生菜硝酸還原酶基因的克隆及高氮水平下外源γ－氨基丁酸對其表達和葉片硝酸鹽含量的影響

田 真，李敬蕊，王 祥，吳曉蕾，宮彬彬，高洪波

（河北農業大學園藝學院，河北保定071001）

生菜硝酸還原酶基因的克隆及高氮水平下外源γ－氨基丁酸對其表達和葉片硝酸鹽含量的影響

田 真，李敬蕊，王 祥，吳曉蕾，宮彬彬，高洪波＊

（河北農業大學園藝學院，河北保定071001）

硝酸還原酶（NR）是硝酸鹽代謝的關鍵酶。該研究在成功克隆生菜NR基因的同時，進行了高氮水平下外源γ－氨基丁酸（GABA）對生菜葉片NR基因表達和NO3－－N含量的研究。結果表明：（1）生菜NR基因（GenBank登錄號為KP122207）序列長1 791bp，編碼585個氨基酸殘基，蛋白保守結構域含鉬輔蛋白超家族、細胞色素b5超家族和FNR超家族；生菜NR基因與菊苣NR基因親緣關系最近，序列一致性為93%，與煙草、甜菜、黃瓜、大豆等NR序列的一致性均在80%以上。（2）高氮水平下外源2.5mmol／L GABA處理生菜可誘導NR基因上調表達，并顯著提高了生菜葉片NR、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酸脫羧酶（GAD）活性和NH4＋－N含量，降低了NO3－－N、NO2－－N含量；雖然NO3－－N含量與NR、GAD、NiR活性、NO2－－N、NH4＋－N含量均呈顯著相關關系，但與NR活性的相關系數最高且達極顯著水平。研究認為，高氮水平下外源GABA可通過誘導NR基因上調表達、增強相關酶活性來影響無機氮代謝，從而降低了生菜葉片硝酸鹽含量，其中NR在該過程中發揮著至關重要的作用，為生產中GABA的施用及降低葉菜類蔬菜硝酸鹽含量提供了理論依據。

γ－氨基丁酸（GABA）；高氮水平；生菜；基因克隆；硝酸鹽含量

近年來，設施蔬菜發展迅速，但在蔬菜生產中一部分菜農為追求經濟效益常濫施化肥，特別是單一大量施用氮肥，導致蔬菜體內硝酸鹽含量超標的現象較嚴重。許多學者提出了降低蔬菜硝酸鹽含量的方法，如合理施用氮肥、改善蔬菜生長環境、選擇合適的采收期、采用適宜貯藏加工及食用處理方法等，但是這些方法的實施受外界環境因素的影響較大，從而效果不穩定［1］。硝酸還原酶（ritrate reductase，NR）作為催化硝酸鹽同化反應的限速酶，是影響蔬菜硝酸鹽累積的主要內源因子，在氮素代謝中占有重要地位［2］。研究證明通過提高NR活性有利于蔬菜硝酸鹽的降解［3］，但不同蔬菜體內NR活性存在很大差異，通過外源物質調控的方法穩定提高NR活性對降低蔬菜體內硝酸鹽積累具有重要作用［4］。

γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質氨基酸，廣泛存在于動植物體內，有緩解高血壓、提高免疫力、改善睡眠等的作用。外源GABA可被植物根系和葉片吸收，作為氨基酸態氮參與植物一系列生理代謝反應，在促進植株生長發育、提高抗逆性等方面具有重要作用［5－6］。近年來，關于GABA對植物硝酸鹽含量的影響受到關注，研究證明外源γ－氨基丁酸可調節擬南芥幼苗硝酸鹽的吸收和利用［7］，可作為甘藍型油菜硝酸鹽吸收上調的長途信號［8］，但在高氮水平下GABA降低蔬菜硝酸鹽含量的作用和機理研究較少。生菜作為一種重要的葉菜類蔬菜，極易富集硝酸鹽，而實際生產中設施土壤氮素水平超標現象日趨嚴重，為此從克隆生菜NR基因入手，探求高氮水平下外源GABA降低生菜葉片硝酸鹽含量的作用機理，旨在尋求降低生菜硝酸鹽含量、提高產品品質的有效措施。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗生菜品種為‘大速生’，種子由中國農業科學院蔬菜花卉研究所提供。種子經55℃溫水浸種后，播于裝有石英砂的塑料盆中育苗，溫室晝溫27～30℃，夜溫16～18℃。子葉展開后，用1／2倍的Hoagland營養液澆苗。幼苗長有4片真葉時，選整齊一致的健壯幼苗定植到裝有1倍Hoagland營養液［pH（6.3±0.1），EC（2.0～1.2）］的盆中水培，氣泵正常通氣。待幼苗長出第6片葉子時，將幼苗分成2組并分別進行下列處理。（1）NaNO3處理（CK）：在Hoagland營養液（含有14mmol／L NO3－）中添加18mmol／L NaNO3，使得營養液中NO3－濃度達到32mmol／L（此濃度接近設施土壤硝態氮濃度）；（2）NaNO3＋2.5mmol／L GABA處理（2.5GABA）：Hoagland營養液中同時添加18 mmol／L NaNO3和2.5mmol／L GABA。NaNO3和GABA的濃度均為前期試驗篩選出的最佳濃度［9］。在處理0、3、6d取生菜葉片，用液氮速凍后存放到－80℃超低溫冰箱內，用于硝酸還原酶基因的克隆和表達分析；并在處理0、3、6、9、12d后取生菜葉片，測定硝酸鹽代謝中主要產物含量和相關酶活性。試驗重復3次。

1.2 方 法

1.2.1 生菜總RNA提取及cDNA合成 分別稱取不同處理冷凍的生菜葉片0.1g，液氮研磨。采用塞勒生物EASYEX植物RNA快速提取試劑盒提取總RNA，通過Thermo Scientific NanoDrop 2000／2000C和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。按照TAKARA PrimerScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.2 生菜NR基因的克隆和表達 生菜NR基因序列尚未見報道，本試驗以同為菊科的菊苣NR基因組DNA序列（GenBank登錄號為X84103.1）為依據，運用Primer Premier 5.0軟件設計特異引物NR－s（5′－CAAATACGGGACCAGCATAA－3′）和NR－a（5′－TTGGCAACAACATACCATACCT－3′）。PCR反應體系為：cDNA 1.25μL、dNTP（2.5 mmol·L－1）4.0μL、上下游引物（10μmol·L－1）各0.5μL、Buffer（10×）2.5μL、Taq酶0.25μL和ddH2O 16μL。反應程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，40個循環；72℃延伸10min；4℃保溫。克隆獲得的產物切膠回收，與pMD19－T載體連接后轉化大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素抗性的固體LB培養基上37℃過夜培養，挑取單菌落，在氨芐青霉素抗性的液體LB培養基中37℃搖菌3h，經菌液PCR驗證后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

另外，就不同處理生菜葉片cDNA（通過Thermo Scientific NanoDrop 2000／2000C儀器檢測并調節為一致的濃度），分別用上述所設計引物進行PCR擴增，后經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以此來分析生菜葉片NR基因的表達量。

1.2.3 生物信息學分析 序列比對采用NCBI Blast；利用ExPASy ProtParam對NR基因編碼蛋白理化性質進行預測；采用NCBI CDD數據庫（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／pfa／iprscan／）預測蛋白保守結構域；多序列比對用DNAMAN軟件，并用MEGA 4軟件構建系統進化樹。

1.2.4 硝酸鹽代謝過程中主要產物含量和相關酶活性的測定及其相關性分析 硝態氮（NO3－－N）、銨態氮（NH4＋－N）含量的測定參照呂偉仙［10］的方法；亞硝態氮（NO2－－N）含量采用鹽酸萘乙二胺比色法測定；硝酸還原酶（ritrate reductase，NR）和亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）活性的測定分別參照Foyer等［11］和Takahashi等［12］的方法；谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活性采用GABA比色定量法［13］測定。采用Excel軟件處理數據和作圖，SAS 8.1軟件Duncan多重比較法進行方差分析。同時，利用SPSS 17.0軟件的Pearson相關系數法對硝酸鹽代謝過程中的NO3－－N、NO2－－N、NH4＋－N含量與相關酶NR、NiR、GAD活性進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 生菜NR基因的克隆和表達

PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 000～2 000bp之間出現預期條帶（圖1），測序結果良好，均為單峰。經NCBI Blast比對，與菊苣（Cichorium intybus，GenBank登錄號為P43101.1）NR基因序列一致性為93%，初步證明獲得的序列為生菜NR基因（GenBank登錄號為KP122207），可用于后續序列分析。

將不同處理生菜葉片的cDNA進行PCR擴增，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶的亮度表示基因的表達量。結果顯示，在處理3、6d時，2.5 mmol／L GABA處理的生菜葉片NR基因的表達量均高于對照處理（圖2），表明2.5mmol／L GABA處理提高了生菜葉片NR基因的表達量。

2.2 生物信息學分析

測序結果分析表明，生菜葉片NR基因序列長1 791bp（圖1），該基因編碼的氨基酸殘基長度為585。ProtParam預測結果顯示該序列編碼的蛋白由20種氨基酸組成，分子量為66kD，理論等電點為6.15，酸性氨基酸殘基總數（Asp＋Glu）為72，堿性氨基酸殘基總數（Arg＋Lys）為63。

圖1 生菜葉片NR基因的擴增結果M.DL2000；1.生菜葉片NR基因擴增結果Fig.1 NRgene amplification products in lettuce leaves M.DL2000；1.NR gene amplification products in lettuce leaves

圖2 GABA處理后高氮水平下生菜葉片N R基因的表達結果M.DL200；1～5分別表示0 d的C K處理、3 d的C K和2.5 G A B A處理、6 d的C K和2.5 G A B A處理的生菜葉片N R基因表達量Fig.2 Expression result of NRgene after the treatmen to fGAB Aunder highnit ro gen leve lin lettuce leaves M.DL 2000；1－5stand for thee xpress ion ofNR genein lettuce leaves at0d（CK），3d（CKand 2.5 GABA），6d（CKand 2.5 GABA）

同時，NCBI CDD數據庫對生菜NR基因結構域的預測結果顯示（圖3），生菜NR基因含有鉬輔蛋白超家族（1～213），其在硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的過程中發揮著重要作用。另外還包含細胞色素b5超家族（271～351）和FNR超家族（396～585），且含有FAD和NADH結構域的FNR超家族，是眾多還原酶類所共有的保守結構。

另外，氨基酸序列比對發現，生菜NR基因編碼的氨基酸序列與菊苣（Cichorium intybus）、可可（Theobroma cacao）、煙草（Nicotiana tabacum）、蓖麻（Ricinus communis）、甜菜（Beta vulgaris）、黃瓜（Cucumis sativus）、苜蓿（Medicago truncatula）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）9個物種中的同源基因編碼的氨基酸序列具有很高的相似性，均含有3個保守結構域（圖4，A～C為3個保守結構域）。系統進化樹進一步分析表明，生菜NR基因編碼的氨基酸序列與菊苣親緣關系最近，序列一致性高達93%；而且其與煙草、可可、蓖麻、甜菜、黃瓜、苜蓿、擬南芥、大豆的序列一致性也在80%以上（圖5）。

2.3 外源GABA對生菜葉片硝酸鹽代謝過程中主要產物含量和相關酶活性的影響

圖6，A顯示，隨處理時間的延長，2.5mmol／L GABA處理的生菜葉片的NR活性呈先升高后降低的變化趨勢，而對照葉片的NR活性基本保持穩定，且在處理3、6、9d時2.5mmol／L GABA處理分別比同期對照顯著提高21.8%、22.2%、20.1%（P＜0.05）；同期兩種處理的生菜葉片NO3－－N含量呈相似的變化趨勢，但是2.5mmol／L GABA處理的生菜葉片NO3－－N含量在整個培養過程中均顯著低于對照處理，如在處理9d時比對照降低26.1%（圖6，B）。

同時，2.5mmol／L GABA處理和對照的生菜葉片NiR活性也呈先升高后降低的趨勢，且2.5 mmol／L GABA處理在整個培養過程中均顯著高于同期對照處理，并在處理6d時達最大，此時比對照顯著提高21.1%（圖6，C）；2.5mmol／L GABA處理下的生菜葉片NO2－－N含量在處理時間為3、12 d時卻顯著低于對照處理（圖6，D）。

另外，兩種處理的生菜葉片NH4＋－N含量和GAD活性均呈先升高后降低的趨勢，均在處理6d時達最大值，并在整個處理過程中2.5mmol／L GABA處理均高于對照處理。且除處理12d時的GAD活性外，兩處理間的差異均達顯著水平。其中，2.5mmol／L GABA處理的生菜葉片NH4＋－N含量在處理6d時約為對照的1.5倍，而其相應的GAD活性約為對照的1.2倍（圖6，E、F）。

圖3 NR蛋白保守結構域Fig.3 NR conservative protein domains

圖5 不同植物NR氨基酸系統進化樹分析分支上數值為1 000次重復Bootstrap值Fig.5 Phylogenetic tree of NR amino acid sequences from different plants The number on the branches mean Bootstrap value for 1 000replicates

圖4 不同植物NR基因編碼氨基酸序列比對圖A、B、C表示NR基因蛋白保守結構域Fig.4 Alignment of amino acid sequences of encode by NRgene from different plant species NRgene conserved protein domains（A－C）are shown by line

此外，硝酸鹽代謝過程中主要產物含量及相關酶活性相關分析結果（表1）顯示，高氮水平下生菜葉片NR活性、NiR活性、GAD活性、NO3－－N含量、NO2－－N含量、NH4＋－N含量兩兩之間均呈顯著相關關系。其中，NO3－－N含量與NR活性、GAD活性呈極顯著負相關關系，與NiR活性、NH4＋－N含量呈顯著負相關關系，而與NO2－－N含量的正相關性也達極顯著水平。表明生菜葉片中NR、GAD、NiR活性與其NO3－－N含量關系密切。

圖6 外源GABA對高氮水平下生菜葉片NO3－－N、NO2－－N、NH4＋－N含量及NR、NiR、GAD活性的影響不同小寫字母表示同一時間對照與處理間差異達0.05水平Fig.6 The effects of exogenous GABA on contents of nitrate，nitrite，ammonium as well as activities of nitrate reductase，nitrite reductase，glutamate decarboxylase in leaves of lettuce under high nitrogen level in nutrient solution The letters mean significant difference at 0.05level between CK and treatment with the same time

表1 硝酸鹽代謝過程中主要產物含量和酶活性的相關系數Table 1 The correlation coefficient of the metabolite contents and enzyme activities in the process of nitrate metabolism

3 討 論

硝酸鹽污染是影響設施蔬菜品質的重要因素之一，對人們的健康構成了潛在的威脅。NR在植物氮素代謝中起著關鍵作用，研究表明NR重組基因nia的表達降低了生菜中硝酸鹽的含量［14］，將煙草NR基因與CaMV35S啟動子的融合基因導入到馬鈴薯中并在其中表達，馬鈴薯塊莖中的硝酸鹽含量顯著下降［15］。利用基因工程的手段提高葉菜類蔬菜NR基因的含量，以此來降低葉菜類蔬菜的硝酸鹽含量越來越受到人們的關注，研究NR基因的克隆和表達具有重要的意義。目前已有針對不結球白菜、黃瓜、菜豆等蔬菜的NR基因的克隆和表達展開研究［16－18］，然而高氮水平下外源GABA對生菜NR基因表達情況的研究較少。本試驗成功克隆到一段長為1 791bp的生菜NR基因序列，其編碼蛋白由585個氨基酸殘基組成；蛋白保守結構域包括3個NR家族基因的保守結構：鉬輔蛋白超家族、細胞色素b5超家族及FNR超家族［16］，與不同物種NR基因氨基酸序列比對具有很高的相似性，表明NR基因在進化上具有很強的保守性。同時，高氮水平下外源添加GABA使生菜葉片NR基因的表達量升高，說明外源GABA有誘導NR基因表達的作用，對降低生菜硝酸鹽含量有重要作用。

氨基酸作為硝態氮的還原產物，對氮代謝具有反饋調節作用，當植株生長環境中有氨基酸態氮存在時，就不會吸收硝態氮，以此來降低硝態氮吸收、還原和氨基酸合成過程中能量的消耗，達到降低硝酸鹽含量的目的［19］。研究表明，氨基酸態氮源和硝態氮同時存在的情況下，不結球白菜和生菜先吸收氨基酸態氮，從而降低其體內硝酸鹽含量［20，4］。GABA是一種潛在的植物體中調節離子轉運的調節因子［21］或硝酸鹽吸收上調的長途信號［8］，并通過調節與氮、碳代謝相關的酶活性，如硝酸還原酶、谷氨酸合成酶等影響擬南芥幼苗硝酸鹽的吸收和利用，當硝酸鹽的濃度升高時會抑制硝酸鹽的吸收［7］；外源添加GABA可通過促進NR活性的提高，達到降低生菜硝酸鹽含量的目的［3］。本試驗研究結果表明，高氮水平下外源添加2.5mmol／L GABA顯著提高了生菜葉片NR、NiR、GAD活性和NH4＋－N含量，同時降低了NO3－－N、NO2－－N含量。這可能是因為，外源GABA作為氨基酸態氮源可以被植物根系直接吸收，當環境中同時存在硝態氮和氨基酸態氮時，GABA被優先吸收，通過誘導NR、NiR、GAD活性的提高，從而達到降低葉片硝酸鹽含量的目的。

環境因子、不合理的施肥方式、植物種類等都是影響植物體內硝酸鹽積累的因素［22］。植物體對硝酸鹽的同化反應需要經過兩個步驟：首先，NO3－－N在NR的作用下還原成NO2－－N；NO2－－N由NiR還原為NH4＋－N后進一步合成氨基酸和蛋白質［16］。研究表明，NR的活性代表氮代謝的強弱，NR活性對整個氮素代謝的強弱起著關鍵的調控作用［23］。由本試驗結果可知，生菜葉片內NO3－－N含量與NR、NiR、GAD活性，以及與NO2－－N、NH4＋－N含量均呈顯著相關關系，表明NR、NiR、GAD活性對NO3－－N含量的積累有重要作用。

綜上所述，本試驗克隆了生菜NR基因序列，該基因在進化上具有很強的保守性，而且高氮水平下外源GABA可以通過影響無機氮代謝來降低生菜葉片NO3－－N含量，在此過程中NR發揮重要作用。此結果為生產中GABA的合理施用及降低葉菜類蔬菜硝酸鹽含量提供了理論依據，但GABA對硝酸鹽代謝中其他關鍵酶基因的克隆和表達的影響尚需進一步深入研究。

［1］ SUN F F（孫菲菲），HOU X L（侯喜林），LI Y（李 英），et al.Cloning and sequence analysis of nitrate reductase gene cDNA fragments from non－heading Chinese cabbage［J］.Journal of Nanjing Agricultural University（南京農業大學學報），2006，29（2）：15－19（in Chinese）.

［2］ LIU L（劉 麗），GAN ZH J（甘志軍），WANG X Z（王憲澤）.Advances of studies on the regulation of nitrate metabolism of plants at nitrate reductase level［J］.Acta Bot.Boreal.－Occident.Sin.（西北植物學報），2004，24（7）：1 355－1 361（in Chinese）.

［3］ GONG R J（弓瑞娟），LU F G（盧鳳剛），XIA Q P（夏慶平），et al.Effects of exogenousγ－aminobutyric acid on nitrate content and quality in lettuce［J］.Journal of Agricultural University of Hebei（河北農業大學學報），2012，35（3）：31－35（in Chinese）.

［4］ CHEN G L（陳貴林），GAO X D（高秀瑞）.Effect of partial replacement of nitrate by amino acid and Urea on nitrate content of nonheading Chinese cabbage and lettuce in hydroponics［J］.Scientia Agricultura Sinica（中國農業科學），2002，35（2）：187－191（in Chinese）.

［5］ XIA Q P（夏慶平），GAO H B（高洪波），LI J R（李敬蕊）.Effects ofγ－aminobutyric acid on the photosynthesis and chlorophyll fluorescence parameters of muskmelon seedlings under hypoxia stress［J］.Chinese Journal of Applied Ecology（應用生態學報），2011，22（4）：999－1 006（in Chinese）.

［6］ LUO H Y（羅黃穎），GAO H B（高洪波），XIA Q P（夏慶平），et al.Effects of exogenous GABA on reactive oxygen species metabolism and chlorophyll fluorescence parameters in tomato under NaCl stress［J］.Scientia Agricultura Sinica（中國農業科學），2011，44（4）：753－761（in Chinese）.

［7］ BARBOSA J M，SINGH N K，CHERRY J H，et al.Nitrate uptake and utilization is modulated by exogenous gamma－aminobutyric acid in Arabidopsis thaliana seedlings［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（6）：443－450.

［8］ BEUVE N，RISPAIL N，LAINE P，et al.Putative role ofγ－aminobutyric acid（GABA）as a long－distance signal in up－regulation of nitrate uptake in Brassica napus L.［J］.Plant，Cell and Environment，2004，27（8）：1 035－1 046.

［9］ 弓瑞娟.γ－氨基丁酸對生菜氮代謝及營養品質的影響［D］.河北保定：河北農業大學，2012.

［10］ LüW X（呂偉仙），GE Y（葛 瀅），WU J ZH（吳建之），et al.Study on the method for the determination of nitric nitrogen，ammoniacal nitrogen and total nitrogen in plant［J］.Spectroscopy and Spectral Analysis（光譜學與光譜分析），2004，24（2）：204－206（in Chinese）.

［11］ FOYER C H，VALADIER M H，MIGGE A，et al.Drought－induced effects on nitrate reductase activity and mRNA and on the coordination of nitrogen and carbon metabolism in maize leaves［J］.Plant Physiology，1998，117（1）：283－292.

［12］ TAKAHASHI M，SASAKI Y，IDA S，et al.Nitrite reductase gene enrichment improves assimilation of NO2in Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2001，126（2）：731－741.

［13］ YANG SH Y（楊勝遠），LU ZH X（陸兆新），LüF X（呂鳳霞），et al.Colorimetric determination of GABA in GAD activity assay［J］.Food Science（食品科學），2006，27（7）：205－209（in Chinese）.

［14］ CURTIS I S，POWER J B，DE LAAT A M M，et al.Expression of a chimeric nitrate reductase gene in transgenic lettuce reduces nitrate in leaves［J］.Plant Cell Reports，1999，18（11）：889－896.

［15］ DJENNANE S，CHAUVIN J E，QUILLERE I，et al.Introduction and expression of a deregulated tobacco nitrate reductase gene in potato lead to highly reduced nitrate levels in transgenic tubers［J］.Transgenic Research，2002，11（2）：175－184.

［16］ SUN F F（孫菲菲），HOU X L（侯喜林），LI Y（李 英），et al.Molecular cloning of a non－heading Chinese cabbage nitrate reductase gene（BcNR）and transformation into Arabidopsis thaliana［J］.Scientia Agricultura Sinica（中國農業科學），2009，42（2）：577－587（in Chinese）.

［17］ MAO W H（毛偉華），GONG Y M（龔亞明），XIA X J（夏曉劍），et al.Clonging of a cDNA fragment of nitrate reductase（NR）gene in cucumber and its expression analysis under nitrogen deficiency stress［J］.Acta Agriculturae Zhejiangensis（浙江農業學報），2007，19（3）：160－163（in Chinese）.

［18］ HOFF T，STUMMANN B M，HENNINGSEN K W.Cloning and expression of a gene encoding a root specific nitrate reductase in bean（Phaseolus vulgaris）［J］.Physiologia Plantarum，1991，82（2）：197－204.

［19］ PADGETT P E，LEONARD R T.Regulation of nitrate uptake by amino acids in maize cell suspension culture and intact roots［J］.Plant and Soil，1993，155－156（1）：159－161.

［20］ GAO X D（高秀瑞），CHEN G L（陳貴林）.Effect of replacement of nitrate by Gly on growth and accumulation of nitrate of nonheading Chinese cabbage and lettuce［J］.Journal of Agricultural University of Hebei（河北農業大學學報），2003，26（1）：40－43（in Chinese）.

［21］ KINNERSLEY A M，LIN F.Receptor modifiers indicate that 4－aminobutyric acid（GABA）is a potential modulator of ion transport in plants［J］.Plant Growth Regulation，2000，32（1）：65－76.

［22］ YANG B（楊 波），ZHENG Q S（鄭青松）.Accumulation and control of nitrate in vegetables［J］.Hubei Agricultural Sciences（湖北農業科學），2009，48（8）：2 020－2 025（in Chinese）.

［23］ WANG L Q（王利群），WANG Y（王 勇），DONG Y（董 英），et al.Induced activity of nitrate reductase by nitrate and cloning of nitrate reductase gene［J］.Chinese Journal of Biotechnology（生物工程學報），2003，19（5）：632－635（in Chinese）.

（編輯：裴阿衛）

Cloning of Nitrate Reductase Gene of Lettuce and Effect of Exogenous γ－Aminobutyric Acid on Gene Expression and Nitrate Content in Leaves under High Nitrogen Level

TIAN Zhen，LI Jingrui，WANG Xiang，WU Xiaolei，GONG Binbin，GAO Hongbo＊
（College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China）

Nitrate reductase（NR）is the key enzyme of nitrate metabolism.This paper successfully cloned the gene of NRin lettuce and investigated the effect of exogenousγ－aminobutyric acid（GABA）on the expression of NRgene and NO3－－N content under high nitrogen level in leaves of lettuce cultured with hydroponics culture at the same time.The result showed that：（1）the NRgene（the accession NO.of Genbank is KP122207）sequence of lettuce was 1 791bp that encoding 585amino acid residues，and contained the Moco superfamily，Cyt－b5superfamily and FNR superfamily protein domains.The NRgene sequence of lettuce had close genetic relationship with Cichorium intybus（93%consistency）and had relative close genetic relationship with tobacco，sugar beets，cucumber and soybeans（more than 80%consistency）.（2）The exogenous 2.5mmol／L GABA induced a marked increase in NRgene expression.Meanwhile，significantly in－creased the activities of NR，nitrite reductase（NiR），glutamate decarboxylase（GAD）and the content of NH4＋－N in lettuce leaves under high nitrogen level of nutrient solution，but reduced the contents of NO3－－N and NO2－－N.The content of NO3－－N had significant correlation with the activities of NR，NiR，GAD and the contents of NO2－－N，NH4＋－N，but the correlation coefficient was the highest between NO3－－N and NR which reaching extremely significant negative correlation.The study suggested that，exogenous GABA could affect inorganic nitrogen metabolism and reduce the nitrate content in lettuce leaves by inducing NR gene up－regulated expression and enhancing enzyme activities under high nitrogen level.Especially the NR played a key role in the process，which provided a theoretical basis for the application of GABA and reducing the nitrate content in leafy vegetables.

γ－aminobutyric acid（GABA）；high nitrogen level；lettuce；gene clone；nitrate content

Q789；Q945.79

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1098

1000－4025（2015）06－1098－08

2014－12－26；修改稿收到日期：2015－05－10

河北省教育廳重點項目（ZH2012048）；河北省自然科學基金（C2014204074）

田 真（1988－），女，在讀碩士研究生，主要從事設施園藝與無土栽培的研究。E－mail：pingdixienvhai＠163.com

＊通信作者：高洪波，教授，碩士生導師，主要從事設施蔬菜和無土栽培的教學和研究工作。E－mail：hongbogao＠hebau.edu.cn