雌二醇短期暴露對非洲爪蟾性腺和輸卵管形態及性二態基因表達影響的初步研究

徐偉，樓欽欽，魏無際,*，秦占芬

1. 南京工業大學環境學院，南京 210009 2. 中國科學院生態環境研究中心 環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085

雌二醇短期暴露對非洲爪蟾性腺和輸卵管形態及性二態基因表達影響的初步研究

徐偉1，樓欽欽2，魏無際1,*，秦占芬2

1. 南京工業大學環境學院，南京 210009 2. 中國科學院生態環境研究中心 環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085

環境雌激素對兩棲動物的生殖內分泌干擾作用已引起關注，目前的研究主要集中在長期暴露對性腺分化和發育的影響。以雌二醇(E2，10 nmol·L-1)為模式化合物，以非洲爪蟾為實驗動物，6月齡的幼蛙暴露6 d，研究雌激素對性腺和輸卵管形態以及性二態性基因表達的影響。結果發現，6 d的E2暴露對精巢和卵巢的形態沒有明顯影響，但從組織學結構來看對卵和精子的發育有微弱的促進作用。E2能夠明顯地促進了雌性輸卵管的發育，表現為輸卵管變粗變彎曲。E2暴露顯著抑制精巢和卵巢中性激素合成相關基因cyp11a1、3βHSD、Srd5α、ARO的表達，對cyp17的表達無影響，使腦中LHβ和FSHβ的表達下調；對性別分化和性腺發育相關基因Dax、AR、ERα、TFⅢA、TBPL2的表達均無影響，但能夠促進卵巢中Sox3的表達；同時促進腦中Emi2的表達，抑制腦中Dmrt1的表達。因此，輸卵管可作為敏感的形態指標，性腺中Srd5α、cyp11a1、3βHSD、ARO、Sox3和腦中LHβ、FSHβ、Dmrt1、Emi2可作為分子指標。以上結果可為后續建立評價化學品對兩棲動物雌激素效應的短期試驗方法提供參考。

磁二醇；非洲爪蟾；雌激素效應；輸卵管；性腺；性二態基因

大量研究顯示，環境雌激素類物質廣泛存在于水體當中[1-4]。這些環境雌激素對水生生物尤其魚類的生殖系統發育和生殖功能的影響已有大量報道[5-9]。與魚類相似，兩棲動物的幼體在水中發育，成體也不能脫離對水環境的依賴。尤其有文獻證實，一些兩棲動物種的性腺分化對雌激素敏感，在雌激素類物質的誘導下可出現從雄到雌的逆轉或者雌雄兩性[10-14]。因此，環境雌激素對兩棲動物的生殖內分泌干擾作用受到關注。

目前有關環境雌激素對兩棲動物生殖內分泌干擾作用的研究，主要集中在長期暴露對性腺分化和發育的影響。Hayes等[10]報道非洲爪蟾暴露低劑量阿特拉津46 d可導致雄性體內睪酮水平顯著下降，并出現雌雄兩性個體。樹蛙暴露雌二醇108 d導致性別比顯著偏向雌性，出現間性個體，并促進肝臟中vtg2、hdlbp、dhcr7等基因表達[14]。長期暴露研究雖然能夠較為真實地揭示環境暴露的負面效應，但是存在研究周期長、耗時耗力等缺點。所以探索短期暴露的研究方法，尋找相對敏感的終點指標，對于高效快速地評價環境雌激素對兩棲動物的生殖內分泌干擾作用具有重要的意義。

基于此，本文選擇對雌激素敏感的非洲爪蟾(Xenopus laevis)為實驗動物，以典型雌激素E2為模式化合物，研究雌激素對性腺和輸卵管形態以及性二態性基因表達的影響，篩選對雌激素敏感的終點指標，為后續建立評價化學品對兩棲動物雌激素效應的短期試驗方法提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：離心機(5415R，Eppendorf Centrifuge)、組織碾磨儀(MM301，Retsch)、超微量紫外可見分光光度計(ND-1000，Nanodrop)、熒光定量 PCR 儀(Lightcycler 480，Roche)、石蠟切片機(2135，Leica)、體式顯微鏡(XTL0745，重慶光電儀器有限公司)、數碼相機(COOLPIX995，尼康)。

試劑：MS-222、E2購自美國Sigma公司，動物飼料購自香港Totoro Supplies公司，Trizol、 FastQuant RT Kit試劑盒、RNase-free H2O、SYBR Green Mix試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，異丙醇、乙醇、苦味酸、甲醛、冰醋酸、二甲苯、氯仿均為分析純，購自北京化學試劑公司，熒光定量PCR引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2 實驗動物和短期暴露

本實驗室飼養的非洲爪蟾，雌雄分開飼養于盛有除氯水的玻璃缸中，水溫(22±2)℃, 明暗光周期為12 h:12 h。每日喂食1次面包蟲，每周喂食2次1:1配比的豬肝和動物飼料，喂食2 h后換水。

暴露實驗選取個體發育一致且活躍的非洲爪蟾(變態后6個月)雌雄各5只，20 L玻璃缸中加18 L除氯水，暴露10 nmol·L-1E2，同時設置空白對照。暴露6 d，每天喂食面包蟲，喂食2 h后換水，換水后重新加藥以維持暴露濃度。

1.3 取樣

6 d暴露結束后，用MS-222麻醉非洲爪蟾，稱量體重，冰上解剖。取腦及部分性腺，液氮凍存，用于性二態基因表達分析；另取部分性腺浸入Bouin氏固定液，用于組織學結構檢測；取腎臟(兩側附著輸卵管)浸入Bouin氏固定液，于體式顯微鏡下觀察輸卵管形態并照相。

1.4 性腺和輸卵管形態學和組織學檢查

腎臟(附著輸卵管)經Bouin氏固定液固定2 h后取出，于體視顯微鏡下觀察輸卵管形態并照相。

性腺在Bouin氏固定液中固定過夜，取出，于體視顯微鏡下觀察形態并照相。隨后進行組織學切片分析：流動水沖水后梯度酒精(70%、80%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機切片，切片厚度6 μm，蘇木素、伊紅染色后樹膠封固，在顯微鏡下觀察并照相。

1.5 性二態基因表達分析(qRT-PCR)

腦、性腺組織勻漿后用Trizol提取總RNA，紫外可見分光光度計測定RNA濃度及質量，保證吸光度A260 nm/A280 nm在1.8～2.0，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度。 1 μg RNA用于反轉錄合成第一鏈cDNA，操作根據FastQuant RT Kit試劑盒說明書進行，反轉錄后合成的cDNA產物保存于-20℃用于后續PCR擴增。

根據實驗室積累的研究數據，選擇5個性激素合成轉化相關基因(Srd5α、cyp11a1、3βHSD、cyp17、ARO)、3個性激素合成調控基因(GnRH、LHβ、FSHβ)以及8個性別分化和性腺發育相關基因(AR、ERα、Dmrt1、Dax、Emi2、TFⅢA、TBPL2、Sox3)作為候選基因，通過研究這些基因表達對E2的響應，篩選對其敏感的基因。使用 Primer Premier 6.0軟件設計引物，引物序列及相關信息見表1。qPCR根據SYBR Green Mix試劑盒說明書進行操作，基因表達水平用2-ΔΔCt方法處理，內參基因為rpl8。

1.6 數據分析

腦和性腺中基因的表達數據采用SPSS16.0進行統計分析，數據結果以均值±標準差表示，E2處理組與對照組之間的顯著性差異用獨立T檢驗分析(*表示 p<0.05)，圖形采用Origin 6.0軟件繪制。

表1 熒光定量PCR引物信息

2 結果(Results)

2.1 E2暴露對性腺和輸卵管組織形態的影響

E2暴露對精巢和卵巢的整體形態沒有明顯影響，但從組織學結構來看，一定程度上促進了精子和卵的發育。由精巢組織學觀察結果可見，正常的非洲爪蟾精巢(圖1a)由眾多生精小管緊密排列組成，生精小管中緊貼管壁排列著不同發育時期的生殖細胞：精原細胞(sg)、精母細胞(sc)、精細胞(st)，管腔中間可見零散分布著少量精子(sz)。10 nmol·L-1E2暴露促進精巢的發育(圖1b)，生精小管變大，管腔中間精子(sz)數目顯著增多，成簇排列。卵巢組織學觀察結果顯示，相比對照(圖1c)，6 d的E2暴露對卵巢的組織結構沒有顯著的改變(圖1d)，但略促進卵母細胞發育。對照組卵巢中卵母細胞均處于Ⅰ期(直徑50～300 μm)。10 nmol·L-1E2處理后，卵巢中除了Ⅰ期卵母細胞外，同時存在Ⅱ期卵母細胞(直徑300～450 μm)。

正常性腺發育過程中，雌性的繆勒氏管分化為輸卵管，成為重要的第二性特征。對照中腎臟兩側輸卵管已明顯發育，但整體形態比較直挺，彎曲較少(圖2a)，而10 nmol·L-1E2處理6 d后(圖2b)，腎臟兩側輸卵管變粗變長，出現多個彎曲盤旋，E2顯著促進了輸卵管的發育。

2.2 E2暴露對性腺和腦中性二態基因表達的影響

2.2.1 對性激素合成轉化相關基因及上游調控基因表達的影響

圖3顯示E2暴露6 d后腦和性腺中性激素合成轉化相關基因cyp11a1、3βHSD、cyp17、Srd5α、ARO的表達水平。性激素合成轉化通路中的cyp11a1、3βHSD、Srd5α基因，精巢中表達水平顯著高于卵巢中表達；E2暴露后，cyp11a1、3βHSD基因在精巢和卵巢中的表達均降低，精巢中Srd5α的表達也受抑制。ARO為卵巢中高表達基因，E2暴露后ARO在卵巢中的表達下調了2.5倍。腦中這些基因的表達均沒有顯著雌雄差異，且不受E2影響。

腦中GnRH、FSHβ、LHβ調控激素的合成和轉化。在正常情況下，雄性中GnRH表達高于雌性，而雌性中FSHβ、LHβ表達高于雄性。E2暴露后雌雄個體腦中FSHβ、LHβ表達水平均受顯著抑制：與對照相比，E2暴露使雌雄腦中FSHβ的表達分別下調250倍和50倍，LHβ的表達分別下調1500倍和500倍，且不存在雌雄表達差異。E2暴露不影響腦中GnRH的表達(圖4)。

圖1 E2暴露對非洲爪蟾性腺組織學的影響(a. 對照組精巢；b. E2暴露組精巢；c. 對照組卵巢；d. E2暴露組卵巢；sg. 精原細胞；sc. 精母細胞；st. 精細胞；sz. 精子；Ⅰ.Ⅰ期卵母細胞；Ⅱ. Ⅱ期卵母細胞)Fig. 1 Effects of E2 on gonad histology in Xenopus laevis

圖2 E2暴露對非洲爪蟾輸卵管的影響(a. 對照組輸卵管；b. E2暴露組輸卵管；K. 腎臟；OD. 輸卵管)Fig. 2 Effects of E2 on oviductive morphology in Xenopus laevis

2.2.2 對性別分化及性腺發育相關基因表達的影響

正常情況下，Dmrt1、Dax、AR、ERα、TFⅢA在精巢中高表達(圖5a)，精巢中的表達分別是卵巢中的120倍、30倍、3倍、2倍、4.5倍。腦中這些基因的表達沒有性別差異。E2暴露對性腺中這些基因表達沒有影響，但使腦中Dmrt1的表達下調。

Sox3、Emi2、TBPL2在卵巢中高表達，卵巢中的表達水平分別是精巢中的1200倍、50倍、37倍。腦中這些基因的表達沒有性別差異。E2暴露促進卵巢中Sox3的表達，對Emi2、TBPL2的表達則無影響。而在腦中，E2暴露促進雌雄腦中Emi2的表達(圖5b)。

圖3 E2暴露對性激素合成轉化相關基因表達的影響Fig. 3 Effects of E2 on mRNA expression of the genes that are related to sex hormone synthesis and conversion in Xenopus laevis

圖4 E2暴露對非洲爪蟾腦中GnRH、FSHβ、LHβ表達的影響Fig. 4 Effects of E2 on mRNA expression of GnRH, LHβ and FSHβ in Xenopus laevis brains

3 討論(Discussion)

有眾多研究證實，雌激素類物質長期暴露可影響兩棲動物的性腺發育，導致性腺形態和組織學結構出現雌性化特征[14-17]。本研究結果顯示，短期E2暴露對精巢及卵巢形態基本沒有影響，對組織結構的影響也并不十分明顯，只是對精子和卵的發育有一定的促進作用。顯示外源雌激素對性腺發育的影響需要一定時間累積。因此，性腺形態和組織學結構不適合作為短期暴露評價雌激素效應的指標。但是，6 d的E2暴露對第二性特征輸卵管有顯著影響，導致輸卵管明顯變粗變彎曲。Pettersson等[17]研究了乙炔雌二醇(EE2)長期暴露對熱帶爪蟾生殖器發育的影響，結果發現10 nmol·L-1EE2暴露蝌蚪9個月后組織形態學觀察發現所有性腺均呈現卵巢特性，且約有40%的卵巢沒有輸卵管，含有輸卵管的個體其輸卵管軀體指數(輸卵管重量/身體重量)相比對照升高，100 nmol·L-1EE2則顯著增加輸卵管軀體指數。因此輸卵管可能是一個對雌激素十分敏感的器官，可作為評價化學品短期暴露對非洲爪蟾雌激素效應的形態指標。

圖5 E2暴露對性別分化和性腺發育相關基因表達的影響Fig. 5 Effects of E2 on mRNA expression of the genes that are related to sexual differentiation and gonadal development in Xenopus laevis

脊椎動物的性腺發育受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)的調節和控制，激素及其受體在信息傳遞過程中起了重要作用[18]。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素GnRH促進垂體分泌黃體生成素LH和促卵泡激素FSH，隨后FSH、LH作用于性腺，刺激性腺合成相應性激素。本文研究結果顯示，10 nmol·L-1E2暴露 6 d后，腦中LHβ、FSHβ的表達顯著抑制。與我們的研究結果類似，Li等[19]用炔雌醇(EE)暴露8周齡SD雄鼠7 d，結果發現在1 mg·kg-1劑量下即可引起血清中LH和FSH的水平顯著下降，在10 mg·kg-1劑量下血清中睪酮水平也顯著下調。cyp11a1、3βHSD、cyp17、ARO、Srd5α等基因參與了膽固醇合成激素的過程：cyp11a1編碼P450 11-羥化酶催化膽固醇轉化為孕烯醇酮，孕烯醇酮在3β-羥基類固醇脫氫酶(3βHSD)作用下轉化為孕酮，隨后孕酮由cyp17編碼的P450 17-羥化酶催化轉化為雄烯二酮，進而轉化形成睪酮。在精巢中，睪酮經5α-還原酶(Srd5α)作用生成活性更強的雙氫睪酮；在卵巢中，睪酮則在芳香化酶(ARO)作用轉變為雌二醇。本文研究結果顯示，10 nmol·L-1E2暴露 6 d后，性腺中激素合成轉化重要基因cyp11a1、3βHSD、ARO、Srd5α的表達均受到顯著抑制，cyp17的表達水平不受影響。Liu等[20]的研究顯示，25 ng·L-1乙炔雌二醇(EE2)暴露7 d可抑制稀有鮈鯽性腺中cyp11a1、cyp17、cyp19的表達，但對3βHSD沒有影響。Overturf等[21]的研究結果則表明黑頭呆魚暴露左炔諾孕酮(LNG)28d后可引起FSH、3βHSD、ARO、ERβ表達顯著下調，但對LHβ、cyp11a1、cyp17、AR、ERα的表達沒有影響。這些結果與本文研究結果基本一致，顯示在短期暴露下，性激素的合成及轉化相關基因Srd5α、cyp11a1、3βHSD、ARO 以及上游調控基因LHβ、FSHβ對雌激素的作用十分敏感，且6 d暴露后產生的效應與長期暴露數據基本吻合，可以作為短期暴露篩查化學品雌激素效應的分子指標。

兩棲動物的性別決定是由基因控制的，但性激素的暴露可干擾正常的性別分化[22-23]。Dmrt1、Dax、AR、ERα、TFⅢA、Sox3、Emi2、TBPL2是性別分化和性腺發育相關的重要基因。本文研究了E2暴露對這些基因表達的影響，結果發現E2導致腦中Dmrt1的表達下調，促進腦中Emi2及卵巢中Sox3的表達，對其他基因的表達沒有顯著影響。在脊椎動物中，Dmrt1被認為與性腺發育有重要關聯，主要在非洲爪蟾精巢中表達，卵巢中水平很低[24]。Sox家族基因也是重要的性別決定基因，其中Sox3被認為是重要的X決定基因[25]。Emi2基因則是非洲爪蟾卵母細胞減少分裂過程中重要的生長抑制因子，對卵母細胞的發育起重要調節作用[26]。文獻報道顯示，成年斑馬魚暴露25 ng·L-1EE2 兩周，顯著抑制精巢中Dmrt1的表達，對AR、ERα、ARO的表達則無顯著作用[27]。由此可見，雌激素暴露會在一定程度上干擾性別決定基因的表達，產生一定雌激素干擾效應。但整體而言，除Sox3外，雌激素暴露對性別分化和性腺發育相關基因的影響并不十分明顯。

綜上所述，本研究發現輸卵管對雌激素的短期暴露十分敏感，可作為評價化學品對兩棲動物的雌激素效應的形態指標，并可發展輸卵管重量、盤曲數及相關基因表達水平等定量指標。同時，性腺中Srd5α、cyp11a1、3βHSD、ARO、Sox3和腦中LHβ、FSHβ、Emi2、Dmrt1對雌激素的短期暴露也十分敏感，可作為研究化學品雌激素效應的分子指標。以上結果為后續建立評價化學品對兩棲動物雌激素效應的短期試驗方法提供了參考。

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◆

Initial Evaluation on Gonadal and Oviductive Morphology and Sexually Dimorphic Gene Expression ofXenopuslaveisafter Short-term Exposure to 17 beta-Estrodiol

Xu Wei1, Lou Qinqin2, Wei Wuji1,*, Qin Zhanfen2

1. College of Environment, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China 2. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

19 May 2014 accepted 9 June 2014

Reproductive endocrine disruption by environmental estrogens in amphibians has aroused great concern. The research in the field was focused on effects of long-term exposure on gonadal differentiation and development. In this study, Xenopus laevis frogs (6 month old) were exposed to 10 nmol·L-1estradiol (E2, a model compound) for six days to investigate the effects on gonadal and oviductive morphology as well as mRNA expression of sexually dimorphic genes. It was found that 6-day exposure to E2 had no significant effect on testicular and ovarian morphology, whereas it seemed to exhibit a weak promoting effect on egg and sperm development. E2 made oviducts widen and curve, exhibiting a promoting effect on oviductive development. Compared with the control, E2 exposure significantly inhibited expression levels of cyp11a1, 3βHSD, Srd5α and ARO, which are related to sex hormone synthesis and transformation, in testis and ovary, with no effect on the expression of cyp17. E2 also decreased LHβ and FSHβ expression in brain. Several genes that are related to sex differentiation and gonadal development, including Dax, AR, ERα, TFⅢA and TBPL2, were not affected by E2 at the transcriptional levels. By contrast, E2 significantly promoted Sox3 expression in the ovary and Emi2 in the brain, and inhibited Dmrt1 expression in the brain. Therefore, oviductive morphology and the expression levels of Srd5α, cyp11a1, 3βHSD, ARO and Sox3 in the gonad as well as LHβ, FSHβ, Dmrt1 and Emi2 in the brain can be used as sensitive endpoints. Our study can provide technical reference for developing a short-term assay for evaluating estrogenic effects of chemicals on amphibians.

17 beta-estrodoil; Xenopus laevis; estrogenic effect; oviduct; gonad; sexually dimorphic genes

國家自然科學基金項目(21377153；21077125)

徐偉(1989-)，男，碩士，研究方向為毒理學，E-mail: xuwei07415224@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: weiwujipg@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140519001徐偉, 樓欽欽, 魏無際, 等. 雌二醇短期暴露對非洲爪蟾性腺和輸卵管形態及性二態基因表達影響的初步研究[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(1): 263-270

2014-05-19 錄用日期：2014-06-09

1673-5897(2015)1-263-08

X171.5

A

魏無際(1955—)，男，應用化學碩士，南京工業大學環境學院副院長、教授，主要研究方向金屬表面緩蝕劑的制備與應用，有機高分子化合物的合成及改性、工業水處理。

Xu W, Lou Q Q, Wei W J, et al. Initial evaluation on gonadal and oviductive morphology and sexually dimorphic gene expression of Xenopus laveis after short-term exposure to 17beta-estrodiol [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(1): 263-270 (in Chinese)