丹參注射液對于急性胰腺炎大鼠血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影響①

王小全，艾迎春

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

丹參注射液對于急性胰腺炎大鼠血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影響①

王小全，艾迎春

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過對急性胰腺炎大鼠用丹參注射液時血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影響，從而探討丹參對急性胰腺炎的治療的療效及機理。方法：45只清潔的雄性Wistar大鼠被隨機分成為3組：即空白對照組(假手術組)、疾病模型組(AP組)和藥物治療組(丹參組)。在3h、6h、12h時在各組分別取5只大鼠，采用ELISA法測定并比較大鼠血清中的TNF-α、IL-6及采用WESTERN blotting檢測胰腺組織NF-κBp65蛋白。結果：將模型組與對照組(假手術組)比較,TNF-α、IL-6的水平增高,胰腺組織NF-κB蛋白也升高(P<0.05);而治療組(丹參組)上述指標與模型組相比均有下降(P<0.05)。結論：丹參注射液可能通過抑制AP大鼠NF-κB蛋白，從而降低血清中TNF-α、IL-6的濃度水平，控制AP炎癥，從而對急性胰腺炎的治療發揮作用。

NF-κB;TNF-α;IL-6;AP; 丹參注射液

急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是胰酶提前激活造成胰腺及周圍組織消化所引起的急性炎癥性疾病。其特點為病情嚴重，死亡率高，至今仍無突破性的治療。常見的致死原因包括全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)，等等，這是不能用傳統的胰腺自身消化理論充分解釋。急性胰腺炎時有炎細胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8)等升高,而且其升高的幅度與急性胰腺炎的嚴重程度密切相關[1]。且它已經通過近幾年的一系列實驗，證明了對局部和全身組織損害相關的幾種炎癥介質(如IL-1，IL-6，TNF-α，等)，而核轉錄因子-κB是和這些炎癥介質激活有關的[2]。NF-κB是一種DNA結合蛋白，在各種炎性及免疫反應中，是通過調節細胞因子和黏附分子的基因而表達[3]，具有基因轉錄調節作用，可參與AP炎性因子的調控，主要調節TNF-α、IL-6和IL-8等。而丹參注射液的作用可以改善外周循環、加快微循環血流速度、抗炎、調節免疫等。

本實驗是采取通過采取逆行胰膽管注射4%的牛磺膽酸鈉制備成AP模型，分別在3h、6h、12h時進行檢測AP模型組及丹參注射液治療組大鼠血清中的腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)及胰腺組織中的核轉錄-κB蛋白水平的變化。探討丹參注射液對急性胰腺炎大鼠的NF-κB表達的影響及TNF-α、IL-6的影響，驗證丹參注射液是否能通過抑制AP大鼠NF-κB蛋白，降低血清中TNF-α、IL-6的濃度水平，控制AP炎癥反應，從而對急性胰腺炎的治療發揮作用。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及分組

選取45只清潔健康的Wistar大鼠,雄性,體重200～250g,采用統計學方法將其隨機均分為3組,即空白對照組(假手術組), 疾病模型組(AP組)和藥物治療組(丹參組)，每組各15只。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立急性胰腺大鼠模型

Wistar大鼠被適應性喂養7d,在進行術前的12h只喂水即禁食不禁水。

對照組只行開腹，對胰腺組織只進行輕柔處理。 模型組，采取由Aho等[4]提出的誘導急性胰腺炎的方法：將4%的牛黃膽酸鈉逆行膽胰管注射。術前采用10%水合氯醛溶液(0.4mL/100g)進行腹腔注射麻醉，麻醉后，將大鼠在實驗臺上處于仰臥位，并且四肢被固定于實驗臺上，開始準備：備皮，消毒，鋪巾。在中上腹部即胃區行正中切開，開腹后沿胃的幽門向下找十二指腸，從而找到胰膽管，將胰膽管進入十二指腸處暴露出來，在胰膽管開口對側腸壁上用穿刺針行穿刺，進入腸腔后，在使穿刺針穿入胰膽管內，再將膽胰管上下端閉合，注入4%牛磺膽酸鈉(0.1mL/100g)制備AP模型(注射速度0.2mL/min)，持續3min后，可觀察到胰腺組織的改變即水腫、充血、壞死等，然后使膽胰管恢復暢通，拔穿刺針，指壓穿刺點，檢查有無漏膽，在進行器官復位，關腹后將切口包扎并固定。

治療組，AP制模成功后給予丹參注射液以8g/kg經尾靜脈注射。

1.2．2 標本采集及檢測指標

各組于3、6、12h時間點各取5只大鼠(1)經心臟采血，分離血清后，采用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠血清中TNF-α、IL-6。(2)采集胰腺組織NF-κBp65 蛋白表達的分析(Westernblotting檢測)。

1.3 統計學方法

2 結果

造模后分別在3h、6h、12h時，與對照組對比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平與對照組均明顯增高(P<0.01)；與模型組對比，治療組各時間點的大鼠血清中的TNF-α、IL-6水平及胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，但并未恢復到正常水平。見表1～3。

分 組TNF-α 3h 6h 12h對照組(假手術組)81．40±8．3683．13±7．0186．58±7．65模型組(AP組)218．77±21．23?258．60±21．28?315．41±25．39?治療組(丹參組)189．00±15．05△227．57±18．04△278．54±24．97△

與對照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

分 組IL-6 3h 6h 12h對照組(假手術組)124．45±10．16132．49±11．24139．56±10．50模型組(AP組)188．52±15．93?219．93±17．76?369．47±17．59?治療組(丹參組)163．70±12．68△193．41±15．85△340．07±17．87△

與對照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

分 組NF-κB 3h 6h 12h對照組(假手術組)0．68±0．060．72±0．060．78±0．07模型組(AP組)0．88±0．08?1．04±0．08?1．30±0．11?治療組(丹參組)0．77±0．06△0．91±0．07△1．12±0．10△

與對照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

3 討論

丹參為中藥,其性味較苦,微寒,其功效具有活血祛瘀,涼血消癰等作用，是我國的傳統中藥。據有關研究均提示，丹參中的成分具有改善外周循環、加快微循環血流速度、增加毛細血管網、抗炎、調節免疫、提高低壓條件下肌肉的耐缺氧能力及改善缺血再灌注損傷等作用[5，6]。丹參成分當中含有多種抗菌、抗炎成分，而隱丹參酮是丹參的主要成分，且抗菌、抗炎效果也較突出。其對葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型鏈球菌變形桿菌等表現出較強的抑菌作用，而對炎癥引起的腫脹、感染引起的腫脹均具有一定功效，能使腹膜炎的炎癥滲出明顯減少，抑制白細胞游走，從而使中性粒細胞的趨化性明顯降低。而丹參注射液是中藥制劑，丹參酮、丹參素為主要成分，還有多種物質成分，其作用主要表現在對活血化瘀、降低血黏稠度及促進和改善微循環中，從而對炎癥的恢復有一定的作用[7]。

急性胰腺炎是常見的消化系疾病，目前的發病機制仍不清楚，導致缺乏適當的治療AP的治療策略。最關鍵的一點是胰腺壞死的發展，往往會發展為全身性炎癥反應綜合征(SIRS)，10%～30%近似的死亡率，在重癥急性胰腺炎的大多數形式的死亡是由于感染和多器官功能障礙綜合征(MODS)。傳統的如胰腺自身消化理論或微循環障礙理論不能令人滿意地解釋SIRS、MODS的發生，甚至死亡。然而，最近提出的炎癥介質理論為急性胰腺炎的研究提供了新的線索[8]。 正是在這一理論解釋說，在早期階段急性胰腺炎，異常激活胰酶破壞鄰近胰腺細胞，導致局部炎性細胞浸潤。激活的炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、胰腺腺泡細胞產生和釋放炎性細胞因子[9]。炎性細胞因子的升高程度與AP的嚴重程度密切相關，而正是這些炎性細胞因子的導致SIRS和MODS的發生。目前比較公認的炎性細胞因子有TNF-α和白細胞家族成員(IL-6、10、18)等[10]。急性胰腺炎的炎癥刺激使受累組織和網狀內皮細胞產生一系列的細胞因子,其主要的促炎因子為TNF-α和IL-6,起重要作用表現在炎癥反應和器官損害中[11]。NF-κB是一個具有基因轉錄調控作用的蛋白質，可以參與許多炎癥因子的調節作用[12]，有5種NF-κB/Rel家族成員在哺乳動物的細胞中：分別是RelA(p65)、RelB、原癌基因c-Rel、NF-κB1(p50/p105)和NF-κB2(p52/p100)[13]。TNF-α和IL-6是受NF-κB的調節的，NF-κB是通過所在的NF-κB對TNF-α及IL-6啟動的結合位點進行調節的[14]。經研究，活化的NF-κB能導致細胞因子表達增加，如TNF-α，IL-6，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，導致免疫反應和炎癥反應的發生[15]。本實驗結果表明，模型組(AP組)是造模后3h、6h、12h血中TNF-α、IL-6水平及NF-κB的表達增高且與正常對照組比較，具有差異性意義(P<0.01)，治療組(丹參組)是造模后給予丹參注射液治療后可明顯低于模型組中的大鼠血清中TNF-α、IL-6的水平及NF-κB的表達，具有差異性意義(P<0.05)，提示丹參注射液可能通過抑制AP大鼠NF-κB的活性，從而降低血清中TNF-α、IL-6的濃度水平，控制AP炎癥反應，從而對急性胰腺炎的治療發揮作用。

本研究表明：丹參注射液對急性胰腺炎的治療有一定的作用，其作用機制可能通過抑制AP大鼠NF-κB蛋白，從而降低血清中TNF-α、IL-6的水平，控制AP的炎癥反應，其具體機制尚有待進一步研究。

[1]艾迎春,韓桂華,郭公新,等.L-8和IL-12與急性胰腺炎分類的探討[J].黑龍江醫藥科學，2004，27(1)：34-35

[2]MurrMM,YangJ,FierA,etal.RegulationofKupffercellTNFgeneexpressionduringexperimentalacutepancreatitis:theroleofp38-MAPK,ERK1/2,SAPK/JNK,andNF-κB[J].JournalofGastrointestinalSurgery，2003，7(1):20-25

[3]LiJ-H,YuJ-P,YuH-G,etal.MelatoninreducesinflammatoryinjurythroughinhibitingNF-κBactivationinratswithcolitis[J].MediatorsofInflammation，2005，2005(4):185-193

[4]AhoHJ,KoskensaloSM,NevalainenTJ．Experimentalpancreatitisinsodiumtaurocholateinducedacutehaemorrbacpancreatitis[J].ScandJGastroenterol，1980，15(4):411-416

[5]陳向榮，陸京伯，石漢平.丹參的藥理作用研究進展[J].中國醫院藥學雜志，2001,21(1)：44-45

[6]孫成婷.復方丹參注射液的臨床新應用[J].中國醫藥雜志，2004,5(1)：213

[7]李中和，張建明，霍飛蛟.丹參對糖尿病早期腎病患者血漿內皮素和IV型膠原的影響[J].中國綜合臨床，2002,18(7)：621-622

[8]FelderbauerP,MüllerC,BulutK,etal.Pathophysiologyandtreatmentofacutepancreatitis:newtherapeutictargets-arayofhope[J]．BasicandClinicalPharmacologyandToxicology，2005，97(6):342-350

[9]NormanJG,FinkG,FranzM,etal.Activeinterleukin-1receptorrequiredformaximalprogressionofacutepancreatitis[J].AnnalsofSurgery，1996，223(2):163-169

[10]趙勇，田國忠，李梅秀，等.IL-6在心衰大鼠心肌組織中表達及GHRP的干預作用[J].黑龍江醫藥科學，2001，24(4):31-32

[11]LiuHS,PanCE,LiuQG,etal.TheeffectofNF-κBandp38MAPKinactivatedmonocytes/macrophagesonpro-inflammatorycytokinesofratswithacutepancreatitis[J].WorldJGastroenterol,2003,9(11):2513-2518

[12]ChristmanJW,LancasterLH,BlackwellTS.NuclearfactorκB:apivotalroleinthesystemicinflammatoryresponsesyndromeandnewtargetfortherapy[J].IntensiveCareMedicine，1998，24(11):1131-1138

[13]DeDiosI,RamudoL,AlonsoJR,etal.Garcia-MonteroAC,MansoMA:CD45expressiononratacinarells:involvementinproinlammatorycytokineroduction[J].FEBSLett，2005,579:635-6360

[14]UdalovaIA,KnightJC,VidalV,etal.ComplexNF-κBinteractionsatthedistaltumornecrosisfactorpromoterregioninhumanmonocytes[J].JournalofBiologicalChemistry，1998，273(33):21178-21186

[15]AlgülH,TandoY,SchneiderG,etal.AcuteexperimentalpancreatitisandNF-κB/Relactivation[J].Pancreatology，2002，2(6):503-509

The effect of Salvia miltiorrhiza injection on NF-kappa B,TNF-α, IL-6 in the serum of rats with acute pancreatitis

WANGXiao-quan，AIYing-chun

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To study the effect of Salvia miltiorrhiza injectionon NF-kB, TNF-α,IL-6 in the serum of rats with acute panc-reatitis,and to explore the effect and mechanism of Salvia miltiorrhiza injection in the treatment of acute pancreatitis. Methods: Wistar rats were randomly divided into three groups: control group(sham group),model group(group AP) and treatment group(group Salvia miltiorrhiza),with 15 in each group.Five rats in each group were selected in 3h, 6h and 12h respectively. The TNF-α,IL-6 in their serum were observed and compared by using the method of ELISA.The NF-kBp65 proteins in pancreatictissue were detected by using Western blotting method. Results:Compared with control group(sham group),the levels of TNF-α,IL-6 in model group(group AP)were increased,and NF-kB expression in pancreatic tissue were increased(P<0.05).Theaboveindexesoftherapygroup(groupSalviamiltiorrhiza)weredecreasedcomparedwiththemodelgroup(P<0.05). Conclusion: Salvia miltiorrhiza injection may reduce the concentration of TNF-α,IL-6 in serum,and control AP inflammation by the inhibition of AP rats NF- kB, which plays a role in treatment on acute pancreatitis.

NF-κB；TNF-α；IL-6；AP；Salvia miltiorrhiza injection

佳木斯大學科研生科技創新項目，編號：LM2014-014。

王小全(1987～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

艾迎春(1960～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail:41006735@qq.com。

R

A

1008-0104(2015)01-0058-03

2014-11-19)