丹參病程相關蛋白基因PR10的克隆與表達分析

趙 樂，馬利剛，王志霜，申 業，鄭曉珂

（1河南中醫學院藥學院，鄭州450046；2中國中醫科學院中藥資源中心，北京100700）

丹參病程相關蛋白基因PR10的克隆與表達分析

趙 樂1，馬利剛1，王志霜2，申 業2，鄭曉珂1

（1河南中醫學院藥學院，鄭州450046；2中國中醫科學院中藥資源中心，北京100700）

病程相關蛋白（PR）的產生與積累是植物體應對生物或非生物脅迫的主要特征之一。該研究以人工培養的丹參幼苗為材料，通過分析丹參轉錄組數據，根據丹參病程相關蛋白基因PR10的序列設計特異性引物，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）從丹參中獲得PR10基因的開放閱讀框（ORF），命名為SmPR10－1（GenBank注冊號KF877034），并進行原核表達和純化。結果表明：（1）SmPR10－1基因ORF為477bp，編碼158個氨基酸，其蛋白質分子質量為17.38kD。（2）通過蛋白結構預測、序列多重比對和構建進化樹等生物信息學分析，發現SmPR10－1基因具有保守序列（G－X－G－G－X－G）和（K－A－X－E－X－Y），其編碼蛋白與葡萄等雙子葉植物中的PR10蛋白同源性較高。（3）經異丙基β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）誘導，含有表達載體pET32a－SmPR10－1的大腸桿菌（Escherichia coli BL21）可誘導表達融合蛋白；對影響蛋白表達的4個因素優化結果表明，SmPR10－1蛋白的最佳表達條件為：IPTG終濃度0.4mmol／L、起始宿主菌密度A600為0.8、誘導溫度30℃、誘導時間8h，并得到純化的SmPR10－1蛋白。該結果為進一步研究SmPR10－1基因在丹參抗病方面的生物學功能和培育丹參抗病品種奠定了基礎。

丹參；病程相關蛋白；生物信息學分析；原核表達；條件優化

植物在受到真菌、細菌和病毒等病原微生物侵染或受到非生物脅迫時會誘導表達并積累病程相關（pathogenesis－related，PR）蛋白，這類蛋白是植物防御體系的重要組成部分［1］。PR蛋白為多基因編碼，根據氨基酸序列的相似程度、血清學關系和生物學活性，目前分為17類［2］。它們在不同的植物中表現為幾丁質酶、葡聚糖苷酶、蛋白酶抑制劑、內肽酶和過氧化物酶等，在植物自我防御機制中作為可被誘導的組分發揮作用。

隨著對PR蛋白研究的深入，發現PR蛋白不僅在被侵染組織中誘導表達，而在整個植株中都有表達，與系統獲得性抗性（systematic acquired resistance，SAR）有關，被認為是SAR的一個顯著標志。PR10類蛋白屬于類核糖核酸酶，可以降解RNA，有抗細菌和抗真菌的活性［3］，有關病毒［4－5］、細菌［6］、真菌［7－9］等病原菌誘導PR10蛋白表達的研究已有廣泛報道，作為植物防御系統中的可誘導表達組分，PR10蛋白受多種病原菌的誘導表達，同時PR10蛋白在不同組織、器官及發育時期都有表達，屬于組成型表達。植物激素和防御相關的信號分子，包括茉莉酸［10］、脫落酸［11］、水楊酸［12］、赤霉素、茉莉酸甲酯、乙烯也能夠調節PR10蛋白的表達。

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，以其干燥根及根莖入藥，在臨床上被廣泛應用于心腦血管疾病以及各種炎癥的治療，是重要的大宗藥材，也是栽培面積較大的藥材之一。在人工栽培條件下，由于藥田生態環境中生物群落多樣性差、豐富度低，病蟲害優勢種群突出，常常發生嚴重的病蟲害，導致藥材產量下降，品質變劣，降低丹參藥用品質，影響臨床藥效。近年來，有關丹參的研究多集中在二萜類化合物丹參酮合成途徑關鍵基因的克隆上［13－14］，而對于丹參抗病基因的研究則少有報道。

在對課題組前期得到的大量丹參轉錄組數據的分析中，發現多個植物病程相關基因，本研究采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）從丹參中得到了植物病程相關蛋白基因PR10的cDNA全長，將其構建得到含有SmPR10－1的重組質粒pET32a－SmPR10－1，導入大腸桿菌BL21（DE3）中，進行體外誘導表達，并對IPTG濃度、誘導時間、溫度等培養條件進行優化，篩選SmPR10－1蛋白的最適表達條件，為進一步研究SmPR10－1基因在丹參抗病中的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）種子采自陜西商洛，種植于人工氣候箱內，光照強度為3 000 lx，光周期為光照16h／黑暗8h，溫度25℃。種子萌發，長出4片真葉后，移至培養罐中，每個培養罐4顆幼苗，每隔3d換1次Hoagland營養液，培養60d的丹參幼苗做為實驗材料，取根、莖、葉，樣品采集后液氮冷凍，保存于－80℃冰箱中。表達宿主菌E.coli BL21（DE3）及原核表達載體pET－32a（＋）為本實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 SmPR10－1基因克隆與序列分析 采用Trizol法從丹參根中提取總RNA，用NanoDrop 2000進行含量測定，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以提取的RNA為模板，以oligo（dT）18primer為反轉錄引物，按照RevertAid H Minus Reverse Transcriptase試劑盒（Fermentas公司）說明合成cDNA。根據轉錄組數據中PR10基因的序列信息，利用Primer 5設計PR10基因編碼區的特異引物，正向引物SmPR－10－M1（5′－CGGAATTCATGGGTGTGATCA－3′，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）；反向引物SmPR－10－M2（5′－CCGCTCGAGTGTAGTCGGGGTT－3′，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點），以反轉錄得到的丹參cDNA為模板，擴增SmPR10－1基因的ORF，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根公司）回收目的片段，將回收的PCR產物與pGEM－T Easy vector連接，轉化DH5α菌株，在含有氨芐青霉素的LB平板上進行培養，挑取單克隆，經菌液PCR和電泳檢測后，挑選陽性克隆送北京華大基因公司測序，將測序結果與轉錄組數據中的PR10基因序列進行比對，保存序列一致的陽性克隆，準備構建原核表達載體。

通過ExPASy在線服務器的Compute pI／Mw（http：／／web.expasy.org／compute＿pi／）預測SmPR10－1基因編碼蛋白質的相對分子量與理論等電點，TargetP 1.1server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）預測該蛋白的亞細胞定位，SignalP 4.1server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進行信號肽分析，TMHMM server v.2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）進行跨膜域分析，PredictProtein server（http：／／www.predictprotein.org／）進行二級結構預測，SWISSMODEL（http：／／swissmodel.expasy.org／）進行三維同源建模。用DNAMAN軟件對序列進行多重比對，用Clustal W軟件與其他植物PR10蛋白的氨基酸序列進行比較，采用MEGA4軟件的相鄰連接法（neighbor－joining）構建系統進化樹，bootstrap重復次數為1 000次。

1.2.2 SmPR10－1原核表達載體的構建與鑒定

用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對原核表達載體pET－32a（＋）和測序正確的pGEM－T Easy－SmPR10－1質粒進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收載體片段和目的基因片段，T4DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物轉化E.coli BL21（DE3）感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，挑取單克隆，經菌液PCR和雙酶切鑒定，挑選陽性克隆送北京華大基因公司測序。

1.2.3 SmPR10－1的誘導表達 挑取測序正確的陽性克隆，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃培養過夜后，按照1∶100比例稀釋到含氨芐青霉素的LB液體培養基中，220r／min振蕩培養至對數生長期（A600為0.6），然后針對誘導溫度（15、20、25、30、37℃）、誘導時間（4、6、8、20h）、IPTG濃度（0.1、0.4、0.8、1.0mmol／L），及A600（即誘導起始宿主菌密度0.4、0.6、0.8、1.0）這4個影響原核表達產物積累的因素，當研究其中1種因素時，固定其他3個因素不變，分別分析了這4個因素對丹參SmPR10－1重組蛋白表達的影響。

1.2.4 重組SmPR10－1蛋白的純化 根據優化的誘導表達條件，在大腸桿菌中大量表達重組SmPR10－1蛋白，獲得菌體，超聲破碎，破碎液在4℃，12 000r／min離心30min，取上清液經0.45μm濾膜過濾，采用Ni2＋親和層析方法，利用Ni Sepharose 6Fast Flow Purification System（GE Health－care）樹脂對濾液進行純化，然后用不同濃度的咪唑梯度洗脫，SDS－PAGE電泳檢測洗脫樣品，收集單一目的條帶樣品進行透析，透析后樣品經超濾管濃縮，用Bradford方法對蛋白進行定量，冷凍干燥，－70℃保存。

2 結果與分析

2.1 SmPR10－1的基因克隆與序列分析

通過對課題組前期得到的丹參轉錄組數據進行分析，根據PR10基因ORF設計特異性引物，擴增得到500bp左右的條帶（圖1），與轉錄組數據中PR10基因開放閱讀框（ORF）大小一致，測序結果表明SmPR10－1基因的OFR為477bp，編碼158個氨基酸，分子量為17.38kD，等電點pI為5.23。

SignalP 4.1server預測，SmPR10－1蛋白不含信號肽，TargetP 1.1server預測，顯示SmPR10－1蛋白定位于細胞質，TMHMM server預測該蛋白不含跨膜域。用PredictProtein對SmPR10－1蛋白的二級結構進行預測，結果顯示在該蛋白中α－螺旋結構占21.52%，β－折疊占34.81%，無規則卷曲占43.67%（圖2，A）。用SWISS－MODEL以櫻桃的allergen Pru av 1蛋白為模板（PDB ID：1e09），預測SmPR10－1蛋白的三維結構（圖2，B）。結果顯示SmPR10－1蛋白包含一個C端由28個氨基酸組成的α螺旋，7個β折疊以及N端在β1和β2折疊之間的1個的短α螺旋。保守的P－loop基序（G－X－GG－X－G）位于β2和β3之間，C端有（K－A－X－E－X－Y）的保守序列（圖2，A）。三級結構與已經報道的PR10家族蛋白的空間結構具有很高的相似性，β－折疊在α－螺旋間反向平行排列，構成緊湊的α－β－α夾心結構，具有疏水作用和穩定的多重氫鍵，這個緊湊的結構可能決定了PR蛋白的高穩定性。

圖1 PCR擴增SmPR10－1基因的開放閱讀框Fig.1 PCR amplification of SmPR10－1 gene open reading frame M.DL2000；1.SmPR10－1ORF

將SmPR 1 0－1與NCBI GenBank中2 0種植物PR10蛋白進行比對，采用MEGA4軟件構建系統進化樹，結果（圖3）顯示，PR10聚為兩類，一類是單子葉植物PR10，另一類是雙子葉植物PR10，SmPR10－1歸屬于雙子葉植物類，與葡萄、人參親緣關系最近。

2.2 SmPR10－1基因的原核表達載體構建與鑒定

用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對原核表達載體pET－32a（＋）和測序正確的pGEM－T Easy－SmPR10－1質粒進行雙酶切，連接得到重組質粒pET32a－SmPR10－1，然后轉化E.coli BL21（DE3），挑取單克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定，都有500bp左右的目的條帶（圖4），陽性克隆測序結果顯示與目的基因SmPR10－1序列一致，未發生移碼突變，表明已成功將SmPR10－1基因克隆到原核表達載體pET－32a上。

2.3 SmPR10－1蛋白的原核表達條件的優化

2.3.1 IPTG濃度對SmPR10－1表達的影響 保持誘導時間8h、誘導溫度30℃及起始A600為0.6不變，在0.1、0.4、0.8、1.0mmol／L這4個IPTG濃度下，觀察發現IPTG濃度在0.1～1.0mmol／L對SmPR10－1表達量影響不明顯（圖5）。

圖2 SmPR10－1蛋白的結構預測A.二級結構預測；B.三維結構預測Fig.2 Prediction of SmPR10－1protein structure A.Secondary structure prediction；B.Prediction of three－dimensional structure

圖3 SmPR10－1蛋白與其他物種PR10蛋白的系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of SmPR10－1protein and PR10proteins from other species

圖4 原核表達載體pET32a－SmPR10－1鑒定M.DL10000；1.EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pET32a－SmPR10－1載體；2.陽性克隆的PCR產物Fig.4 The identification of prokaryotic expression vector pET32a－SmPR10－1 M.DL10000；1.pET32a－SmPR10－1digested by EcoRⅠand XhoⅠ；2.PCR product of positive clone

2.3.2 誘導溫度對SmPR10－1表達的影響 保持誘導時間8h、IPTG濃度0.4mmol／L及起始A600為0.6不變，不同誘導溫度（15℃、20℃、25℃、30℃、37℃）下，發現溫度對SmPR10－1表達影響明顯，20～30℃誘導均有利于可溶性蛋白的表達，而15℃和37℃時蛋白表達量減少（圖6）。

2.3.3 A600對SmPR10－1表達的影響 保持誘導時間8h、誘導溫度30℃及IPTG濃度0.4mmol／L不變，觀察到在不同起始菌密度（A600為0.4、0.6、0.8、1.0）時加入誘導劑IPTG對SmPR10－1表達有影響，發現起始宿主菌密度（A600＝0.8）時，SmPR10－1表達量最高（圖7）。

2.3.4 誘導時間對SmPR10－1表達的影響 保持誘導溫度30℃、IPTG濃度0.4mmol／L及起始A6000.8不變，研究誘導時間（4、6、8、20h）對SmPR10－1表達的影響，觀察到誘導時間對蛋白表達量有明顯影響，隨著誘導時間的延長，蛋白表達量有隨之增加的趨勢（圖8）。

圖5 不同IPTG濃度對SmPR10－1蛋白表達的影響M.蛋白分子量標準；C1～C4.含pET32a空載體的E.coli菌株；1～4.分別在0.1、0.4、0.8、1.0mmol／L IPTG濃度誘導的含pET32a－SmPR10－1質粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.5 Effect of different IPTG concentrations on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C1－C4.E.coli containing pET32aused as contro；1－4.E.coli contains pET32a－SmPR10－1induced with 0.1，0.4，0.8and 1.0mmol／L IPTG，respectively.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

圖6 不同誘導溫度對SmPR10－1蛋白表達的影響M.蛋白分子量標準；C.含pET32a空載體的E.coli菌株；1～5.分別在15℃，20℃，25℃，30℃，37℃誘導的含pET32a－SmPR10－1質粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.6 Effect of different temperature on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C.E.coli containing pET32aused as contro；1－4.E.coli contains pET32a－SmPR10－1induced at 15℃，20℃，25℃，30℃，37℃，respectively.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

圖7 不同起始宿主菌密度（A600）對SmPR10－1蛋白表達的影響M.蛋白分子量標準；C1～C4：含pET32a空載體的E.coli菌株；1～4.分別在A600為0.4、0.6、0.8、1.0條件下誘導的含pET32a－SmPR10－1質粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.7 Effect of different initial density of host bacterium（A600）on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C1－C4.E.coli contains pET32aused as contro；1－4.E.coli containg pET32a－SmPR10－1induced at 0.4，0.6，0.8and 1.0A600，respectively.The arrowsshow the recombinant SmPR10－1protein

圖8 不同誘導時間對SmPR10－1蛋白表達的影響M.蛋白分子量標準；C1～C4.含pET32a空載體的E.coli菌株；1～4.分別誘導4、6、8、20h的含pET32a－SmPR10－1質粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.8 Effect of different inducing time on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C1－C4.E.coli contains pET32aused as control；1－4.E.coli containg pET32a－SmPR10－1 induced with 4，6，8，20h，respectively.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

2.4 重組SmPR10－1蛋白的純化

根據優化的條件，IPTG濃度0.4mmol／L、起始A600為0.8、誘導溫度30℃、誘導時間8h，將重組SmPR10－1蛋白在大腸桿菌中大量表達，收集大腸桿菌菌體，超聲破碎，破碎液經過離心取上清液，采用Ni2＋親和層析方法，利用Ni Sepharose 6Fast Flow Purification System（GE Healthcare）樹脂進行純化，得到目的蛋白SmPR10－1（圖9），Bradford法測得純化蛋白濃度為1.02mg·mL－1。

圖9 重組SmPR10－1蛋白的純化M.蛋白分子量標準；1.含pET32a空載體的E.coli菌株作為對照；2.優化條件下誘導的含pET32a－SmPR10－1質粒的E.coli菌株；3、4.純化后的重組SmPR10－1蛋白（3∶2μg上樣；4∶5μg上樣）。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.9 Purification of recombinant SmPR10－1protein M.Protein marker；1.E.coli containing pET32aused as control；2.E.coli contains pET32a－SmPR10－1induced under optimized conditions；3，4.The purified recombinant SmPR10－1protein（3∶2μg；4∶5μg）.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

3 討 論

丹參為多年生草本植物，以根入藥，在人工栽培條件下，易受到各種病蟲害的危害，若長期大量使用農藥，一方面易使病蟲害產生抗藥性，另一方面農藥殘留會降低丹參的藥用品質，影響丹參臨床藥效。因此從丹參自身挖掘抗性相關基因，培育抗病品種，才是緩解丹參病蟲害的根本途徑。本研究從丹參中克隆得到病程相關蛋白10基因SmPR10－1，對其核酸及其推測的氨基酸序列分析發現，SmPR10－1基因編碼蛋白的N端有典型的富含甘氨酸的P－loop基序（G－X－G－G－X－G），C端有（K－A－X－E－X－Y）的保守序列，說明SmPR10－1蛋白是PR10蛋白家族中的成員（Van Loon［2］、Fernandes［15］）。SmPR10－1蛋白不含信號肽，作為細胞質蛋白發揮作用，這與其他PR家族蛋白不同，其它PR家族蛋白大多是位于胞外，具有信號肽序列，先是作為蛋白前體合成，然后在分泌過程中形成成熟蛋白［16］。

大腸桿菌是常用的外源蛋白質表達系統之一，影響外源蛋白可溶性表達的因素有多方面，要增加可溶性蛋白的表達量，除了合理的選擇酶切位點、表達載體、宿主菌、試劑外，還可以通過改變培養條件來提高外源蛋白的可溶性表達量，如改變IPTG濃度［17］、誘導溫度［18］、誘導時宿主菌的密度（A600）［19］和誘導時間［18］等。本研究將目的基因SmPR10－1構建到表達載體pET32a上，形成重組質粒pET32a－SmPR10－1，然后轉化E.coli BL21（DE3），進行蛋白表達。pET32a載體是帶有N－端硫氧還蛋白（Trx·Tag）編碼序列的融合表達載體，當外源重組蛋白在E.coli中以不溶形式存在時，和Trx· Tag序列融合后，可增加重組蛋白的溶解性［20］；此外，表達宿主菌BL21（DE3）可以增加存在于細胞質中蛋白質的二硫鍵的形成，使得蛋白的可溶性更好，同時，利用pET32a載體表達的重組蛋白N端帶有6個His Tag標簽，方便后續重組蛋白的純化［18］。

IPTG濃度、溫度、起始菌密度（A600）和誘導時間是影響原核表達的主要因素，本研究發現，IPTG濃度在0.1～1.0mmol／L對SmPR10－1蛋白表達量影響不明顯，最終選擇IPTG濃度為0.4mmol／L。溫度對SmPR10－1表達量有明顯影響，從15～37℃均能得到重組蛋白，但是15℃時溫度過低，不利于蛋白表達，在30℃時表達量最高，雖然在37℃時也有蛋白表達，但是和30℃條件下相比，表達量卻有所降低，這可能是37℃條件下大腸桿菌細胞各種代謝旺盛，生長加快，影響外源重組蛋白的表達，而且有可能使重組蛋白積累形成包涵體，而在25～30℃培養會形成可溶的、有活性的重組蛋白，最終選擇誘導溫度為30℃［21］。隨著誘導時間的延長，SmPR10－1的表達量也隨之增加，4h時表達量最低，8h與24h時表達量較高，但是誘導時間過長，重組蛋白的可溶性降低，可能形成包涵體，最終選擇8h作為最終誘導時間［22］。

本研究用分子克隆方法得到丹參SmPR10－1基因，通過構建原核表達載體，在大腸桿菌中得到成功表達，在優化表達體系為IPTG濃度0.4mmol／L、起始宿主菌密度A600為0.8、誘導溫度30℃、誘導時間8h的條件下，SmPR10－1在大腸桿菌中能夠得到很好的表達，采用Ni2＋親和層析得到了純化的目的蛋白，為進一步研究SmPR10－1蛋白的生物學活性，抗體制備和SmPR10－1基因在丹參抗病方面的生物學功能奠定了基礎。

參考文獻：

［1］ WEN Y J（溫韻潔），HE H W（何紅衛），HUANG Q SH（黃群聲），et al.Roles of pathogenesis－relative protein 10in plant defense response［J］.Plant Physiology Communications（植物生理學通訊），2008，44（3）：585－592（in Chinese）.

［2］ VAN LOON L C，REP M，PIETERSE C M J.Significance of inducible defense－related proteins in infected plants［J］.Annual Review of Phytopathology，2006，44：135－162.

［3］ EDREVA A.Pathogenesis－related proteins：research progress in the last 15years［J］.General and Applied Plant Physiology，2005，31（1－2）：105－124.

［4］ PüHRINGER H，MOLL D，HOFFMANN－SOMMERGRUBER K，et al.The promoter of an apple Ypr10gene，encoding the major allergen Mal d 1，is stress－and pathogen－inducible［J］.Plant Science，2000，152（1）：35－50.

［5］ PARK C J，KIM K J，SHIN R，et al.Pathogenesis－related protein 10isolated from hot pepper functions as a ribonuclease in an antiviral pathway［J］.The Plant Journal，2004，37（2）：186－198.

［6］ ROBERT N，FERRAN J，BREDA C，et al.Molecular characterization of the incompatible interaction of Vitis viniferaleaves with Pseudomonas syringae pv.pisi：Expression of genes coding for stilbene synthase and class 10PR protein［J］.European Journal of Plant Pathology，2001，107（2）：249－261.

［7］ JWA N S，KUMAR AGRAWAL G，RAKWAL R，et al.Molecular cloning and characterization of a novel Jasmonate inducible pathogenesis－related class 10protein gene，JIOsPR10，from rice（Oryza sativa L.）seedling leaves［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，286（5）：973－983.

［8］ LIU J J，EKRAMODDOULLAH A K，YU X.Differential expression of multiple PR10proteins in western white pine following wounding，fungal infection and cold－hardening［J］.Physiologia Plantarum，2003，119（4）：544－553.

［9］ MCGEE J D，HAMER J E，HODGES T K.Characterization of a PR－10pathogenesis－related gene family induced in rice during infection with Magnaporthe grisea［J］.Molecular Plant－Microbe Interactions，2001，14（7）：877－886.

［10］ RAKWAL R，AGRAWAL G K，YONEKURA M.Light－dependent induction of OsPR10in rice（Oryza sativa L.）seedlings by the global stress signaling molecule jasmonic acid and protein phosphatase 2Ainhibitors［J］.Plant Science，2001，161（3）：469－479.

［11］ WANG C S，HUANG J C，HU J H.Characterization of two subclasses of PR－10transcripts in lily anthers and induction of their genes through separate signal transduction pathways［J］.Plant Molecular Biology，1999，40（5）：807－814.

［12］ EKRAMODDOULLAH A K M，TAN Y，YU X，et al.Identification of a protein secreted by the blister rust fungus Cronartium ribicola in infected white pines and its cDNA cloning and characterization［J］.Canadian Journal of Botany，1999，77（6）：800－808.

［13］ GAO W，HILLWIG M L，HUANG L，et al.A functional genomics approach to tanshinone biosynthesis provides stereochemical insights［J］.Organic Letters，2009，11（22）：5 170－5 173.

［14］ DAI Z，CUI G，ZHOU S F，et al.Cloning and characterization of a novel 3－hydroxy－3－methylglutaryl coenzyme A reductase gene from Salvia miltiorrhizainvolved in diterpenoid tanshinone accumulation［J］.Journal of Plant Physiology，2011，168（2）：148－157.

［15］ FERNANDES H，MICHALSKA K，SIKORSKI M，et al.Structural and functional aspects of PR－10proteins［J］.FEBS Journal，2013，280（5）：1 169－1 199.

［16］ ZHANG Y（張 玉），YANG A G（楊愛國），FENG Q F（馮全福），et al.Plant pathogenesis－related proteins and research progress in tobacco［J］.Biotechnology Bulletin（生物技術通報），2012，5：20－24（in Chinese）.

［17］ BANEYX F.Recombinant protein expression in Escherichia coli［J］.Current Opinion in Biotechnology，1999，10（5）：411－421.

［18］ ROSANO G L，CECCARELLI E A.Recombinant protein expression in Escherichia coli：advances and challenges［J］.Frontiers in Microbiology，2014，5（4）：172.

［19］ CHOI J H，KEUM K C，Y LEE S.Production of recombinant proteins by high cell density culture of Escherichia coli［J］.Chemical Engineering Science，2006，61（3）：876－885.

［20］ YASUKAWA T，KANEI－ISHII C，MAEKAWA T，et al.Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin［J］.Journal of Biological Chemistry，1995，270（43）：25 328－25 331.

［21］ SCHEIN C H，NOTEBORN M H.Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature［J］.Nature Biotechnology，1988，6（3）：291－294.

［22］ GALLOWAY C A，SOWDEN M P，SMITH H C.Increasing the yield of soluble recombinant protein expressed in E.coli by induction during late log phase［J］.Biotechniques，2003，34（3）：524，526，528，530.

（編輯：宋亞珍）

Cloning and Expression Analysis of Pathogenesis－related Protein 10Gene of Salvia miltiorrhiza

ZHAO Le1，MA Ligang1，WANG Zhishuang2，SHEN Ye2，ZHENG Xiaoke1
（1School of Pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

The synthesis of pathogenesis－related proteins（PR）is one prominent feature of plant defense responses on abiotic or non－abiotic stress situations.According to the transcriptome data of Salvia miltiorrhiza，designing specific primers and using reverse transcription－polymerase chain reaction（RT－PCR），we isolated an open reading frame of pathogenesis－related protein 10（PR10）fromS.miltiorrhizaand named as SmPR10－1（GenBank Accession No.KF877034）.The results indicated that：（1）SmPR10－1has an open reading frame（ORF）of 477bp，which encoded a protein of 158amino acid residues，with a predicted molecular mass of 17.38kD.（2）Bioinformatic analysis indicated that SmPR10－1protein showed the highest homology，69%identity，with PR10protein fromVitis vinifera with the same conserved sequence（G－X－GG－X－G）and（K－A－X－E－X－Y）.（3）Escherichia coli BL21cells were transformed with the expression vector pET32a－SmPR10－1and used for prokaryotic expression.Meanwhile，the four factors，inducing IPTG concentrations，initial density of host bacterium（A600），inducing temperature and inducing time，which influenced protein expression，were optimized.The optimum expression conditions of SmPR10－1were final IPTG concentration of 0.4mmol／L，A600of 0.8，and the inducing time of 8hat 30℃.Finally，the recombi－nant SmPR10－1protein was purified through Ni2＋affinity chromatography.The results of this study provided not only the first and fundamental information about SmPR10－1gene，but also a candidate gene for future genetic engineering of Chinese medical herbs，S.miltiorrhiza，against pathogen attack.

Salvia miltiorrhiza；pathogenesis－related protein；bioinformatic analysis；prokaryotic expression；optimization of expression condition

Q785；Q786

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1078

1000－4025（2015）06－1078－07

2015－02－03；修改稿收到日期：2015－04－17

國家自然科學基金（81173490，8130070）；河南中醫學院博士科研基金（BSJJ2011－07）

趙 樂（1983－），男，博士，講師，主要從事藥用植物分子生物學研究。E－mail：zhaole1983＠126.com