芒果MSOC1基因的克隆與表達分析

魏軍亞，唐 杰，劉國銀，劉德兵＊，陳業淵

（1中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所／農業部熱帶作物種質資源利用重點開放實驗室，海南儋州571737；2海南大學農學院，海口570228；3海南大學應用科技學院，海南儋州571737）

芒果MSOC1基因的克隆與表達分析

魏軍亞1，唐 杰2，劉國銀3，劉德兵3＊，陳業淵1

（1中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所／農業部熱帶作物種質資源利用重點開放實驗室，海南儋州571737；2海南大學農學院，海口570228；3海南大學應用科技學院，海南儋州571737）

MADS－box轉錄因子在多種植物的發育過程、特別是花器官的發育過程中發揮著重要的作用。為研究MADS－box轉錄因子在芒果花器官發育中的作用，利用RT－PCR和RACE技術分離到1個芒果的SOC1基因，命名為MSOC1（GenBank登錄號為KP404094）。MSOC1編碼區為733bp，編碼223個氨基酸，蛋白質相對分子質量為25.6kD，理論等電點為8.96。序列比對和系統進化樹分析表明，MSOC1具有保守的MADS－box及半保守的K區，屬于MADS－box家族SOC1／TM3亞家族。組織特異性表達分析表明，MSOC1基因在芒果各個組織部位均有表達，但在莖、葉和花芽中表達量高，而在根和花中表達量低。

芒果；MSOC1；克隆；表達

高等植物開花受一系列內外因素的共同調控，許多特定基因在特定時空環境下表達及相互作用，以確保植物在適當的時間和地點發生從營養生長向生殖生長的轉變，從而保證植物在適宜時間開花［1］。開花相關基因的表達和調控是實現這一轉變過程的分子基礎，花分生組織特征基因和花器官特征基因絕大多數都是MASD－box類基因［2］。MASD－box基因是高等植物中一類重要的轉錄調控因子，參與植物的生長發育調控和信號傳導等多個方面，尤其在花發育調控中發揮關鍵作用。SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）基因是植物開花途徑中控制開花時間的基因，它整合了光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑等誘導開花途徑的各種信號，作用于下游花分生組織特異基因，促進植物的營養分生組織向花序分生組織轉變，從而促進植物的開花［3］。目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、非洲菊（Gerbera hybrida）、甜橙（Citrus sinensis）、大豆（Glycine max）等［4－9］多個物種中克隆到SOC1基因，研究發現SOC1基因除了能整合多種開花信號，還具有其他功能，如控制一年生擬南芥的生長習性［10］，參與天氣冷涼延遲開花、溫暖氣候促進開花的微調［11］等。

芒果是重要的熱帶、亞熱帶果樹，享有“熱帶果王”的盛譽，具有很高的經濟價值［12］。目前有關于芒果開花機理的分子生物學研究較少，眾多與開花有關的基因，如CO、FT、LFY、FLC、AP1等中，僅對LFY［13］和AP1［14］基因進行了一些研究。為克隆新的芒果開花有關的MADS－box基因，研究其在芒果花發育中的作用，本研究利用RT－PCR和RACE技術克隆得到1個芒果開花調控的重要轉錄因子SOC1基因的同源基因MSOC1的序列全長，進行了相關生物信息學分析，并研究分析了MSOC1基因在芒果植株不同組織部位的表達，以期為從分子水平上認識芒果成花機理等研究積累資料奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料呂宋芒（Carabao）采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所芒果種質資源圃。于2013年年12月15日采收呂宋芒花序，用液氮速凍后，保存在－80℃冰箱中備用，作為提取總RNA的植物材料，用于基因克隆研究。于2014年1月20日分別采收呂宋芒花芽、花以及根、莖、葉等器官，用液氮速凍后，保存在－80℃冰箱保存，用于基因的組織表達特異性分析。

1.2 MSOC1基因全長cDNA克隆

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 參照改良CTAB法［15］提取呂宋芒花序總RNA。將提取的總RNA取3μL在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測OD值，計算RNA濃度和純度。以1.0g總RNA為模板，Oligo（dT）primer為引物，采用TaKaRa PrimeScriptTMRTPCR Kit試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］合成cDNA第一鏈。

1.2.2 芒果MSOC1基因5′－RACE和3′－RACE及全長的克隆 以本實驗室前期通過簡并引物進行RT－PCR擴增得到一個MADS－box基因的保守片段為依據，分別設計3′－RACE和5′－RACE引物（表1），以上述花序組織反轉錄的cDNA為模板進行3′－RACE和5′－RACE擴增。RACE操作參照3′－Full RACE Core Set試劑盒和5′－Full RACE Core Set試劑盒（TaKaRa）推薦的方法進行。PCR反應條件為94℃變性5min后進入循環，循環參數為94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸2min，36個循環，72℃延伸10min。

根據5′－RACE和3′－RACE測序結果，將3′－RACE、5′－RACE和已知片段進行拼接獲得全長cDNA序列，根據拼接序列設計全長特異性引物SOC1－1和SOC1－2（表1），以花序組織反轉錄cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為：94℃預變性5min、94℃變性30s、55℃退火45 s、72℃延伸1.5min，30個循環；72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收與PMD18－T載體（Takara）連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆測序。

表1 PCR擴增所用引物及其序列Table 1 Primers required in PCR amplification

1.3 生物信息學分析

利用NCBI的BLAST工具進行同源分析；利用ORF（Open Reading Frame，ORF）Finder軟件尋找開放閱讀框；利用ProtParam軟件（http：／／web.expasy.org／protparam／）分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點等理化性質。采用Ex－PASy ProtParam軟件分析序列等電點。采用ClustalW和Mega軟件進行推導氨基酸序列的多序列比對和系統進化樹構建。

1.4 基因表達特性分析

采用半定量RT－PCR和實時熒光定量PCR檢測MSOC1基因在不同組織（花芽、花、根、莖和葉）的表達模式。其中，半定量RT－PCR程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，45℃退火45s，72℃延伸90s，35個循環；72℃延伸10min。每個反應3次重復，擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。采用SYBR?GreenⅠ嵌合熒光法進行實時定量PCR，反應體系為：10μL SYBR?Premix Ex Taq混合液，正、反向引物各1μL 2μL cDNA，加入ddH2O補足到20μL體系。反應程序為95℃預變性3min；然后95℃5s，60℃30s，共40個循環，試驗以Actin為內參基因，3次重復，2－△△Ct法［16］計算不同時間MSOC1基因相對表達量，應用Excel進行數據統計分析。

2 結果與分析

圖1 芒果MSOC1基因3′－RACE（A），5′－RACE（B）和全長ORF擴增結果（C）Fig.1 PCR products of 3′－RACE（A），5′－RACE（B）and full length ORF（C）of MSOC1gene M.DL2000

2.1 芒果MSOC1基因克隆與鑒定

以芒果花序cDNA為模板，利用RACE方法分別獲得789bp的3′端片段（圖1，A）和268bp的5′端片段（圖1，B）。將得到的3段序列（中間序列、3′端、5′端序列）在DNAMAN中進行序列拼接，根據拼接序列在ORF兩端設計引物進行PCR擴增，得到MSOC1基因的mRNA全長ORF序列（圖1， C），測序結果顯示，該PCR產物長度為733bp，測序結果與拼接序列相應片段完全一致。

通過NCBI的Blastx比對，發現該序列與四季芒（Siji Mangifera indica L.）的SOC1（GenBank登錄號為ADX97324.1）序列一致性達99%，其推導的蛋白序列具有MADS＿MEF2類保守結構域和K－box結構域，說明所克隆的基因屬于典型的MASD－box基因。因此，初步認為克隆得到了芒果SOC1基因，將其命名為MSOC1，GenBank登錄號為KP404094。

2.2 芒果MSOC1全長cDNA序列及生物信息學分析

利用NCBI在線工具分析芒果MSOC1的開放閱讀框，發現MSOC1基因編碼區由669個核苷酸組成，編碼1個含有223個氨基酸的蛋白質，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，且含有加尾信號AATAAA序列和polyA序列（圖2）。通過NCBI的Blastp比對發現，MSOC1基因的3～77位氨基酸為典型的MADS結構域，進一步分析發現，MSOC1基因的第75～170位氨基酸為一個K－box結構域。利用ExPASy ProtParam軟件分析其理化性質，推測該蛋白的分子式為C1108H1828N332O346S11，相對分子質量為25 689.3，預測其等電點（pI）為8.96。蛋白由20個氨基酸組成，其中負電荷系數［（Asp＋Glu）∶35］，正電荷系數［（Arg＋Lys）∶39］，該蛋白中相對含量較多的氨基酸是Glu（E）29占13.0%，Leu（L）22占9.9%，Arg（R）21占9.4%，Lys（K）18占8.1%，其中Pyl、Sec含量為0。不穩定系數為65.51，說明該蛋白是一個不穩定蛋白（40以下為穩定蛋白）。

將MSOC1基因推導的氨基酸序列和其他物種SOC1蛋白的氨基酸序列進行同源比對（圖3），結果發現該氨基酸序列與很多植物SOC1蛋白氨基酸序列具有較高的同源性。其中與四季芒（Siji Mangifera indica）SOC1蛋白氨基酸序列相似性最高，達99%；與荔枝（Litchi chinensis）SOC1蛋白氨基酸序列的相似性為72%；和甜橙（Citrus sinensis）SOC1蛋白氨基酸序列的相似性為74%。MADS－box結構域相似性在83%～100%之間，K－box結構域相似性在51%～65%之間。芒果MSOC1在C端具有一個SOC1／TM3亞家族特有的基序，說明所獲得的MSOC1屬于MADS－box基因家族中的SOC1／TM3亞家族。從系統進化樹也可以看出（圖4），MSOC1也與四季芒（（ADX97324.1）親緣關系較近，歸屬于MADS－box基因家族SOC1／TM3亞家族。

圖2 MSOC1基因核苷酸序列和推測氨基酸序列帶下劃線的堿基序列ATG表示起始密碼子；＊表示終止密碼子TGAFig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of MSOC1 The nucleotide sequence ATG with underlined means initiator codon；TGA with＊means terminator codon

圖3 不同植物SOC1氨基酸序列比對劃線部分為MADS－box、K－box結構域Fig.3 Alignment of amino acid sequences of SOC1from different plants The MADS－box and F－box are underlined

2.3 芒果MSOC1基因的器官特異表達分析

用半定量RT－PCR方法分析MSOC1在芒果不同組織的表達情況，結果如圖5所示，MSOC1基因在根部、莖部、葉片、花芽和花中均有表達，但是表達程度不同。在葉片中表達強度最高，其次是莖部、花芽和根，花中表達量最低。

為了進一步研究MSOC1在不同組織器官中的相對表達量，進行了熒光實時定量分析。結果顯示（圖6）與半定量結果一致。可見芒果MSOC1基因具有顯著的組織表達特異性。尤其在營養器官的根、莖和葉中特異表達，在花芽中也表達，而花的表達量最低。

圖4 芒果與其他物種中SOC1蛋白的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of SOC1in mango and other different species

圖5 MSOC1在芒果不同組織部位的表達Fig.5 Different expression levels of MSOC1 gene in different organs of M.indica

圖6 MSOC1在芒果不同組織部位的相對表達量Fig.6 The relative expression levels of MSOC1 gene in different organs of M.indica

3 討 論

近年來，隨著分子生物學的發展，參與調控植物花器官特征的MADS－box基因研究獲得了突破性的進展。其中SOC1作為開花時間調控路徑的結點基因，廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中［17］。SOC1整合了多條開花途徑的開花信號，不僅可調控開花時間，而且也能參與花器官形態建成［18］。Becker等［19］認為SOC1主要在營養器官中表達，在營養器官發育和營養生長向生殖生長轉變也起重要的作用。在擬南芥中SOC1在各個部位均表達，在莖尖中表達量最高，其表達量隨著營養生長的進程而增加，在成花轉變時表達量大量增加，與下游花分生組織特異基因共同作用完成成花轉變［20］。

本研究通過RT－PCR和RACE技術克隆得到芒果MSOC1基因，并對其亞家族的分屬和表達模式進行了分析。其推導的蛋白序列具有MADS＿MEF2類保守結構域和K－box結構域，屬于典型的MASD－box基因，在其C端具有一個SOC1／TM3亞家族特有的基序，系統發育樹分析將其屬于MADS－box基因家族中的SOC1／TM3亞家族。對MSOC1進行不同組織部位的表達分析表明，該基因在根、莖、葉、花和早期花芽中均有表達，且在根中表達水平較低，在葉片和莖中表達較高，花芽的表達量比葉片和莖稍低。在擬南芥中，SOC1基因是調控植物從營養生長向生殖生長轉變的重要基因［20］，由此推測芒果MSOC1基因可能調控芒果花芽分化前期的表達，在芒果營養生長向生殖生長轉變過程中起著重要作用。

SOC1整合了多條開花途徑的開花信號，調控花分生組織的建成。目前人們對模式植物擬南芥SOC1已經有了比較廣泛和深入的研究，但是仍然有許多問題沒有研究清楚，本研究得到MSOC1基因，為進一步深入研究基因表達模式和功能奠定了基礎。下一步將構建MSOC1植物表達載體，進行轉基因技術研究，以期在分子水平上揭示MSOC1基因在芒果調控營養生長向生殖生長轉變過程中的分子機制和作用機理。

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（編輯：宋亞珍）

Cloning and Expression Analysis of MSOC1 Gene in Mango（Mangifera indica L.）

WEI Junya1，TANG Jie2，LIU Guoyin3，LIU Debing3＊，CHEN Yeyuan1
（1Tropical Crops Genetic Resources Institute／Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences，Danzhou，Hainan 571737，China；2Agriculture College，Hainan University，Haikou 570228，China；3Applied Science and Technology College，Hainan University，Danzhou，Hainan 571737，China）

MADS－box transcription factor plays a crucial role in plant development，especially controlling the formation and development of floral organs.In order to investigate the role of MADS－box transcription factor in mango flower development，we cloned the flower－specific gene from mango inflorescence，named MSOC1（GeneBank accession no.KP404094）with homology－based cloning and RACE method.The open reading frame of MSOC1was 733bps，encoding 223amino acids with molecular weight 25.6kD and isoelectric point 8.96.Sequence alignment and phylogenetic tree analysis indicated that the MSOC1deduced protein contained a conservative MADS－box and semi－conservative K domain and belonged to the SOC1／TM3subfamily of the MADS－box family.Tissue－specific analysis showed that MSOC1was expressed in various tissues of mango，high expression in stems，leaves and inflorescences，low expression in roots and flowers.

mango；MSOC1gene；clone；gene expression

Q785；Q786

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1092

1000－4025（2015）06－1092－06

2015－02－02；修改稿收到日期：2015－04－17

農業部公益性行業（農業）科研專項（201203092）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（1630032012026）；海南大學應用科技學院基金（HYK1402）；海南省應用技術研發與示范推廣專項（ZDXM2015016）

魏軍亞（1974－），女，博士，主要從事植物分子生物學研究。E－mail：junyawei＠126.com

＊通信作者：劉德兵，博士，副教授，主要從事果樹生物技術研究。E－mail：ldebing＠126.com