葡萄原生質體分離及瞬時轉化體系的建立

舒小娟，溫騰建，邢佳毅，盧 龍，胡建芳

（中國農業大學農學與生物技術學院，北京100193）

葡萄原生質體分離及瞬時轉化體系的建立

舒小娟，溫騰建，邢佳毅，盧 龍，胡建芳＊

（中國農業大學農學與生物技術學院，北京100193）

為了建立葡萄原生質體進行遺傳轉化的技術，該研究以葡萄品種‘黑香蕉’的葉片和愈傷組織為材料，分析纖維素酶和離析酶的濃度與配比、滲透壓和酶解時間等主要因素對葡萄原生質體分離的影響，探討建立穩定、高效的葡萄原生質體分離與瞬時轉化體系，為鑒定目標基因的功能奠定基礎。結果表明：（1）葡萄葉片原生質體的分離以3.0%纖維素酶和0.75%離析酶的酶組合，在0.6mol／L甘露醇溶液中，酶解14h為宜，每克游離產量為4.09× 106個原生質體，活力為83.12%。（2）葡萄愈傷組織原生質體的分離以2.0%纖維素酶和0.5%離析酶的酶組合，在0.5mol／L甘露醇溶液中，酶解14h為宜，每克游離產量為6.05×106個原生質體，活力為84.13%。（3）利用該方法得到的葡萄原生質體為受體，采用40%PEG－4000介導轉化質粒載體pEZS－NL，目標基因瞬時表達產物檢測表明，GFP蛋白表達穩定、清晰。該研究建立的葡萄原生質體制備和轉化體系，可以用較少量的質粒DNA獲得外源基因在原生質體內的表達，為葡萄功能基因的研究提供技術支持。

葡萄；原生質體；葉片；愈傷組織；遺傳轉化；瞬時表達

植物原生質體是能夠通過質壁分離與細胞壁分開的具有生理活性和全能性的細胞系統。其瞬時表達實驗可實現子基因在植物中的快速和高通量表達分析［1－2］，因而被廣泛用于基因功能驗證。擬南芥（Arabidopsis thaliana）［3］、玉米（Zea mays L.）葉片［4］、煙草（Nicotiana tobacumL.）愈傷組織［5］，煙草表皮細胞［6］，洋蔥（Allium cepaL.）表皮細胞［7］等原生質體被廣泛用于基因瞬時表達、蛋白質的亞細胞定位、蛋白質互作和蛋白質活性等研究。并已初步建立多種基因瞬時表達系統，如PEG介導的原生質體轉染［8］，基因槍轟擊［9］和農桿菌介導的瞬時轉化［10］。但是，現階段原生質體的遺傳轉化研究主要集中在模式植物，在果樹上的相關研究較少。

葡萄在中國栽培歷史悠久，營養豐富，是果蔬栽培中經濟效益最高的品種之一。但是葡萄生長周期長、遺傳背景較為復雜、基因數量多且多為雜合狀態［11］，所以通過傳統育種方法和轉基因方法進行品種改良均有一定困難，品種改良工作受到一定制約，葡萄分子機制研究也由于轉基因困難這一技術壁壘而寸步難行。而原生質體分離和遺傳轉化則為克服這一障礙開辟了一條可能的新途徑［12］。作為單細胞系統，原生質體是研究植物細胞超微結構、生理生化過程和遺傳學的良好的實驗模型，也是遺傳轉化的理想受體。目前，葡萄原生質體研究進展緩慢，大多處在分離階段［13－16］，如呂長平等［13］利用刺葡萄葉片、根尖和愈傷組織分離獲得原生質體。俞超等［14］也利用‘鄞紅’葡萄莖段愈傷組織進行原生質體的分離。Natacha等［15］從葡萄果肉中分離得到了完整而脆弱的原生質體。袁彬等［16］以毛葡萄愈傷組織、懸浮培養細胞、無菌苗幼葉為材料，研究了毛葡萄原生質體的分離純化方法及影響因素。但是有關原生質體再生和目標基因瞬時表達體系的研究相對較少，這可能與葡萄遺傳背景不清，遺傳轉化的假陽性較高有關［17］。因此開展葡萄原生質體轉化體系的研究迫在眉睫。為此，本研究針對酶的濃度與配比、滲透壓、酶解時間等對葡萄原生質體分離影響較大的因素進行了試驗研究，旨在獲得高效和高質量的原生質體，并進行了遺傳轉化實驗，為葡萄相關分子機制的研究、體細胞融合育種、植株再生以及品種改良奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗選用葡萄品種‘黑香蕉’（Vitis vinifera L.cv.‘Heixiangjiao’）的無菌苗葉片和無菌苗葉片誘導的胚性愈傷組織為材料，進行原生質體的分離。從溫泉苗圃采集葡萄新梢，進行初代培養和繼代培養。選較幼嫩的葉片作為分離原生質體的酶解材料；剪取組培苗葉片，切成5mm×5mm的方形，接種到愈傷組織誘導培養基上，選取質密、淡黃色狀的胚性愈傷組織作為分離原生質體的酶解材料。

1.2 方 法

1.2.1 原生質體的分離和純化 從田間取葡萄一年生枝條，經過外植體消毒，放入初代培養基（MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA）誘導生芽，隨后進行生根培養（1／2MS＋0.2mg／L IBA＋1mg／L KT＋1g／L活性炭），獲得無菌苗。剪取30～40d葉齡的組培苗葉片，切成5mm×5mm的方形，接種到愈傷組織誘導培養基（MS＋2.0mg／L TDZ＋1.0mg／L 2，4－D＋0.2mg／L IBA）上進行培養，培養溫度為（25±2）℃，光周期為16h／8h，光照強度2 000lx，進行20d的暗培養后轉入光下培養，經繼代后獲得結構致密、淡黃色的胚性愈傷組織。

選取1g左右葉齡20～30d的幼嫩葉片作為分離原生質體的酶解材料，切成1～2mm寬的細絲；另選取1g左右愈傷組織作為分離材料，切碎。分別置于盛有10mL cellulose onozuka R－10（纖維素酶，Yakult）和macerozyme R－10（離析酶，Yakult）混合酶液的培養皿中，靜置在28℃黑暗的環境酶解。酶解后的材料用200目孔徑的尼龍網篩過濾，除去沒有酶解完全的組織和雜質（本試驗采用離心法去雜質，濾液在（600～800）r／min轉速下離心10 min，去掉上清收集原生質體）。用含有甘露醇的原生質體清洗液（CPW液：Cell Protoplast Wash Medium，27.2mg／L KH2PO4、101.0mg／L KNO3、1 480.0mg／L CaCl2·2H2O、246.0mg／L MgSO4· 7H2O、0.16mg／L KI、0.025mg／L CuSO4· 5H2O）進行重懸清洗，再離心洗去雜質，重復操作2次。最后用原生質體培養液W5培養基（4mmol／L MES、154mmol／L NaCl、125mmol／L CaCl2、5mmol／L KCl，pH 5.8）洗滌2次，獲取純化原生質體［18］。

試驗所用的酶解液的處理設置見表1。首先在滲透壓穩定劑甘露醇濃度為0.6mol／L和酶解時間為14h條件下，對酶解液組合進行篩選，測定原生質體產量和活力，確定最佳的酶解液組合。然后，根據確定的最佳酶解液組合，在酶解時間14h條件下，滲透壓穩定劑甘露醇的濃度設置4個處理（0.4、0.5、0.6和0.7mol／L），測定原生質體產量和活力，確定最佳的滲透壓穩定劑濃度。最后，根據篩選得到的最佳酶解液組合和最佳滲透壓穩定劑甘露醇的濃度，酶解時間設置4個處理（12、14、16和18h），測定原生質體產量和活力，從中確定最佳酶解時間。各實驗重復3次。

1.2.2 原生質體產量與活力的測定 利用血球計數板測定原生質體產量：將純化后的原生質體重懸至一定體積，吸取少量滴入血球計數板中，在顯微鏡下觀察形態并計數，重復3次。同時利用伊文思藍染色法測定原生質體活力（Direct Blue 53）：吸取1滴原生質體懸浮液置于載玻片上，用0.25%伊文思藍進行染色，靜置5min，在顯微鏡下觀察，檢測原生質體活性［19］。隨機選取3個視野統計有活力原生質體的百分比。按如下公式計算［20］：

每克材料中原生質體總產量＝25個大方格中原生質體總數×104×懸浮液總體積÷材料質量

表1 酶解液組合Table 1 Composition of enzyme solution for protoplast isolation

原生質體活力＝（視野內未被染色的原生質體數÷視野內原生質體總數）×100%

每克材料中有活力的原生質體產量＝原生質體總產量×原生質體活力

由于原生質體分離一般是為了下一步進行遺傳轉化或者原生質體融合，需要的都是具有活力的原生質體，所以，本試驗統計具有活力的原生質體數，并以此作為評價指標。

1.2.3 原生質體的轉化試驗 pEZS－NL質粒載體是含有綠色熒光蛋白基因（GFP）的植物表達載體（http：／／deepgreen.stanford.edu），表達框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、綠色熒光蛋白（GFP）基因構成，可以在真核細胞中高水平表達綠色熒光蛋白GFP。用中科瑞泰（北京）普通質粒小提試劑盒提取質粒，－20℃保存備用。

將收集的葡萄葉片和愈傷組織原生質體重分別懸浮于MMG溶液中（0.5mol／L甘露醇、15mmol／L MgCl2、4mmol／L MES，pH 5.8），濃度稀釋至每毫升溶液內含2.0×105個。取15～20μg質粒DNA加入2mL離心管，與200μL原生質體MMG懸濁液混合，輕彈管底以混勻，室溫放置8～10 min。加入220μL 40%PEG－Ca2＋（40%PEG－4000、0.2mol／L甘露醇、100mmol／L CaCl2），輕彈管底以混勻，室溫放置15min。隨后加入880μL W5溶液（154mmol／L NaCl、125mmol／L CaCl2、5 mmol／L KCl、4mmol／L MES，pH 5.8）重新懸浮，輕彈管底以混勻，終止轉化。然后，100g離心2 min，棄上清液，收集轉化后的原生質體。加入WI（0.5mol／L甘露醇、4mmol／L MES、20mmol／L KCl，pH 5.8）1mL重懸浮，并轉移至經BSA預沖洗過的培養皿中，室溫、暗培養過夜，用熒光顯微鏡（NIKON，Eclipse 90I，Japan）觀察記錄轉化效果和轉化率。

1.2.4 數據分析 應用Excel軟件進行單因素方差分析；用SPSS 16.0統計軟件對結果多重比較。

2 結果與分析

2.1 酶解液組合對原生質體產量和活力的影響

葉片中分離原生質體產量和活力的酶解濃度處理結果（圖1）顯示，處理11（3.0%纖維素酶＋0.75%離析酶）的每克葉片中分離的原生質體產量3.09×106個，具有活力的原生質體產量2.45×106個，活力可達79.29%，是所有葉片酶解處理中最高的，與其他處理的具有活力的原生質體產量多呈顯著性差異（P＜0.05，下同）。

愈傷組織分離原生質體產量和活力的酶解組合結果（圖2）顯示，處理6（2.0%纖維素酶＋0.50%離析酶）的每克愈傷組織中分離的原生質體產量5.86 ×106個，具有活力的原生質體產量4.73×106個，活力80.71%，是愈傷組織的所有酶解處理中最高的，與其他處理的具有活力的原生質體產量多呈顯著性差異（圖2）。

根據以上不同酶解液處理效果，最終得出適宜‘黑香蕉’葡萄葉片原生質體分離的酶組合是3.0%纖維素酶＋0.75%離析酶；適宜愈傷組織原生質體分離的酶組合是2.0%纖維素酶＋0.50%離析酶。

2.2 不同滲透壓對葡萄葉片和愈傷組織分離的原生質體產量及活力的影響

采用上述所得到的最佳酶解液組合（即酶液組合11處理葡萄葉片和用酶液組合6處理葡萄愈傷組織），酶解14h，分析不同濃度甘露醇（0.4、0.5、0.6、0.7mol／L）對葉片和愈傷組織中分離的原生質體產量和活力的影響。結果（圖3）顯示，原生質體只有在滲透壓最適宜的時候，產量和活力才較高，否則無論滲透壓高低，產量和活力都會下降。其中，當甘露醇濃度為0.6mol／L時，每克葉片原生質體產量達到最高（3.09×106個），具有活力的原生質體產量2.45×106個，活力79.29%，與其他處理具有活力的原生質體產量多有顯著差異（圖3，A）；當甘露醇濃度為0.5mol／L時，每克愈傷組織產量和活力達到最佳，產量為5.94×106個，具有活力的原生質體產量4.82×106個，活力81.14%，與其他處理具有活力的原生質體產量有顯著差異（圖3，B）。

圖1 不同酶組合對‘黑香蕉’葡萄葉片原生質體產量和活力的影響不同小寫字母表示各處理間0.05水平差異顯著性；下同Fig.1 Effects of enzyme composition on yield and viability of‘Heixiangjiao’leaf protoplast Bars with different letters are significantly different at the 0.05level under different treatments；The same as below

圖2 不同酶組合對‘黑香蕉’葡萄愈傷組織原生質體產量和活力的影響Fig.2 Effects of enzyme composition on yield and viability of‘Heixiangjiao’callus protoplast

2.3 不同酶解時間對葡萄葉片和愈傷組織原生質體產量及活力的影響

采用上述所得到的最佳酶解液組合和最佳甘露醇濃度，進行連續取樣觀察，分析不同酶解時間對葡萄葉片和愈傷組織中原生質體分離效果的影響。結果（圖4）顯示，葉片和愈傷組織的最佳酶解時間均為14h。此時每克葉片原生質體產量4.09×106個，具有活力的原生質體產量3.40×106個，活力83.12%，是葉片所有處理中最高的，與其他處理具有活力的原生質體產量均有顯著差異（圖4，A）；每克愈傷組織原生質體產量6.05×106個，具有活力的原生質體產量5.09×106個，活力84.13%，是愈傷組織所有處理中最高的，與其他處理均有顯著差異（圖4，B）。原生質體在酶解時間最適宜的時候其產量和活力才能達到最高。隨著酶解時間的增長，原生質體活力和產量先增后降，因此，有效的原生質體產量會在一定時間段內達到最高；若酶解時間過短，原生質體之間會出現較多的粘連片段和較大細胞團，而若酶解時間過長，原生質體的活力會大大降低。因此，為確保得到活力較高的原生質體，葡萄葉片和愈傷組織的酶解時間盡量控制在14h左右。2.4 葡萄葉片和愈傷組織原生質體的轉化

由于葉肉細胞中含有葉綠體，其自發熒光會干擾GFP的觀測效果，所以日常實驗中常用愈傷組織或黃化子葉進行原生質體的轉化實驗。由于葡萄愈傷組織無論是原生質體產量還是活力都大于葉片，并且沒有葉綠體的自發熒光信號干擾，因此利用葡萄愈傷組織分離的原生質體是一種理想材料。而本試驗利用葡萄葉片和愈傷組織分離的原生質體進行了遺傳轉化體系的比較和研究。

將制備好的葡萄葉片和愈傷組織的原生質體用pEZS－NL載體轉化，在24℃條件下黑暗培養12～16h，用熒光顯微鏡觀察。結果（圖5）顯示：未進行質粒轉化的葉片原生質體只有紅色的葉綠體自發熒光（圖5，A）。利用葉片原生質體進行質粒轉化后，由于自身具有葉綠體應發紅光，但與綠色熒光信號（GFP）疊加后則呈現黃色熒光（圖5，B）。利用愈傷組織分離的原生質體進行質粒轉化后，由于體內沒有葉綠體自發熒光，因此清晰地觀察到有穩定表達的綠色熒光信號，與明場疊加發現綠色熒光信號與原生質體位置吻合（圖5，C）。說明帶有GFP的質粒DNA可高通量進入葡萄葉片和愈傷組織原生質體中并穩定表達。

圖3 不同濃度甘露醇對‘黑香蕉’葡萄原生質體產量和活力的影響A.葉片；B.愈傷組織；圖4同Fig.3 Effects of mannitol concentration in enzyme solution on yield and viability of‘Heixiangjiao’protoplast A.Leaf；B.Callus；The same as Fig.4

圖4 不同酶解時間對‘黑香蕉’葡萄原生質體產量和活力的影響Fig.4 Effects of hours of duration dissolve on yield and viability on‘Heixiangjiao’protoplast

3 討 論

在其他物種原生質體的分離過程中，研究人員用纖維素酶、離析酶、果膠酶、半纖維素酶、崩潰酶等多種酶類做過酶解效率的探索，其中纖維素酶、離析酶的使用較為廣泛［8］。孫鶴等［21］用纖維素酶和離析酶從玉米、小麥、水稻中游離出較高質量的原生質體；廖嘉明等［22］在擬南芥中使用這2種酶，每克葉肉組織中游離出原生質體2.91×106個，活力為84.03%。景艷春等［23］在每克新疆楊葉肉中游離出原生質體達1.57×106個，活力為79.41%。李玉珠等［24］以4個適宜西北內陸黃土高原地區栽培的苜蓿愈傷組織為材料，探索了各影響因素對原生質體分離和培養的影響，每克組織游離出的原生質體1×106～2×106個，活力最高可達80%～90%。在本研究中發現，用濃度為2%纖維素酶和0.5%離析酶消化葡萄愈傷組織；用濃度為3%纖維素酶和0.75%離析酶消化葡萄葉片已經可以分離出足夠量的原生質體，效率較高。

此外，其他研究人員在試驗中發現，酶解時間、溶液滲透壓、分離的離心速度和離心時間對原生質體分離的產量和活力也有較大影響［2］，但是不同物種間最佳酶解時間和溶液滲透壓差別較大，最適的離心速度和離心時間幾乎沒有差別。常用的滲透壓穩定劑主要有甘露醇、蔗糖、山梨醇等，其中甘露醇在原生質體分離中的應用最為廣泛［4，8，15］，本研究使用的滲透壓穩定劑就是甘露醇。發現葡萄葉片原生質體分離的最適酶解時間為14h，最適甘露醇濃度為0.6mol·L－1，與袁彬等［16］取得的結果相似。同時發現愈傷組織原生質體的滲透壓小于葉片原生質體，可以推斷在葡萄中葉片胞質較濃，愈傷組織胞內的滲透壓小于葉片。

圖5 pEZS－NL－GFP載體轉化葡萄原生質體A.未經轉化的葉片原生質體；B.轉入pEZS－NL－GFP的葉片原生質體；C.轉入pEZS－NL－GFP的愈傷組織原生質體Fig.5 ‘Heixiangjiao’protoplast transformed by using pEZS－NL－GFP vector A.Leaf protoplast without transformation；B.Leaf protoplast with pEZS－NL－GFP；C.Callus protoplast with pEZS－NL－GFP

對不同物種的研究表明，植物不同組織最佳體系分離得到的原生質體產量一般為7×105～2×107個，活力一般為70%～90%。本研究中，應用最佳體系，每克葉片游離得到的原生質體產量為4.09× 106個，活力為83.12%；每克愈傷組織原生質體產量為6.05×106個，活力為84.13%。使用愈傷組織來制備原生質體無論是產量還是活力都要優于使用葉片，所以如果不是探究葉綠體相關的生理生化和分子特性，推薦使用葡萄愈傷組織進行原生質體的分離。

目前雖然已經有關于葡萄的原生質體分離體系的報道，但是關于葡萄原生質體遺傳轉化的試驗還鮮有報道。采用GFP（綠色熒光蛋白）、CFP（青色熒光蛋白）、YFP（黃色熒光蛋白）等熒光標記、通過熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡檢測，可以簡單方便地確定目標蛋白在細胞中的定位。通過本試驗可觀察到，葡萄原生質體中的葉綠體會產生自發熒光，影響綠色熒光蛋白的觀測，而暗培養的愈傷組織沒有成熟的葉綠體，所以愈傷組織分離的原生質體可以作為瞬時轉化的理想材料。本研究利用葡萄葉片和愈傷組織原生質體原生質體，采用PEG介導法順利將pEZS－NL－GFP載體導入原生質體并成功表達，為相關分子機制研究奠定基礎。此外，分離出高質量的葉片原生質體，也可為分子育種和雜交育種提供材料依據。

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（編輯：宋亞珍）

Isolation of Protoplast and Establishment of Transient Expression System in Grapevine（Vitis vinifera L.）

SHU Xiaojuan，WEN Tengjian，XING Jiayi，LU Long，HU Jianfang＊
（College of Agriculture and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to establish an efficient transient expression system based on grapevine protoplasts，we used the mesophyll and callus of grape‘Heixiangjiao’to analyze the key factors related to isolating effectively protoplasts，such as cellulose and macerozyme enzyme composition，concentration of mannitol in enzyme solution，duration of enzyme dissolve，and so on.The protoplast was used as a vehicle to explore the establishment of a stable，efficient grape protoplast isolation and transient transformation system，and lay the foundation for building a transient expression system.The results showed that：（1）the optimal enzyme solution for leaf protoplast isolation was 3.0%cellulase onozuka R－10＋0.75%macerozyme R－10＋0.6 mol／L mannitol.The digestion was conducted in the dark under 28℃for 14h，and the protoplasts yield was 4.09×106per gram，the vitality was 83.12%.（2）The optimal enzyme solution for callus protoplast isolation was 2.0%cellulase onozuka R－10＋0.5%macerozyme R－10＋0.5mol／L mannitol.The digestion was conducted in the dark under 28℃for 14h，and the protoplasts yield was 6.05×106per gram，the vitality was 84.13%.（3）The transient expression vector pEZS－NL with reported gene coding green fluorescent protein（GFP）was transferred into protoplasts by 40%PEG－4000method.The GFP protein expressed stably and clearly in all over the protoplast.We establish grape protoplast isolation and transformation sys－tem in this paper.The gene can be expressed efficiently in grape protoplasts with a small amount of plasmid DNA，which provides technical support for grape functional genomics studies.

grapevine；protoplast；leaf；callus；genetic transformation；transient expression

Q781

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1262

1000－4025（2015）06－1262－07

2015－02－04；修改稿收到日期：2015－04－13

國家自然科學基金（31471842）

舒小娟（1990－），女，在讀碩士研究生，主要從事果樹栽培與分子生物學研究。E－mail：1175609284＠qq.com

＊通信作者：胡建芳，教授，主要從事果樹生理與分子生物學研究。E－mail：hujf＠cau.edu.cn