酯納米載體促進紫杉醇粒抗腦膠質瘤的作用。方法：①紫杉醇-聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒懸液的制備。②制備膠質瘤模型，制備的膠質瘤模型隨機分成四組，每組20只，Ⅰ組注射生理鹽水、Ⅱ組注射紫杉醇、Ⅲ組注射PBCA+NP、Ⅳ組注射紫杉醇+PBCA+NP，15d后觀察Wistar大鼠的變化，觀察腫瘤病理切片，檢測腫瘤細胞的凋亡率。結果：①Wistar大鼠的生存狀態，Ⅳ組好于其它三組。②Ⅱ組和Ⅲ組Wistar大鼠腦膠質瘤血管的減少和壞死腫瘤組織比Ⅳ組少。③Wistar大鼠腦膠質瘤調亡率Ⅳ組高于Ⅱ組、Ⅲ組，具有統計學顯著差異(P<0.05)。結論：聚氰基丙烯酸正丁酯納米載體明顯提高紫杉醇抗Wistar大鼠腦膠質瘤的作用。

聚氰基丙烯酸正丁酯紫杉醇;SHG-44;Wistar大鼠；病理

紫杉醇是天然抗腫瘤藥物，提取于紅豆杉的樹干和樹皮，對卵巢癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤、膠質瘤療效明顯，紫杉醇在水中溶解度低，影響其療效，為提高其溶解度，采用溶解在聚氧乙烯蓖麻油內，也可溶解在乙醇內，雖然溶解度提高了，但給藥后副作用明顯增加，本課題組曾進行動物實驗研究紫杉醇對實驗動物的膠質瘤具有明顯的抑制作用，為提高其療效，對其給藥方式進行了有益的探索，近年來隨著納米技術的發展，為臨床給藥開辟了新的途徑，由于納米載體毒副作用較小，而且能夠降解，納米載體具有靶向性，由于這一特性，增加了藥物的療效，具有很好的臨床應用前景，本實驗在Wistar大鼠腦膠質瘤模型成功建立后，在動物實驗水平，觀察紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的抗膠質瘤作用，得到了很好的效果，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar雌性大鼠100只,體重350～500g,購于佳木斯大學實驗動物中心，SanyoCO2培養箱，超凈工作臺等，光學顯微鏡，流式細胞儀，立體定向儀，SHG-44細胞株[1～4]。

1.1.1 腦膠質瘤模型的制備

①SHG-44細胞懸液的制備SHG-44來源于人額葉星形膠質瘤的穩定培養，具有特異性標志膠質酸性纖維蛋白(GFAP)，SHG-44是目前較理想的細胞株，能夠穩定的培養，并在Wistar大鼠尾狀核區成功植入，將復蘇成功的SHG-44細胞株，放于50cm2培養瓶中接種，DMEM培養基中含有10%滅活的胎牛血清，還含有鏈霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培養瓶置于5%CO2的培養箱中，溫度恒定于37℃，SHG-44細胞滿瓶后,將培養液傾倒出去,0.25%胰酶消化培養瓶中的SHG-44細胞,顯微鏡下觀察SHG-44細胞，當細胞開始皺縮時,加入營養液,并反復吹打，使SHG-44細胞脫壁,并用離心機離心5min，離心轉數為1000r/min，將上清液棄出，制成106細胞/瓶的細胞懸液,接種于25cm2培養瓶中。

②SHG-44細胞懸液制備的接種 接種前3d，每日給予地塞米松，劑量為100g體重1mg，給藥方式為灌胃，降低排斥反應，植入靶點為右側尾狀核區，穿刺點為矢狀縫右旁開3.5cm和前囟中點前1.0cm，用10%水合氯醛麻醉，給藥劑量為每100克體重0.4mL，麻醉滿意后，將Wistar大鼠固定于立體定向儀上，剪去穿刺點周圍毛,高效碘消毒,鋪無菌洞巾，切開內眥連線與正中矢狀面交點向后1cm，定位預先穿刺點，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑1.2mm，用1mm微量注射器針頭刺破硬膜，向下垂直進入硬膜下6mm, 再后撤1mm，將細胞懸液1×106/20μL，以每分鐘1μL的速度緩慢注入右側尾狀核區，穿刺針停留5min，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。

1.1.2 紫杉醇-聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備

將300mgDextran-70放置于燒杯中，加蒸餾水攪拌使其溶解，pH值調至3.0，定容至50mL。于室溫、電磁攪拌下緩緩加入濃度為1%的α-BCA0.5mL，攪拌4h后，pH調至8.5，用氫氧化鈉溶液，制成空白的PBCA納米粒膠體溶液。量取空白的PBCA溶液10mL，加入藥物20mg，pH值調至7.0，攪拌4h后，得紫杉醇-PBCA-NP膠體溶液，取上述紫杉醇-PBCA-NP膠體溶液10mL，同時加入0.1mLT-80，攪拌半小時，置于恒溫箱中孵化2h，溫度恒定于37℃。

1.2 分組給藥

MRI掃描Wistar大鼠頭部，篩除過大過小的腫瘤，留取呈橢圓形、球形，篩除過大、過小的腫瘤，隨機分成4組，每組10只，分開飼養。術后每日腹腔注射青霉素，劑量為每次10萬單位。制備的膠質瘤模型隨機分成四組，每組10只。

Ⅰ組 ：生理鹽水(對照組)。Ⅱ組：紫杉醇(實驗組)。Ⅲ組：PBCA+NP(實驗組)。Ⅳ組：紫杉醇+PBCA+NP(實驗組)。

1.3 指標測定

①觀察Wistar大鼠生存狀態。②腫瘤的組織病理學觀察。③測定腫瘤細胞凋亡率。

1.4 統計學方法

采用SPSS11.5統計軟件包進行統計分析，數據用均數±標準差表示，多組之間采用方差分析，兩組之間采用Q檢驗，P<0.05具有顯著差異。

2 結果

2.1 觀察Wistar大鼠的生存狀態精神萎靡，反應遲鈍，食欲不振，體重下降，身體虛弱，活動明顯減少，步態不穩等癥狀。Ⅳ組Wistar的以上表現，明顯好于Ⅱ組和Ⅲ組。

2.2 腫瘤組織病理學切片

光鏡下觀察Wistar大鼠腦膠質瘤標本，腫瘤細胞呈小梭形，細胞核較大，有異形，可見核分裂相，染色質豐富，細胞質相對較少，實驗組可見壞死灶，Ⅱ組和Ⅲ組Wistar大鼠腦膠質瘤血管的減少和壞死腫瘤組織比Ⅳ組少。

2.3 腫瘤細胞的凋亡率

見表1。

表1 各組腫瘤細胞凋亡率

3 討論

膠質瘤是發生于神經外胚葉的膠質細胞腫瘤，是目前最頑固的腫瘤之一，治療效果無突破性進展。中位生存時間改善不明顯，目前仍以手術治療為主，術后輔以放化療，并且復發率極高，幾乎可達到100%，對患者生活質量和壽命造成極大威脅，這是目前神經外科面臨的極富挑戰難題，廣大的學者和臨床醫生正在探索新的治療方法。隨著化療藥物的制備工藝的提高，減少了化療藥物的毒副作用，化療作為術后治療的常用手段之一，化療藥具有明顯的閾值，超過閾值可發揮抗癌作用，增加到一定量時具有明顯的毒副作用，呈現劑量依賴性，導致化療效果并不理想，治療同時難免損傷正常腦細胞導致的并發癥,隨診納米技術的發展，為膠質瘤患者帶來福音。藥物通過包埋在粒子內部，以及吸附于粒子表面，納米粒子輸送藥物具有如下特點：①緩釋性，增加藥物作用時間，②靶向性 增加了藥效，③毒副作用小，④穩定性好，有利于儲存等[5～6]。納米粒子能穿透組織間隙并被細胞吸收，可通過人體最小的毛細血管。納米粒子通過囊壁瀝濾、滲透、本身的溶蝕等方式，把藥物釋放出來[7，8]。由于納米粒子所均有的以上特性，提高了化療藥物的治療效果，同時也減輕了毒副作用，前景廣闊。

本實驗在成功建立Wistar大鼠SHG-44腦膠質瘤模型的基礎上，將生長滿意的腫瘤，作為實驗的腫瘤模型，隨機分成4組，為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組，Ⅰ組為對照組，注射生理鹽水，實驗組為Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組，Ⅱ組注射紫杉醇，Ⅲ組注射PBCA+NP，Ⅳ組注射紫杉醇+PBCA+NP，待注射藥物10d后，觀察Wistar大鼠的生存狀態，測量腫瘤生長抑制率，測定腫瘤細胞的凋亡率，觀察病理切片，結果Wistar大鼠的生存狀態(精神萎靡，反應遲鈍，食欲不振，體重下降，身體虛弱，活動明顯減少，步態不穩等癥狀)，Ⅳ組Wistar的以上表現，明顯好于Ⅱ組和Ⅲ組。腫瘤生長凋亡率Ⅱ組、Ⅲ組明顯低于Ⅳ組，光鏡下觀察腫瘤標本，腫瘤組織壞死程度和血管的減少量Ⅳ組多于Ⅲ組和Ⅱ組，以上結果表明，動物實驗水平上聚氰基丙烯酸正丁酯納米載體具有明顯促進紫杉醇粒抗腦膠質瘤作用，利用納米載體所具有的特性，增加了腫瘤組織內藥物的濃度，提高了藥效，減少了毒副作用。

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黑龍江省衛計委課題項目，編號：2010-523。

李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師。

李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫師。E-mail：liyingfu79@sohu.com。

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1008-0104(2015)02-0029-02

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