短梗霉素A對灰葡萄孢菌生長的影響

趙紅霞, 茍 萍, 劉小平, 劉圣紅, 郭星軍

(新疆大學生命科學與技術學院,烏魯木齊 830046)

短梗霉素A對灰葡萄孢菌生長的影響

趙紅霞, 茍 萍*, 劉小平, 劉圣紅, 郭星軍

(新疆大學生命科學與技術學院,烏魯木齊 830046)

通過考察短梗霉素A(Ab A)對灰葡萄孢菌野生株Bc AUR1及其AUR1基因內含子缺失突變株Bc AUR1a生長的影響,明確Ab A抑制真菌生長的機理。Ab A敏感性試驗表明,低濃度Ab A(8μg/m L)顯著抑制野生株Bc AUR1菌體的生長,高濃度Ab A(50μg/mL)存在下觀察不到Bc AUR1的生長跡象。突變株Bc AUR1a則不受Ab A的影響,在低濃度和高濃度Ab A存在下均能正常生長。Ab A抑制Bc AUR1侵染柑橘果實,但Bc AUR1a在高濃度Ab A存在下也能夠有效感染柑橘果實。這兩個試驗均證實了突變株Bc AUR1a具有Ab A抗性。電鏡觀察表明,Ab A引起Bc AUR1細胞質膜和內膜系統形態異常,質膜和液泡膜斷裂,細胞內物質泄露。Ab A抑制灰葡萄孢菌生長的機制是由于IPC合成酶受到抑制,導致鞘磷脂類物質合成不足,細胞膜結構破壞,胞內物質外漏。

灰葡萄孢菌; IPC合成酶; 短梗霉素A; 細胞形態

灰霉病由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起,是一種世界范圍內的農作物及果蔬病害。灰葡萄孢菌的寄主范圍很廣,能侵染多種糧食作物、蔬菜、水果和觀賞植物的葉、莖、花和果實[13]。灰霉病不僅在田間造成危害,而且在貯運、銷售和消費期間繼續造成果蔬發病腐爛,嚴重影響產品產量和質量,造成很大的經濟損失。目前化學防治仍然是灰霉病防治的主要措施,但由于灰葡萄孢菌具有遺傳變異大、繁殖速率快和適應性強等特性,連續多年大量使用單一作用位點的殺菌劑,很容易形成對特定殺菌劑具有抗性的亞群體,其結果是防治效果下降,甚至失效[4-6]。灰葡萄孢菌主要侵染果蔬的可食部分,殺菌劑的廣泛使用,帶來各種問題,如農藥殘留導致人畜安全受到威脅,傷害環境中其他微生物引起生態平衡失調等。人們一直試圖尋找一種對真菌高效、與已有藥劑沒有交互抗性、對人類安全的新型殺菌劑。

鞘脂是真核生物細胞膜結構的重要成分,是維持真核細胞結構不可缺少的組分。近年來越來越多的研究表明,鞘脂及其代謝產物還是重要的信號分子,參與膜蛋白的定位和運輸,并調節細胞的生長、分化、凋亡、衰老等基本生命活動[710]。在鞘脂合成途徑中,哺乳動物鞘脂類合成最終形成鞘磷脂,植物中形成復雜神經鞘脂質,而真菌最終形成甘露糖基化的肌醇磷酸神經酰胺。因此,神經酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神經酰胺(IPC)和甘油二酯的反應是真菌鞘脂合成所特有的[11](圖1)。催化這一反應的酶,肌醇磷脂酰神經酰胺合成酶(IPC合成酶)是鞘脂代謝中的關鍵酶,可作為篩選抗真菌藥物的靶標[12]。

圖1 不同生物中鞘脂代謝途徑Fig.1 The sphingolipid metabolic pathways in different organisms

短梗霉素A(aureobasidin A,Ab A)是從出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)R106培養液中分離得到的環狀九肽抗生素[13],對真菌和原生動物的生長有廣譜抑制作用。現已證實Ab A是真菌AUR1基因編碼的IPC合成酶的非競爭性抑制劑[14]。Ab A處理和AUR 1基因表達抑制均引起酵母細胞形態和組織結構變化,如微管消失、細胞周期循環阻滯,細胞膜和內膜系統完整性遭到破壞等[15-16]。通過在酵母等真菌中篩選抗Ab A突變體,發現突變體能抵抗Ab A引起的細胞形態和生長發育的異常,酵母AUR1基因158位的苯丙氨酸(Phe)突變為酪氨酸(Tyr)是獲得Ab A抗性的分子機制[17-19]。

迄今,對植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因在生長發育過程中的作用了解甚少,本試驗通過研究Ab A對灰葡萄孢菌及其突變體生長的影響,明確Ab A抑制真菌生長的機理,為真菌的防治和開發新型抗真菌藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

灰葡萄孢菌原始菌株Bc AUR1由浙江大學農業與生物技術學院李紅葉教授實驗室惠贈。灰葡萄孢菌突變菌株Bc AUR1a由本實驗室以Bc AUR1為原始菌株,通過紫外誘變,Ab A篩選[20]獲得,經鑒定和序列測定發現,該突變菌株AUR 1基因序列中缺失117～231位115 bp的內含子序列,但AUR1基因編碼的IPC合成酶的氨基酸序列未發生突變[21- 22]。

1.1.2 培養基和Ab A母液配制

含Ab A的PDA培養基：待滅菌PDA培養基涼至50℃,依次加入Amp(終濃度為100μg/m L)和Ab A,使Ab A終濃度分別為2、8和50μg/m L,混勻后鋪板;以相應濃度的甲醇代替Ab A,作為對照PDA培養基。

Ab A母液：Ab A購自寶生物公司,用甲醇配成濃度為2 mg/m L的母液,存儲在4℃冰箱中,備用。

其他所有試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰葡萄孢菌的培養

保存菌種用平板畫線法接種于PDA培養基上, 28℃恒溫倒置培養一周,待其菌絲變為灰色并產生孢子,無菌水洗下孢子,調整孢子的濃度為1×107個/m L,4℃保存備用。

1.2.2 灰葡萄孢菌對Ab A的敏感性測定

將野生型灰葡萄孢菌及其突變體的孢子懸浮液分別取100μL接種于對照平板和含不同濃度Ab A的PDA平板上培養6 d,觀察菌落生長狀況。

1.2.3 灰葡萄孢菌侵染柑橘試驗

先用清水將柑橘表面洗干凈,然后在超凈臺中依次用無菌水、70%乙醇清洗,晾干。將柑橘分為4組,每組10個。用無菌針在柑橘表皮上刺1個1 mm左右的傷口,試驗組在傷口表面均勻涂布5μL 50μg/m L的Ab A,晾干。對照組均勻涂布5μL2.5%甲醇。分別將5μL Bc AUR1和Bc AUR1a的孢子懸液(1×107個/m L)均勻涂布于對照組和試驗組柑橘傷口處,置于保濕器皿中,室溫(20±2)℃下培養4 d,觀察感染情況。

1.2.4 Ab A對灰葡萄孢菌細胞形態的影響

分別將灰葡萄孢菌Bc AUR1孢子懸液接種于含8μg/m L Ab A的PDA平板和對照平板上,25℃培養3 d。用2.5%的戊二醛溶液4℃固定過夜,按常規透射電鏡樣品制備方法制備樣品[23]。將制備好的樣品在Reichert超薄切片機中切片,獲得70～90 nm的薄片,經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色15 min后,在日本JEOL公司生產的JEM-1230型透射電鏡中觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 AbA敏感性測定

結果表明,野生株Bc AUR1在2μg/m L Ab A的培養基上能夠生長;Ab A為8μg/m L時,生長受到嚴重抑制;當Ab A濃度達到50μg/m L時,未見菌體生長(圖2)。突變株Bc AUR1a在Ab A濃度為2～50μg/m L的培養基上均能生長(圖2),表明突變菌株Bc AUR1a對Ab A產生了抗性[20]。

圖2 灰葡萄孢菌對AbA敏感性測定Fig.2 Determination of the susceptibility of Botrytis cinerea to AbA

2.2 突變株Bc AUR1a對Ab A處理柑橘的侵染

2.5%甲醇處理的對照組柑橘全部被野生株Bc AUR1感染(圖3a),50μg/m L Ab A處理的試驗組柑橘均未被野生株Bc AUR1感染(圖3b),說明Ab A抑制了野生株Bc AUR1對柑橘的侵染,能夠有效防治柑橘灰霉病的發生。而突變株Bc AUR1a則對試驗組和對照組柑橘都能侵染[21](圖3c～d),說明Ab A不能抑制突變株BCAUR1a對柑橘的侵染,突變株Bc AUR1a產生了Ab A抗性。

圖3 AbA對灰葡萄孢菌侵染柑橘的影響Fig.3 Effects of AbA on infection of Botrytis cinerea in citrus

2.3 Ab A對灰葡萄孢細胞形態的影響

未經Ab A處理的灰葡萄孢Bc AUR1細胞壁較厚,細胞壁表面界限和表面物質清晰可見;細胞質膜平滑連續,緊貼細胞壁;內膜系統豐富,線粒體膜完整,嵴豐富而粗壯,液泡膜完整,細胞質中富含糖原顆粒(圖4a～b)。在8μg/m L的Ab A作用下,細胞明顯變小,細胞壁變薄,細胞壁和細胞質膜表面粗糙不平,皺縮明顯,部分質膜和液泡膜破裂;內膜系統的部分膜界限不清晰,線粒體腫脹,糖原顆粒和細胞內容物顯著減少[24](圖4c～f)。表明Ab A抑制了IPC合成酶的活性,導致鞘脂類合成代謝受阻,細胞膜結構受到嚴重影響,質膜和內膜系統形態異常,發生褶皺甚至破裂,造成細胞內糖原和內容物泄漏。

圖4 灰葡萄孢菌細胞形態的透射電鏡圖片Fig.4 Transmission electron microscopy images of Botrytis cinerea’s morphology

3 討論

Ab A能抑制多種真菌的生長,對假絲酵母(Candida)、曲霉(Aspergillus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等病原真菌均有抑制作用[2526]。我們通過Ab A對灰葡萄孢菌野生株BcAUR1及其AUR1基因但內含子缺失的突變株Bc AUR1a抑制作用的研究,也證實低濃度Ab A(8μg/m L)能夠顯著抑制灰葡萄孢菌野生株Bc AUR1的生長,高濃度Ab A(50μg/ mL)則完全抑制其生長,但突變株Bc AUR1a則不受Ab A的影響,在高濃度Ab A存在下亦能正常生長。灰葡萄孢菌感染柑橘的試驗也證實了這一結果。這些結果均表明Ab A通過抑制IPC合成酶的活性,導致鞘脂合成不足,從而抑制了灰葡萄孢菌的生長。試驗中突變株BcAUR1a是AUR1基因中缺失內含子,產生了AbA抗性,抵抗Ab A對灰葡萄孢菌生長的抑制,說明該內含子可能在AUR1基因表達調控中發揮重要的作用,目前已有許多研究表明內含子具有調控基因轉錄的功能,在其序列中發現了轉錄調控元件,起著啟動子、增強子和抑制子的作用[2728]。

鞘磷脂是細胞膜的重要組成成分,特別是生物膜脂筏(lipid raft)結構中的主要物質,鞘磷脂還與細胞信號轉導、胞吞、胞飲等密切相關[10,29]。本研究發現,Ab A導致灰葡萄孢細胞質膜和內膜系統形態異常,質膜和液泡膜斷裂,導致細胞內物質泄露,從而抑制了細胞生長。進一步證實了Ab A使神經酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神經酰胺的反應受阻,導致鞘磷脂類物質的合成量不足,細胞膜結構遭到破壞,造成糖原等細胞內物質泄露。

綜上所述,Ab A抑制絲狀真菌生長的機理是抑制了IPC合成酶的活性,導致鞘磷脂類物質的合成不足,細胞膜結構遭到破壞,細胞內物質外漏。

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(責任編輯：田 喆)

Effects of aureobasidin A on Botrytis cinerea’s growth

Zhao Hongxia, Gou Ping, Liu Xiaoping, Liu Shenghong, Guo Xingjun

(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

In order to clarify the mechanism of aureobasidin A(Ab A)inhibiting the growth of fungi,the effects of Ab A on the growth of B.cinerea wild strain Bc AUR1 and strain Bc AUR1a with deletion of the intron of AUR 1 gene were investigated.The experiments of Ab A sensitivity showed that low concentration of Ab A(8μg/m L)significantly inhibited the growth of Bc AUR1,and there was no sign of Bc AUR1 growth under high concentrations of Ab A(50μg/m L).However,Ab A had no impacts on Bc AUR1a,which could grow normally at low or high concentrations of Ab A.Additionally,Ab A could inhibit infection of Bc AUR1 to citrus fruits,but Bc AUR1a could infect citrus fruits effectively even at the presence of high concentration of Ab A.Both results confirmed that Bc AUR1a had a resistance to Ab A.The observation by electron microscopy showed that Ab A caused morphological abnormality of Bc AUR1 cell membrane and inner membrane system,the fracture of plasmalemma and tonoplast,and the leakage of intracellular substances.The mechanisms that Ab A inhibited the growth of B.cinerea was that IPC synthetase was inhibited,which caused insufficient synthesis of sphingomyelin substances,damage of cell membrane structure and leakage of intracellular substances.

Botrytis cinerea; inositol phosphatidyl ceramide(IPC)synthase; aureobasidin A; cell morphology

S 476.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.007

2014-09-29

2015-02-23

國家自然科學基金項目(31160031)

*通信作者 E-mail：gou_ping@sina.com