低濃度亞砷酸鈉下調PML蛋白表達誘導肝癌干細胞分化的分子途徑

金世龍，譚智明，張鵬，匡遠黎，杜波，唐華明，王鄭

低濃度亞砷酸鈉下調PML蛋白表達誘導肝癌干細胞分化的分子途徑

金世龍，譚智明，張鵬，匡遠黎，杜波，唐華明，王鄭

目的探討低濃度亞砷酸鈉誘導肝癌干細胞(LCSCs)分化的分子途徑。方法采用免疫熒光、Western blotting和熒光定量PCR分析肝細胞癌(HCC)組織和細胞PML、Oct4和Sox2基因的表達情況，比較低濃度亞砷酸鈉處理后HCC細胞PML、Oct4和Sox2基因表達及LCSCs生物功能的變化，確定低濃度亞砷酸鈉對LCSCs分化的誘導作用及其分子途徑。結果0.5μg/ml亞砷酸鈉可明顯抑制HuH7和原代HCC細胞形成腫瘤球，增強HuH7細胞對吡柔吡星(THP)的敏感性(P＜0.01)，并抑制HuH7和原代HCC細胞移植成瘤的能力(P＜0.05)。HCC組織和細胞表達PML、Oct4、Sox2 mRNA和蛋白，且0.5μg/ml亞砷酸鈉可使Oct4、Sox2 mRNA(P＜0.05)和蛋白(P＜0.01)表達下調。0.5μg/ml亞砷酸鈉處理后HuH7和原代HCC細胞PML蛋白表達明顯下調(P＜0.05)，而Hep3B、HepG2、SMCC-7721、HuH7和原代HCC細胞PML mRNA表達無明顯變化。0.5μg/ml亞砷酸鈉可抑制含LCSCs的HuH7和原代HCC細胞關鍵基因Oct4、Sox2 mRNA的表達(P＜0.05)，而且能改變LCSCs對THP的敏感性、抑制腫瘤球形成和異體移植成瘤等生物學特征。結論HCC組織和細胞表達PML mRNA及蛋白，低濃度亞砷酸鈉與HCC細胞內PML蛋白直接結合使之降解，PML核體(PML-NB)隨之崩解，PML-NB上與增殖分化相關基因的轉錄被抑制，從而下調HCC細胞Oct4、Sox2等LCSCs相關基因的表達，抑制HCC細胞生長和誘導LCSCs分化。

癌，肝細胞；腫瘤干細胞；細胞分化

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發病率居世界惡性腫瘤第五位，診斷時多數已屬進展期[1-2]，手術切除率低于50%，即使手術切除也易復發和轉移，5年生存率只有10%～30%。肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)具有自我更新、多潛能分化和抵抗放化療等特性[3]，在HCC發生、發展、復發和轉移中起關鍵作用[4-6]。目前臨床治療尚不能針對性地清除LCSCs，基礎研究也未找到防治HCC復發和轉移的方法。盡管多項研究結果顯示砒霜(arsenic trioxide，As2O3)或亞砷酸鈉能明顯抑制HCC細胞增殖并誘導癌細胞凋亡，但多中心Ⅱ期臨床試驗結果顯示單用As2O3治療HCC效果并不滿意[7]。近期本課題組研究發現HuH7和原代HCC細胞含有LCSCs，低濃度亞砷酸鈉可抑制HCC細胞Oct4、Sox2表達，誘導LCSCs分化[8]。本研究探討亞砷酸鈉是否可下調HCC細胞早幼粒細胞白血病(promyelocytic leukemia，PML)蛋白表達以及低濃度亞砷酸鈉是否通過PML蛋白誘導LCSCs分化。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721等HCC細胞由第三軍醫大學西南醫院肝膽外科和病理科贈送。DMEM培養基和胎牛血清為Hyclone公司產品，PML抗體購自Fantibody公司。HCC組織取自切除的肝癌組織標本。LSM780激光共聚焦顯微鏡為Carl Zeiss公司產品。總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒為BioFlux公司產品，Promega GoTaq qPCR Master Mix為Promega公司產品。Mx3000P熒光定量PCR儀為美國STRATAGNE公司產品。

1.2 方法

1.2.1 亞砷酸鈉處理HCC細胞 HCC細胞在含10% FBS的DMEM培養液中于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱孵育，細胞匯合度達到70%～80%時采用0.25%胰酶消化細胞。普通及原代培養HCC細胞經0.1～1.0μg/ml終濃度亞砷酸鈉處理。

1.2.2 腫瘤球培養 以無血清DMEM/F12(1:1)基礎培養基，加入EGF(10ng/ml)、bFGF(20μg/ml)、N2、B27等制成標準培養基，于超低黏附6孔板加入1ml標準培養基及5.0×103個HuH7和原代HCC細胞，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中孵育，每日半量換新鮮培養基，觀察記錄細胞球情況。

1.2.3 CCK-8分析HuH7細胞對吡柔吡新(THP)的敏感性 將HuH7細胞接種于96孔板，每孔加1.0×103個細胞，加入100μl含10%FBS的DMEM培養基(每2d換液)使其貼壁生長。次日細胞貼壁后分別加入不同濃度亞砷酸鈉(0.25、0.5、0.75、1.0μg/ml)，每種濃度設12個孔，設調零孔12個(不加細胞)，細胞對照孔12個(不加藥物)，每組設0.5μg/ml THP對照孔12個(加THP)，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中孵育96h后吸出培養液。每孔分別加入90μl DMEM培養基和10μl CCK-8溶液，繼續培養2h，在酶標儀上測定細胞在450nm處的吸光度(A)值。

1.2.4 Western blotting分析HCC細胞PML、Oct4和Sox2蛋白表達

1.2.4.1 HCC細胞總蛋白提取 將HuH7、HepG2、Hep3B和SMCC-7721這4種HCC細胞常規胰酶消化制成細胞懸液，細胞數1.0×106，1500r/min離心5min，移入1.5ml EP管，PBS洗2次。細胞懸液離心后吸盡上清液，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液200μl，冰上裂解30min，4℃下12 000r/min離心15min，上清液移入EP管，蛋白定量后置–70℃備用。

1.2.4.2 HCC組織總蛋白提取 患者接受HCC切除術，切除HCC組織樣本后立即切取癌腫組織(腫瘤邊緣)，稱取100mg HCC加入500μl預冷的細胞裂解液，置于冰上用玻璃勻漿器碾磨，裂解30min，4℃12 000r/min離心15min，上清液移入EP管，蛋白定量后置–70℃備用。

1.2.4.3 Western blotting檢測HCC細胞PML蛋白表達 配制10%分離膠和4%積層膠。上樣量為每泳道90μg，體積25～30μl。電泳積層膠電壓80V，分離膠電壓100～120V，電泳2～3h后轉至PVDF膜。取下PVDF膜，5%脫脂奶粉PBS封閉，室溫振搖1～2h。將封閉的膜滴加一抗按1:100(3%BSA)，4℃濕盒內過夜，次日PBS漂洗15min×1次，5min×4次，二抗按1:2500(3%BSA)，25℃振搖1h，PBS漂洗15min×1次，5min×4次。混合等體積A液和B液(各500μl，共1ml)，將顯色劑滴加到PVDF膜正面，開始顯色記錄圖像。

1.2.4.4 免疫熒光分析HCC細胞PML蛋白的表達4種HCC細胞普通培養在10mm蓋玻片上，待60%～80%融合時用37℃預熱PBS振搖漂洗，5min×2次，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗5min后用含0.5% Triton-X-100的PBS室溫下脫色，搖床振搖15min，PBS洗3次。取出蓋玻片放到載玻片上，10%山羊血清37℃封閉30min，PML抗體用PBS按1:50稀釋后滴加15～20μl到蓋玻片上，濕盒內4℃冰箱過夜。有細胞的蓋玻片放進24孔板，PBS脫色，搖床洗3次，取出蓋玻片滴加20μl用PBS按1:50稀釋的熒光抗體，37℃避光孵育60min。蓋玻片放進24孔板內，經PBS洗3次，Hoechst33342染細胞核，PBS洗蓋玻片2次，取出蓋玻片，封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察，記錄細胞PML蛋白表達情況。

1.2.5 熒光PCR分析HCC細胞PML、Oct4和Sox2 mRNA表達 用Trizol Reagent提取HCC細胞總RNA，檢測RNA含量后立即置–130℃保存。按BioKT cDNA first strand cynthesis Kit使用說明設置20μl反應體系，置室溫10min，于42℃ 45min、95℃5min、冰浴5min的循環條件下進行反應。反轉錄后檢測cDNA含量，于–20℃保存。引物序列如下：GAPDH正義5'-TGCAACCGGGAAGGAAATGA-3'，反義5'-GCCCAATACGACCAAATCAGA-3；PML正義5'-GGCTCGAGAAGGATGTGGTC-3'，反義5'-GAAGTGAGGGCTCCCATAGC-3'；Oct4正義5'-GGCTCGAGAAGGATGTGGTC-3'，反義5'-GAAGTGAGGGCTCCCATAGC-3'；Sox2正義5'-CAGGAGTTGTCAAGGCAGAGA-3'，反義5'-CGCCGCCGATGATTGTTATT-3'。熒光定量PCR反應條件：預變性95℃ 4min；95℃ 30s，55℃20s，72℃ 20s，40個循環。擴增產物經過3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為目標條帶。

1.3 HCC細胞異體移植成瘤實驗 HCC細胞按每組2.0×106個細胞分為4組，分別采用PBS配成100μl細胞懸液，注射到清潔級裸鼠背部皮下。細胞移植后隔日皮下注射3～5μg亞砷酸鈉，共注射7次，每組注射10只裸鼠，每周觀察成瘤情況。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料之間的比較采用單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 亞砷酸鈉對HuH7細胞THP敏感性的影響0.5μg/ml亞砷酸鈉可明顯抑制HuH7和原代HCC細胞形成腫瘤球(圖1)。CCK-8檢測結果顯示，0.5μg/ml THP、0.5μg/ml亞砷酸鈉均不能抑制HuH7細胞生長(P=0.06，P=0.933)，0.75μg/ml亞砷酸鈉和0.5μg/ml亞砷酸鈉+0.5μg/ml THP可明顯抑制HuH7細胞增殖(P＜0.001，圖2)。提示亞砷酸鈉可增強HuH7細胞對THP的敏感性。

圖1 亞砷酸鈉對HuH7和原代HCC細胞腫瘤球形成的影響Fig.1 Effect of sodium arsenite on the formation of tumor sphere in HuH7 cells and primary HCC cellsA. HuH7 cells; B. HuH7 cells treated with 0.5μg/ml of sodium arsenite; C. Primary HCC cells; D. Primary HCC cells treated with sodium arsenite

圖2 亞砷酸鈉和THP處理96h后HuH7細胞生長抑制情況(CCK-8分析)Fig.2 Growth inhibition of HuH7 cells 96h after treatment with sodium arsenite and THP (CCK-8 analysis)(1)P＜0.01 compared with THP control group; (2)P＜0.01 compared with 0.5μg/ml As group; (3)P＜0.01 compared with 0.75μg/ml As group; (4)P＜0.01 compared with 1.0μg/ml As group

2.2 亞砷酸鈉對HuH7和原代HCC細胞PML蛋白表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721表達PML蛋白(圖3A)。24例HCC組織均不同程度表達PML蛋白(圖3B)。免疫熒光分析結果顯示，PML蛋白表達于HuH7、HepG2、SMCC-7721和Hep3B細胞核，在核內呈點狀顆粒分布(圖3E)。熒光定量PCR分析結果顯示，HCC組織及Hep3B、HepG2、SMCC-7721、HuH7和原代HCC細胞都表達PML mRNA(圖3C、F)。經亞砷酸鈉處理96h后HuH7和原代HCC細胞PML蛋白表達明顯下調(P＜0.05，圖3D)，HuH7細胞核PML蛋白熒光顆粒明顯減少(P＜0.01，圖3E)，隨0.5μg/ml亞砷酸鈉處理HuH7細胞時間延長，PML蛋白逐漸減少，最后消失(圖3G)。亞砷酸鈉處理后Hep3B、HepG2和SMCC-7721細胞核PML蛋白熒光顆粒減少更快。熒光定量PCR分析顯示，亞砷酸鈉處理Hep3B、HepG2、SMCC-7721、HuH7和原代HCC細胞后，其PML mRNA表達無明顯變化(圖3F)。提示亞砷酸鈉直接下調HuH7和原代HCC細胞表達PML蛋白，早期對HCC細胞PML mRNA表達無明顯作用。

圖3 亞砷酸鈉對HuH7和原代HCC細胞PML蛋白表達的影響Fig.3 Effect of sodium arsenite on the expression of PML protein in HuH7 and HCC primary cellsA.PML protein expression in HuH7,HepG2,Hep3B and SMMC-7721 cells (Western blotting,NB4 and HL60 cells were utilized as positive controls,Lo2 cells were used as human hepatic cell control); B. PML protein expression in HCC tissue samples; C. PML gene expression in HCC tissues; D. PML protein expression in HuH7 and primary HCC cells (treatment with 0.5μg/ml of sodium arsenite for 5 days; E. PML protein expression in the nuclei of HuH7,HepG2,SMCC-7721 and Hep3B cells [×400,the number of fluorescent PML protein particles was markedly decreased in the nuclei of HuH7 cells treated with 0.5μg/ml of sodium arsenite for 5 days (HuH7+As)]; F. PML gene expression in five sort of HCC cells (no significant change when treated with sodium arsenite for 5 days,P>0.05); G. PML protein expression in HuH7 cells (down-regulated gradually when treated with 0.5μg/ml sodium arsenite after 24,48,72,96 and 120h cultivation)

2.3 亞砷酸鈉對HuH7和原代HCC細胞Oct4、Sox2 mRNA表達的影響 24例HCC組織和4種HCC細胞均表達Oct4蛋白(圖4A)，22例HCC組織和4 種HCC細胞表達Sox2蛋白(圖4B)。24例HCC組織均存在Oct4(圖4C)和Sox2(圖4D)mRNA表達。經亞砷酸鈉處理后，HuH7和原代HCC細胞Oct4、Sox2 mRNA(P＜0.05)，Oct4蛋白(P＜0.05)和Sox2蛋白(P＜0.01)表達均下調(圖4A、B)。

2.4 HCC細胞異體移植成瘤實驗 結果顯示，10只裸鼠皮下移植HuH7細胞，9只裸鼠成瘤(9/10)，10只裸鼠皮下移植HCC原代細胞，7只裸鼠成瘤(7/10)。HCC細胞移植后隔日皮下注射3～5μg亞砷酸鈉，連續用7次，HuH7組僅1只裸鼠成瘤(1/10)，原代HCC細胞組沒有成瘤(0/10)，顯示亞砷酸鈉具有抑制HuH7和原代HCC細胞移植成瘤的能力(P＜0.05)，推測亞砷酸鈉已誘導LCSCs發生分化。

圖4 HCC組織及細胞Oct4、Sox2 mRNA(熒光PCR)和蛋白(Western blotting)表達Fig.4 Expression of genes and proteins of Oct4 and Sox2 in HCC tissue and cellsA. Oct4 and Sox2 protein expression (24 HCC tissues); B. Oct4 and Sox2 protein expression (HepG2,SMCC-7721,Hep3B,HuH7 cells); C,D. Oct4 and Sox2 gene expression (24 HCC tissues); 1,3,5,7. HepG2,SMCC-7721,Hep3B and HuH7 cells; 2,4,6,8. HepG2,SMCC-7721,Hep3B and HuH7 cell treated with 0.5μg/ml sodium arsenite for 5 days

3 討 論

LCSCs具有自我更新、多潛能分化和抵抗放化療等特性，在HCC的發生、發展、復發和轉移中起關鍵作用。近期研究證實亞砷酸鈉具有抑制HepG2、Hep3B、SMCC-7721和HuH7細胞生長的作用，HuH7細胞耐受能力最強，HuH7和原代HCC細胞含LCSCs，亞砷酸鈉可誘導LCSCs分化[8]。本研究結果顯示，0.5μg/ml亞砷酸鈉可明顯抑制HuH7和原代HCC細胞形成腫瘤球，且明顯增強HuH7細胞對THP的敏感性，具有抑制HuH7和原代HCC細胞移植成瘤的能力，提示亞砷酸鈉可抑制或改變LCSCs特有的生物學功能，LCSCs能被亞砷酸鈉誘導分化或清除。

本課題組前期研究發現HuH7和原代HCC細胞可表達Oct4、Sox2蛋白，且亞砷酸鈉可以下調這兩種基因及蛋白的表達[8]，本研究進一步證實HCC組織和細胞均表達Oct4、Sox2等干細胞轉錄因子，且亞砷酸鈉具有抑制或下調HCC細胞Oct4、Sox2等LCSCs關鍵基因及蛋白表達的作用。

本課題組前期研究還發現HCC組織和HuH7細胞可表達PML mRNA和蛋白[8]，為明確亞砷酸鈉是否直接靶向HCC細胞下調PML蛋白的表達，我們首先觀察是否所有HCC組織和細胞株都表達PML蛋白，其次用0.5μg/ml亞砷酸鈉處理HuH7和原代HCC細胞5d，檢測HCC細胞PML蛋白和mRNA的表達變化。結果顯示，亞砷酸鈉處理HuH7和原代HCC細胞后PML蛋白表達均明顯下調，HuH7細胞核PML蛋白熒光顆粒明顯減少，而Hep3B、HepG2、SMCC-7721和HuH7細胞PML mRNA表達無明顯變化。提示HCC細胞和組織表達PML蛋白和基因，具有亞砷酸鈉直接靶向作用的分子基礎，且亞砷酸鈉可直接下調HuH7和原代HCC細胞PML蛋白的表達。

PML基因可維持造血干細胞(hematopoietic stem cekks，HSCs)、急性粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)及慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)的白血病起始細胞(leukemia initiating cells，LICs)穩定[9]，PML蛋白表達下調或缺失可導致其分化。PML蛋白可與Daxx，Sp100，CBP/p300，SUMO-1，pRb，rfp，ZSG20等形成PML核體(PML nuclear bodies，PMLNB)，PML-NB募集轉錄因子并參與染色體構型調控轉錄，PML蛋白表達減少或缺失可使PML-NB結構解體，多種核轉錄因子失去發揮功能的平臺[10-13]。PML蛋白和PML-NB決定Oct4的表達，Oct4基因表達和維持干細胞染色體開放構型也需要PML蛋白，PML蛋白表達缺失會導致細胞失去穩定性而發生分化[12-17]。Chuang等[14]研究證實，PML蛋白是Oct4表達的陽性調節子，PML蛋白下調可抑制Oct4基因表達。Sox2基因在維持LCSCs多能性和決定其是否走向分化方面具有關鍵作用[18-19]。即PML蛋白不僅決定干細胞關鍵基因Oct4、Sox2的表達，而且還維持著HSCs、APL及CML的LICs穩定。我們的結果顯示，亞砷酸鈉不僅使Oct4、Sox2 mRNA和蛋白表達下調，而且可改變HuH7和HCC原代細胞中LCSCs的功能特征，表明Oct4蛋白下調使LCSCs難以維持多能性，LCSCs可能已經分化。Zhang等[11]證實As2O3治療APL的機制在于As2O3中砷直接與癌蛋白PML-RAR結合，使癌蛋白降解。本研究發現經亞砷酸鈉處理后HuH7和原代HCC細胞PML蛋白表達明顯下調，HuH7細胞核PML蛋白熒光顆粒明顯減少，隨著0.5μg/ml亞砷酸鈉處理HuH7細胞時間的延長，PML蛋白逐漸減少，最后消失，但熒光定量PCR分析發現亞砷酸鈉處理Hep3B、HepG2、SMCC-7721、HuH7和原代HCC細胞后，其PML mRNA表達無明顯變化，提示亞砷酸鈉直接下調HuH7和原代HCC細胞PML蛋白的表達，進一步肯定了砷直接與HCC或APL細胞PML蛋白結合，使PML蛋白降解。

綜上所述，我們認為HCC組織和細胞株表達PML基因及蛋白，低濃度亞砷酸鈉與HCC細胞內PML蛋白直接結合使之降解，PML-NB隨之崩解，PML-NB上與增殖分化相關的基因轉錄被抑制，從而下調HCC細胞Oct4、Sox2等LCSCs相關基因的表達，抑制HCC細胞生長和誘導LCSCs分化。

[1]Qiu XX,Zuo M. Progress in diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Tianjin Med J,2014,42(1): 90-93. [邱秀霞,左苗. 肝細胞癌的診治進展[J]. 天津醫藥,2014,42(1): 90-93.]

[2]Chen L,Li Y,Zhou HY,et al. Research progress in treatment of multifocal hepatocellular carcinoma[J]. Tianjin Med J,2013,41(12): 1224-1226. [陳璐,李燕,周洪淵,等. 多灶性肝細胞癌治療的研究進展[J]. 天津醫藥,2013,41(12): 1224-1226.]

[3]Ge LL,Yang XA. Cancer stem cell-like properties of EpCAM+cell subpopulation in hepatocellular carcinoma cell line Huh-7[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci),2012,47(3): 306-309. [葛麗麗,楊小昂. 肝癌細胞系Huh-7中EpCAM+細胞亞群的腫瘤干細胞樣特性[J]. 鄭州大學學報(醫學版),2012,47(3): 306-309.]

[4]Llovet JM,Burroughs A,Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet,2003,362(9399): 1907-1917.

[5]Haraguchi N,Ishii H,Mimori K,et al. CD13 is a therapeutic target in human liver cancer stem cells[J]. J Clin Invest,2010,120(9): 3326-3339.

[6]Chen Y,Yu K,Zhang H,et al. CD133+EpCAM+phenotype possesses more characteristics of tumor initiating cells in hepatocellular carcinoma Huh7 cells[J]. Int J Biol Sci,2012,8(7): 992-1004.

[7]Qu FL,Hao XZ,Qin SK,et al. Multicenter phase Ⅱ clinical trail of arsenic trioxide injection in the treatment of primary hepatocellular carcinoma[J]. Chin J Oncol,2011,33(9): 697-701.

[8]Jin SL,Zhang P,Kuang YL,et al. Low concentration of sodium arsentie induces differentiation of liver cancer stem cells through inhibiting Oct4 and Sox2 expression in hepatocellular carcinoma cells[J]. J Third Mil Med Univ,2015,37(2): 116-121. [金世龍,張鵬,匡遠黎,等. 低劑量亞砷酸鈉抑制Oct4、Sox2基因表達誘導肝癌干細胞分化[J]. 第三軍醫大學學報,2015,37(2): 116-121.]

[9]Zhang XY,Wu SX,Guo JX,et al. All trans retinoic acid in the treatment of 1 cases of acute hepatic failure caused by acute leukemia[J]. Med J Chin PLA,2012,37(6): 668. [張學亞,吳詩馨,郭健欣,等. 全反式維甲酸治療急性早幼粒細胞白血病引起肝功能衰竭1例[J]. 解放軍醫學雜志,2012,37(6): 668.]

[10] Jeanne M,Lallemand-Breitenbach V,Ferhi O,et al. The PML/ RARA oxidation and arsenic binding initiate the antileukemia response of As2O3[J]. Cancer Cell,2010,18(1): 88-98.

[11] Zhang XW,Yan XJ,Zhou ZR,et al. Arsenic trioxide controls the fate of the PML-RAR oncoprotein by directly binding PML[J]. Science,2010,328(5975): 240-243.

[12] Ito K,Bernardi R,Morotti A,et al. PML targeting eradicates quiescent leukaemia-initiating cells[J]. Nature,2008,453(7198): 1072-1078.

[13] Nakahara F,Weiss CN,Ito K. The role of PML in hematopoietic and leukemic stem cell maintenance[J]. Int J Hematol,2014,100(1): 18-26.

[14] Chuang YS,Huang WH,Park SW,et al. Promyelocytic leukemia protein in retinoic acid-induced chromatin remodeling of Oct4 gene promoter[J]. Stem Cells,2011,29(4): 660-669.

[15] Chang FT,Chan FL,McGhie JD,et al. PML bodies provide an important platform for the maintenance of telomeric chromatin integrity in embryonic stem cells[J]. Nucleic Acids Res,2013,41(8): 4447-4458.

[16] Karwacki-Neisius V,Goke J,Osomo R,et al. Reduced Oct4 expression directs a robust pluripotent statw with distinct signaling activity and incr easedenhancer occupancy by Oct4 and Nanog[J]. Cell Stem Cell,2013,12(5): 531-545.

[17] Zhang XW,Yan XJ,Zhou ZR,et al. Arsenic trioxide controls the fate of the PML-RAR oncoprotein by directly binding PML[J]. Science,2010,328(5975): 240-243.

[18] Boumahdi S,Driessens G,Lapouge G,et al. SOX2 controls tumour initiation and cancer stem-cell functions in squamouscell carcinoma[J]. Nature,2014,511(7508): 246-250.

[19] Jeong CH,Cho YY,Kim MO,et al. Phosphorylation of Sox2 cooperates in reprogramming to pluripotent stem cells[J]. Stem Cells,2010,28(12): 2141-2151.

The molecular pathway of low concentration of sodium arsenite in inducing differentiation of liver cancer stem cells by down-regulating promyelocytic leukemia protein expression

JIN Shi-long,TAN Zhi-ming*,ZHANG Peng,KUANG Yuan-li,DU Bo,TANG Hua-ming,WANG Zheng
Department of Hepatobiliary Surgery,Kai Xian People’s Hospital of Chongqing City,Chongqing 405400,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: 605346554@qq.com

,E-mail: 605346554@qq.com
This work was supported by the Chinese Medicine Technological Item of Municipal Health Bureau of Chongqing City (ZY20132047)

ObjectiveTo study the molecular pathway of low concentration of sodium arsenite in inducing differentiation of liver cancer stem cells.MethodsWestern blotting analysis,immunofluorescence assay and quantitative PCR were used to examine the gene and protein expression of promyelocytic leukemia (PML),Oct4 and Sox2 in HCC tissue and cell lines,and the molecule pathway of low concentration of sodium arsenite inducing differentiation of liver cancer stem cells was confirmed by comparing the changes in the gene and protein expression of PML,Oct4 and Sox2 in HCC cells and biological function of LCSCs after the treatment with low concentration of sodium arsenite.Results0.5μg/ml of sodium arsenite was shown to alter the biological characteristics of LCSCs in HuH7 and primary HCC cells,including the ability to form tumor spheres,resistance to pirarubicin (P＜0.01),and the capability of forming tumors after allogeneic transplantation (P＜0.05). Both HCC cells and tissues expressed the gene and protein of PML,Oct4 and Sox2,and 0.5μg/ml of sodium arsenite not only downregulated the gene and protein expression of Oct4 (P＜0.05) and Sox2 in HCC cells (P＜0.05),but also downregulated the protein expression of PML (P＜0.05). In contrast,sodium arsenite did not inhibit the gene expression of PML in Hep3B,HepG2,SMCC-7721,HuH7 and primary HCC cells. Furthermore,through down-regulated PML protein expression with arsenite,the biological characteristics of HuH7 and primary HCC cells containing LCSCs was simultaneously altered,and the expression of stem gene Oct4 and Sox2 was downregulated (P＜0.05),while HCC cells proliferation was inhibited as well.ConclusionsBoth HCC tissues and cells canexpress the PML gene and PML protein. Low concentrations of sodium arsenite would directly bind to PML protein in HCC cells,resulting in degradation of the PML protein,followed by collapse of PML-NBs,inhibition of transcription of the proliferation- and differentiation-related genes in PML-NBs,and down-regulation of expressions of Oct4,Sox2 and other CSC-related genes in HCC cells,thus inhibiting HCC cell growth and inducing LCSC differentiation.

carcinoma,hepatocellular; neoplastic stem cells; cell differentiation

R735.7

A

0577-7402(2015)12-0966-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.06

2015-06-25；

2015-08-27)

(責任編輯：熊曉然)

重慶市衛生局中醫藥科技項目(ZY20132047)

金世龍，醫學博士，主任醫師，副教授。主要從事肝癌手術后復發與轉移機制的研究

405400 重慶 重慶市開縣人民醫院肝膽外科(金世龍、譚智明、張鵬、匡遠黎、杜波、唐華明、王鄭)

譚智明，E-mail: 605346554@qq.com