枯草芽胞桿菌胞外抗菌蛋白的初步分離及性質的研究

黃 娜, 周莉質, 費 丹, 施揚瑋, 徐 輝, 檀根甲

(安徽農業大學植物保護學院,合肥 230061)

枯草芽胞桿菌胞外抗菌蛋白的初步分離及性質的研究

黃 娜, 周莉質, 費 丹, 施揚瑋, 徐 輝, 檀根甲*

(安徽農業大學植物保護學院,合肥 230061)

土壤中分離的枯草芽胞桿菌,其發酵液對蘋果炭疽病菌具有很強的抑制作用。為了確定其抑菌物質的主要成分,本試驗采用硫酸銨分級沉淀獲得無菌濾液中的抗菌蛋白粗提物,超濾后經過聚丙烯酰胺凝膠電泳,膠帶回收進行分離鑒定,得到1種具有抑菌活性的蛋白條帶。該蛋白對供試的6種植物病原真菌具有抑制作用,該蛋白的活性表現在80℃,30 min仍有抑菌作用,對p H(4～7)具有一定的適應范圍、另外對紫外照射(0～12 h)、抑制劑、有機溶劑均不敏感。質譜鑒定該條帶含有兩種蛋白,分別為假定蛋白BSU35980 gi|16080651,相對分子量11 079 Da,等電點4.78,匹配率為68%;絲氨酸羥甲基轉移酶gi|16080743,相對分子量為45 575 Da,等電點為5.56,匹配率為67%。顯微觀察發現抑菌蛋白可以使菌絲發生斷裂、扭曲、畸形、腫大。

枯草芽胞桿菌; 凝膠電泳; 理化性質; 質譜鑒定

枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)是一種常見的植物內生菌,也是土壤和植物微生態的優勢微生物種群,它具有很強的抗逆能力和抑菌作用[1],許多被分離的植株都已經成功地用于植物病害的生物防治[2]。如蔣躍明采用枯草芽胞桿菌培養液和多抗霉素處理荔枝果實,可以有效地防治荔枝霜霉侵染引起的貯藏病害,以兩者混合處理效果最好[3];趙白鴿、孔建等用枯草芽胞桿菌B-903防治蘋果輪紋病取得了很好的防效[4]。它的抑菌機理包括競爭作用、拮抗作用和誘導植物抗病性等。已報道的有抑菌作用的物質包括低分子量抑菌肽[5]、抑菌蛋白[6]和揮發性抑菌物質[7]等。

本試驗從土壤中分離的枯草芽胞桿菌,使用硫酸銨分級沉淀法從該菌胞外代謝液中分離粗蛋白,并用聚丙烯胺凝膠電泳切膠回收初步純化粗蛋白,得到一種抗菌蛋白條帶,對該蛋白條帶的抗真菌活性和部分理化性質進行了研究,并用質譜鑒定了該蛋白的結構,為以后的基因工程研究和生物農藥研發奠定了理論基礎。同時本試驗也觀察了抑菌蛋白對病原菌菌絲形態的影響,為以后的抑菌機理的深入研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 拮抗細菌

枯草芽胞桿菌(B.subtilis)從土壤中分離,由安徽農業大學植物保護學院植物病理實驗室保存。

1.1.2 供試病原菌

蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum),由安徽農業大學植物保護學院植物病理實驗室提供。

1.1.3 培養基的制備

細菌固體培養采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(NA)(蛋白胨1%,牛肉膏1%,氯化鈉0.5%,瓊脂粉15～20 g,p H 7.2～7.4);液體培養采用牛肉膏蛋白胨液體培養基(NB);真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉15～20 g)。

1.2 枯草芽胞桿菌發酵液抑菌物質的分離

1.2.1 枯草芽胞桿菌發酵液制備

從斜面培養基中挑取菌體接入NB液體培養基中,28℃、180 r/min振蕩培養48 h,配制成細菌發酵液。4℃,8 000 r/min,離心30 min,去掉沉淀,用0.45μm濾膜過濾發酵上清液,得到無菌濾液,即為抑菌物質粗提物。

1.2.2 硫酸銨沉淀法提取粗蛋白

向無菌濾液中加入硫酸銨。4℃靜置12 h,然后4℃,8 000 r/min,離心30 min。將沉淀溶于0.02 mol/L、p H 7.4的磷酸緩沖液中,即得到粗提蛋白。利用微量分光光度計測定蛋白的濃度。4℃保存備用。

1.3 枯草芽胞桿菌粗提蛋白的純化

1.3.1 枯草芽胞桿菌粗提蛋白的超濾濃縮

將粗提蛋白緩慢加入截留分子量為3 k Da容積為5 m L的超濾離心管,5 000 r/min,4℃離心40 min后,向離心管中加入2 m L超純水,重復上述步驟3～4次,當離心管中液體少于200μL時,順著邊緣插入槍頭,輕輕吹打,混勻蛋白液,注意不要碰到超濾膜,然后吸取濃縮液,直到吸完。收集濃縮除雜的樣品,用0.45μm的細菌過濾器對樣品進行除菌處理,利用微量分光光度計測定蛋白的濃度。4℃保存備用。

1.3.2 枯草芽胞桿菌粗提蛋白的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制10%的分離膠10 m L,迅速沿著玻璃壁灌入玻璃板的縫隙至開口處,加上一層超純水壓平凝膠上端,靜置30 min,灌注5%的層積膠至玻璃板頂端,插入梳子,室溫下靜置聚合30 min以上。待層積膠完全凝固后,拔出梳子,倒入非變性電泳緩沖液,取超濾得到的蛋白樣品上樣8個孔,每孔大約上樣30μL。然后電泳,先用70 V恒壓運行30 min,再100 V恒壓運行2 h,停止電泳,整個操作過程保持恒溫4℃,以防止蛋白質變性。剝膠后先用超純水清洗,把凝膠兩邊的兩個泳道的條帶切去進行考馬斯亮藍R-250染色和快速脫色(40%甲醇和10%乙酸),剩余的凝膠置于4℃冰箱保存。

1.3.3 蛋白條帶的切膠回收

將凝膠放置在白色底板上以增強顏色對比效果,使蛋白條帶更易于辨認。將脫色后的膠條中目的蛋白質區間與未染色的凝膠中相應區間相互對應,推斷出未染色凝膠中目的蛋白質的大致位置,用無菌刀片切下含蛋白質的膠條,逐一將膠條置于無菌研缽中充分研磨,收集研磨后的碎膠塊置于50 m L離心管中,加入適量的非變性電泳緩沖液,混勻后將離心管置于4℃冰箱中。多次浸泡使回收率最大。然后將樣品冷凍干燥濃縮,-20℃冰箱保存,使用前將其用無菌水配制成蛋白濃度為

0.02 mg/m L。

1.3.4 回收的膠條抑菌活性的檢測

采用PDA平板對峙培養法檢測分離的各個條帶蛋白質的抑菌活性,配制蘋果炭疽病菌分生孢子懸浮液1×105個/m L,均勻地涂在PDA平板上,用無菌打孔器在平板上均勻打孔,在孔中分別加入50μL樣品,放在25℃培養箱中培養48 h,根據樣品周圍抑菌圈的大小確定樣品對蘋果炭疽病菌抑制作用,每個試驗重復3次。

1.3.5 抑菌蛋白對蘋果炭疽病菌菌絲形態的影響

根據PDA平板對峙培養法,選取抑菌圈最大的一個部分,用接種環挑取與炭疽病菌菌塊交界處的菌絲于顯微鏡下觀察,以正常的菌絲作對照。

1.3.6 抑菌蛋白對其他5種病原菌的抑制作用

采用PDA平板對峙培養法,在活化的病原真菌平板上用滅菌打孔器(直徑為5 mm)制備菌餅,將菌餅接在PDA平板上,同時用無菌打孔器在菌餅周邊等距離的位置打孔,在孔中加入50μL樣品。在25℃培養箱中培養2～5 d,根據樣品周圍菌絲的生長情況與對照組的比較,確定對病原真菌菌絲生長的抑制作用。

1.4 抑菌蛋白的理化性質

1.4.1 溫度對蛋白質抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別在20、40、60、80、100、121℃處理30 min,分別以不做處理的蛋白溶液和無菌水作為對照,以蘋果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對峙法測定抑菌圈直徑,每個處理重復3次。抑菌圈直徑(mm)=對照的菌落直徑-處理組的菌落直徑;下同。

1.4.2 p H對蛋白質抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別用0.1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液調節p H為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,分別用不做處理的蛋白溶液和無菌水作為對照,以蘋果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對峙法測抑菌圈直徑,每個處理重復3次。

1.4.3 紫外照射對蛋白抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別用紫外照射0、2、4、6、8、10、12 h,分別用不做處理的蛋白溶液和無菌水作為對照,以蘋果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對峙法測抑菌圈直徑,每個處理重復3次。

1.4.4 抑制劑對蛋白質抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別用0.5 mg/mL EDTA、0.002 mg/ mL SDS、6 mg/mL DDT等體積混合,分別用加無菌水的蛋白溶液和無菌水作為對照,以蘋果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對峙法測抑菌圈直徑,每個處理重復3次。

1.4.5 有機溶劑對蛋白質抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別與丙酮、氯仿、甲醇、乙醚、乙酸乙酯等體積混合后,分別用加無菌水的蛋白溶液和無菌水作為對照,以蘋果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對峙法測抑菌圈直徑,每個處理重復3次。

1.5 抑菌蛋白的質譜技術鑒定

將抑菌蛋白進行酶解,抽提酶解肽段,ESI質譜,然后用軟件分析數據,對質譜鑒定的原始譜圖數據進行標峰,得到帶有質荷比和峰強度信息的peaklist文件,對質譜數據和理論譜進行質量上的匹配和打分,最后從鑒定的肽段中得到鑒定蛋白。

2 結果與分析

2.1 枯草芽胞桿菌發酵液中抑菌蛋白的分離及其對蘋果炭疽菌的抑制作用

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶(圖1)顯示,該粗提蛋白含有6種蛋白。抑菌結果(圖2)表明,只有6號條帶對蘋果炭疽菌具有抑菌作用。

圖1 粗蛋白的非變性聚丙烯胺凝膠電泳Fig.1 PAGE of crude proteins

圖2 回收蛋白條帶對蘋果炭疽病菌的抑制作用Fig.2 Inhibition of Colletotrichum gloeosporioides by recovered proteins

顯微觀察蘋果炭疽病菌菌絲經蛋白處理后,菌絲形態如圖3所示,正常的菌絲形狀比較規則,細長,而經蛋白處理后的菌絲發生斷裂、扭曲、畸形、腫大。

圖3 抗菌蛋白對蘋果炭疽病菌菌絲形態的影響Fig.3 Effects of antifungal proteins on Colletotrichum gloeosporioides mycelia

2.2 抑菌蛋白對其他病原菌菌絲的抑制作用

試驗結果(圖4)表明,該抑菌蛋白對小麥赤霉病菌(F.graminearum)、小麥紋枯病菌(R.cerealis)、水稻紋枯病菌(R.solani)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(S.sclerotiorum)的菌絲生長均有抑制作用。

圖4 抑菌蛋白對5種病原菌菌絲的抑制作用Fig.4 The inhibition of five pathogenic fungus mycelia by antifungal proteins

表1 不同處理條件對蛋白質抑菌活性的影響1)Table 1 Influences of different conditions on the bacteriostatic activity of proteins

2.3 抑菌蛋白的理化性質

由表1可以看出,抑菌蛋白在20～60℃處理30 min的情況下,其活性沒有明顯的變化,80℃處理30 min雖然有所下降,但仍具有抑菌作用,說明該蛋白具有一定的耐熱性;抑菌蛋白在p H 4～7抑菌活性保持穩定,當p H高于7時,抑菌活性有所下降;紫外照射和經抑制劑、有機溶劑處理對抑菌蛋白的抑菌活性均沒有影響。上述結果表明,該抑菌蛋白具有較好的穩定性。

2.4 抑菌蛋白的質譜檢測

對蛋白6號條帶做質譜解析,結果(圖5)所示,峰上標有數字(m/z值)的表示相應的峰有肽段匹配上;峰強度小于最大強度的5%時用粗體表示。數據庫檢測結果(表2)所示,表中的分值為鑒定結果得分,由Mascot數據分析軟件檢測NCBI數據庫中細菌全庫,通過計算得出分值在65分以上的結果可信(P＜0.05)。本結果有2種蛋白的分值超過65,分別為假定蛋白BSU35980、絲氨酸羥甲基轉移酶,2種蛋白肽段的完整信息如表3所示,粗體標注的表示試驗肽段與數據庫蛋白理論肽段匹配的序列。

圖5 蛋白質條帶6的一級PMF譜圖Fig.5 The PMF of No.6 protein

表2 質譜鑒定蛋白質條帶6回收結果Table 2 The identification results of shot-gun for protein recovered from No.6 of Native-PAGE

3 結論與討論

目前對于枯草芽胞桿菌抗菌物質的研究已有相關報道。如沈錦玉等[8]通過濃鹽酸沉淀、乙醇抽提、離子交換層析和高效液相色譜法對枯草芽胞桿菌B115進行分離純化,最終得到分子量為803.6 Da的抑菌物質。黃麗麗等[9]通過硫酸銨分級沉淀、疏水層析、PAGE切膠電洗脫、陰離子交換層析從EIR-j發酵液中分離純化得到分子量為51.9 k Da的抗菌蛋白j1。

本試驗采取硫酸銨沉淀法、超濾濃縮、聚丙烯酰胺凝膠電泳切膠回收以及抑菌試驗得到抗菌蛋白,結果表明：該抗菌蛋白對供試的6種植物病原真菌具有抑制作用;該蛋白經80℃處理30 min仍有抑菌作用,對p H(4～7)具有一定的適應范圍、對紫外照射(0～12 h)、抑制劑、有機溶劑均不敏感;顯微觀察發現它可以使菌絲發生斷裂、扭曲、畸形、腫大;質譜鑒定,通過數據庫比對該蛋白條帶中含有Hypothetical protein BSU35980、Serine hydroxymethyltransferase兩種蛋白。但是,是哪種蛋白具有抑菌作用,筆者正嘗試對這兩種蛋白進行單克隆表達,然后分別做抑菌試驗進行分析。

表3 兩種蛋白質點對應肽段的完整信息Table 3 Complete information of peptides of two proteins

[1] 檀根甲,李增智,劉淑芳,等.枯草芽孢桿菌BS80-6對蘋果采后炭疽病的控病效果及作用機制[J].植物保護學報,2008, 35(3)：227-232.

[2] Tan Genjia,Fei Dan,Shi Yangwei,et al.Postharvest biological control of apple anthracnose by Bacillus subtilis BS80-6, A mutant strain through ion implantation[J].Plant Diseases and Pests,2014,5(3)：15-19.

[3] 蔣躍明,陳芳.生物菌防治荔枝采后病害的初步研究[J].果樹科學,1997,14(3)：14-15.

[4] 趙白鴿,孔建,王文夕.枯草芽孢桿菌B-903對蘋果輪紋病的抑制作用及其對病害的控制效果[J].植物病理學報,1997, 27(3)：213-214.

[5] Stein T.Bacillussubtilis antibiotics：structures,syntheses and specific functions[J].Molecular Microbiology,2005,56(4)：845-857.

[6] Monica S,Rita Z O,Ezio R,et al.A Bacillussubtilis secreted protein with a role in endospore coat assembly and function [J].Bacteriology,1999,181(12)：3632-3643.

[7] Chen H,Xiao X,Wang J,et al.Antagonistic effects of volatiles generated by Bacillus subtilis on spore germination and hyphal growth of the plant pathogen,Botrytis cinerea[J].Biotechnology Letters,2008,30(5)：919-923.

[8] 沈錦玉,尹文林,曹錚,等.枯草芽孢桿菌B115抗菌蛋白的分離純化及部分性質[J].水生生物學報,2005,29(6)：689-693.

[9] 黃麗麗,黃保全,康振生,等.小麥內生枯草芽孢桿菌E1R-j胞外抗菌蛋白的分離純化和性質[J].西北農業學報,2009,18 (6)：285-290.

(責任編輯：田 喆)

Primary separation of an extracellular antifungal protein from Bacillus subtilis

Huang Na, Zhou Lizhi, Fei Dan, Shi Yangwei, Xu Hui, Tan Genjia

(College of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230061,China)

Bacillus subtilis was isolated from the soil,and the fermentation liquid had strong inhibitory action against Colletotrichum gloeosporioides.In order to identify the antimicrobial compounds,the antimicrobial substances were isolated and purified by(NH4)2SO4fractional precipitation,ultrafiltration,PAGE-polyacrylamide gel electrophoresis,and tape reciting.The results showed that the purified active protein had inhibitory action to 6 plant pathogenic fungi.The protein was found to be stable at 80℃for 30 min.The inhibitory activity of the protein was observed in the range of p H value from 4 to 7,and not sensitive to ultraviolet radiation,inhibitor and organic solvents.Two kinds of proteins contained in this stripe were identified by mass spectrum.They were the hypothetical protein BSU35980 gi|16080651,with a relative molecular mass of 11 079 Da and isoelectric point (p I)of 4.78,and a matching ratio of 68%,and serine hydroxymethyltransferase gi|16080743,with a relative molecular mass of 45 575 Da and isoelectric point(p I)of 5.56,and a matching ratio of 67%.Microscope observation revealed that the protein could break up and enlarge the mycelia.

Bacillus subtilis; PAGE-polyacrylamide gel electrophoresis; physiochemical property; mass spectrum identification

S 476.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.008

2014-11-09

201503-04

安徽省教育廳自然科學重點科研項目(KJ2007A095)

*通信作者 E-mail：tgj63@163.com