葡萄原生質體分離及瞬時轉化體系的建立

舒小娟，溫騰建，邢佳毅，盧 龍，胡建芳

（中國農業大學農學與生物技術學院，北京100193）

葡萄原生質體分離及瞬時轉化體系的建立

舒小娟，溫騰建，邢佳毅，盧 龍，胡建芳＊

（中國農業大學農學與生物技術學院，北京100193）

為了建立葡萄原生質體進行遺傳轉化的技術，該研究以葡萄品種‘黑香蕉’的葉片和愈傷組織為材料，分析纖維素酶和離析酶的濃度與配比、滲透壓和酶解時間等主要因素對葡萄原生質體分離的影響，探討建立穩定、高效的葡萄原生質體分離與瞬時轉化體系，為鑒定目標基因的功能奠定基礎。結果表明：（1）葡萄葉片原生質體的分離以3.0%纖維素酶和0.75%離析酶的酶組合，在0.6mol／L甘露醇溶液中，酶解14h為宜，每克游離產量為4.09× 106個原生質體，活力為83.12%。（2）葡萄愈傷組織原生質體的分離以2.0%纖維素酶和0.5%離析酶的酶組合，在0.5mol／L甘露醇溶液中，酶解14h為宜，每克游離產量為6.05×106個原生質體，活力為84.13%。（3）利用該方法得到的葡萄原生質體為受體，采用40%PEG－4000介導轉化質粒載體pEZS－NL，目標基因瞬時表達產物檢測表明，GFP蛋白表達穩定、清晰。該研究建立的葡萄原生質體制備和轉化體系，可以用較少量的質粒DNA獲得外源基因在原生質體內的表達，為葡萄功能基因的研究提供技術支持。

葡萄；原生質體；葉片；愈傷組織；遺傳轉化；瞬時表達

植物原生質體是能夠通過質壁分離與細胞壁分開的具有生理活性和全能性的細胞系統。其瞬時表達實驗可實現子基因在植物中的快速和高通量表達分析［1－2］，因而被廣泛用于基因功能驗證。……