松花菜花球腐爛病病原分離鑒定及室內藥劑篩選

王國榮, 劉曉曦, 吳金丹, 王文鳳, 蘇珍珠, 樓兵干*

(1.浙江省杭州市蕭山區農業技術推廣中心,杭州 311203;2.浙江大學生物技術研究所,

杭州 310029;3.安徽農業大學植物保護學院,合肥 230036)

松花菜花球腐爛病病原分離鑒定及室內藥劑篩選

王國榮1, 劉曉曦2, 吳金丹2, 王文鳳3, 蘇珍珠2, 樓兵干2*

(1.浙江省杭州市蕭山區農業技術推廣中心,杭州 311203;2.浙江大學生物技術研究所,

杭州 310029;3.安徽農業大學植物保護學院,合肥 230036)

松花菜花球腐爛病是近年來發生在浙江省松花菜種植區的一種嚴重病害,主要危害松花菜花球、花梗,引起花球變褐腐爛,花梗發黑枯萎,造成嚴重經濟損失。通過對松花菜花球腐爛病典型癥狀樣本的采集,病原菌的分離、純化,致病性測定,形態觀察,16S rDNA序列分析,脂肪酸分析和Biolog鑒定,明確病原菌為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dye。選擇8種殺菌劑采用K-B滅菌濾紙片法對病菌進行室內抑菌測定,結果表明,72%農用硫酸鏈霉素和PHMB對該病菌有較強的抑制作用,其次中生菌素和三氯異氰尿酸也有一定的抑制作用。

松花菜花球腐爛病; 殺菌劑; PHMB; 藥劑篩選

被譽為“有機花菜”的松花菜,其口感、形狀有別于傳統緊花型花菜。因其營養豐富、口感好,適宜速凍及脫水加工等優點,受到種植者與消費者的認可[12]。近年來松花菜種植發展迅猛,浙江省種植面積已超6 667 hm2。然而,在種植過程中出現一種引起花球腐爛的病害,這種病害在緊花型花菜中很少出現。該病害全年可見,春季最為明顯,嚴重田塊病株率可達30%～60%,已成為制約松花菜發展的最重要因素。對于該病害,生產上有人認為是凍害引起,有人認為是雨水過多引起,也有人認為是真菌病害,或者是缺素引起。而據我們觀察與診斷,這可能是一種細菌病害。為了探明引起浙江省松花菜花球腐爛的原因,我們對松花菜花球腐爛病的病原進行了分離鑒定,在室內對防治藥劑進行了篩選,以期對松花菜生產管理起到指導作用。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離

2012-2014年連續在浙江省杭州市蕭山區舒蘭農場、農一場、浙江勿忘農種業股份有限公司蕭山基地進行田間調查,采集已發病且具有典型癥狀的松花菜病株,裝入干凈牛皮紙袋中,帶回實驗室。取病健交界處組織,進行表面消毒后,采用平板畫線分離法在NA培養基(蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,蔗糖5 g,牛肉浸膏3 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 m L,p H 7.0～7.2)上分離純化[3],分離純化的菌株接入NA試管中,于4℃冰箱中保存備用。

1.2 致病性測定

健康松花菜幼苗由蕭山農業技術推廣中心提供,當苗長至5片葉時轉移到含600 g基質(草炭∶蛭石∶珍珠巖=4∶1∶1)的盆(250 mm×240 mm)中,置于溫室中,定時定量澆水和澆灌營養液;當松花菜長出花球后,用于1.1節中分離菌株的致病性測定。將分離純化的5株菌株,在NA培養基上培養36 h后,用無菌水洗脫細菌菌苔制成濃度約為108cfu/mL菌懸液,采用噴霧法接種于健康的松花菜花球上,針刺接種法接種于花梗和葉片主葉脈上,傷口法(用滅菌的手術剪蘸取菌液后在健康葉片上剪口)接種于葉片上,每株菌接種5株松花菜,以無菌水為對照,接種后套塑料袋保濕。定期觀察接種組與對照組花球、花梗、葉片和葉片主葉脈上的癥狀變化,記錄結果,待發病后從病斑上再次分離病原菌。

1.3 病原菌培養性狀與形態特征觀察

供試病原菌在NA平板培養基上培養48 h后觀察菌落形態,同時挑取培養了16～20 h的菌體,參照Schaad等[4]的方法進行革蘭氏染色。

1.4 病原菌16S rDNA擴增及序列分析

參照Liu等[5]的方法提取細菌基因組DNA,根據Edward等人[6]發表的細菌16S rDNA基因通用引物對分離的菌株進行PCR擴增。正向引物P1為：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3';反向引物P2為：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3',由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應體系為：10× PCR緩沖液(含Mg2+)5μL,d NTPs(10 mmol/L) 1μL,引物P1和P2(10 mmol/L)各1μL,模板DNA 2μL,Taq酶(5 U/m L)0.5μL,加dd H2O至總體積50μL;反應條件為：95℃預變性5 min; 94℃變性30 s,55℃退火l min,72℃延伸2 min, 35個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段,由上海生工生物工程有限公司測序,測序結果用BLAST軟件在Gen Bank上進行同源性比較。

1.5 病原菌的脂肪酸(FAME)鑒定

FAME鑒定采用美國Agilent 6890型氣相色譜系統。參照MIDI公司說明書及Xie等[7]的方法進行。供試菌株在TSBA培養基(30 g胰蛋白胨大豆肉湯,15 g瓊脂,1 000 m L蒸餾水)上,于28℃生長36 h后,用無菌接種環挑取一環培養菌放入有螺帽的試管中,提取脂肪酸。鑒定結果通過微生物鑒定系統軟件[美國MIDI公司開發的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定細菌的MIS 4.5(microbial identification system)和LGS 4.5(library generation software)]獲得。把分析結果與數據庫中標準菌種的脂肪酸信息進行比對。

1.6 病原菌的Biolog鑒定

采用Biolog公司生產的GN(革蘭氏陰性菌)測試板和GN數據庫,按照操作規程進行鑒定。病原菌在Biolog通用培養基BUGM(Biolog universal growth medium,51.7 g BUA瓊脂培養基,950 m L蒸餾水)上25℃培養24 h后用Biolog自動微生物鑒定系統進行鑒定。

1.7 室內殺菌劑篩選

1.7.1 供試殺菌劑

供試殺菌劑共8種,分別是：42%三氯異氰尿酸可濕性粉劑(湖南省海洋生物工程有限公司); 20%噻菌銅懸浮劑(浙江龍灣化工有限公司);20%噻唑鋅懸浮劑(浙江新農化工股份有限公司);72%農用硫酸鏈霉素可濕性粉劑(華北制藥股份有限公司);3%中生菌素可濕性粉劑(深圳諾普信農化股份有限公司);46%氫氧化銅水分散粒劑(美國杜邦公司);50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑(河南銀田精細化工有限公司);聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽(PHMB)可溶性粉劑(海寧中聯化學有限公司)。

1.7.2 試驗方法

室內有效殺菌劑篩選采用K-B濾紙片擴散法[8],菌株在NA培養基上培養24 h后,用滅菌水配成濃度約為108cfu/m L的細菌懸浮液,采用無菌棉棒均勻涂布于NA平板表面,涂菌后室溫干燥3～5 min。

初篩時,將8種藥劑配制成5 000 mg/L,用無菌鑷子夾直徑為6 mm的滅菌濾紙片浸泡于配制好的藥液中,浸泡片刻后立即將紙片平放于直徑為9 cm含菌NA平板表面,每皿貼3張紙片,以浸泡滅菌水的紙片為對照,重復3次,置于28℃培養箱中培養[9],培養36 h后觀察測量抑菌圈直徑。

將初篩試驗中產生抑菌圈的藥劑,繼續配制成濃度為2 000、1 000、500、200、100 mg/L的藥液,用上述同樣的方法測定抑菌圈直徑。

1.7.3 數據統計與分析

統計不同藥劑的不同濃度處理下的抑菌圈直徑,采用SPSS 16.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 病害田間癥狀

引起松花菜花球腐爛病的病菌主要危害花球、花梗,也能夠侵染葉片。該病害最典型的癥狀是在花球或花蕾上形成深褐色斑點然后腐爛?；ㄇ虬l病初期出現黃色、黃褐色水漬狀斑點(圖1a),隨后斑點擴大并增加,由黃褐色轉呈深褐色或黑色并腐爛(圖1b),病斑從花蕾向花梗擴展,形成“V”字形黑色病斑(圖1b),潮濕時病部組織用手觸摸有黏膩感。葉片發病從葉緣開始向葉內和兩側呈“V”形擴展,病健交界處不明顯,病斑邊緣常具黃色暈(圖1c),但田間調查發現葉片較少表現出癥狀。

2.2 病原菌分離與致病性測定

從具有典型花球腐爛病癥狀的松花菜病健交界處取樣,制成臨時玻片,在光學顯微鏡下觀察,可見從病組織中噴出大量細菌。從病部共分離純化到12株細菌菌株,分別是XHC-1、XHC-2、XHC-3、SHC-1、SHC-2、SHC-3、SHC-4、SHC-5、SHC-6、SHC-7、SHC-8和SHC-9。

將上述12株菌株在NA平板上畫線培養36 h,然后分別接種到健康的松花菜花球、花梗、葉片和主葉脈上。結果表明,菌株之間的致病性有差異,花球、花梗、葉片和主葉脈上接種菌株XHC-1、XHC-2、SHC-4、SHC-7、SHC-8、SHC-9后不發病;而接種菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6后第3～7天出現典型癥狀(圖1d～g),且病斑癥狀與田間癥狀一致,從接種后發病部位分離的菌株與供試細菌菌株的菌落特征相同,而接種無菌水的對照未見任何癥狀。選取菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6進一步進行鑒定。

在所取微元內各個表面所受到的應力可以認為是均勻分布的，根據材料力學中廣義胡克定理可知，微元在三向應力應變關系如式（4）所示。

2.3 病原菌培養形狀與形態特征觀察

從病部分離純化的細菌菌株在NA培養基上畫線培養后48 h出現形態一致的單菌落,菌落直徑約為1～2 mm,黃色,圓形凸起,邊緣整齊,菌落較稠,乳脂狀不透明(圖1i),革蘭氏染色反應陰性。

2.4 病原菌16S rDNA擴增及序列分析

以菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6的總基因組DNA為模板,用引物P1和P2進行PCR擴增,均擴增出約1.5 kb的PCR產物(圖2),產物純化回收后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。結果表明,5株菌的測序結果一致。將SHC-1的測序結果提交至NCBI的核酸數據庫(登錄號為KP182149),用BLAST軟件進行同源性比較,通過與GenBank中的核酸數據進行比對分析,結果表明分離菌株與野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris) (登錄號為KF057196.1)相似度最高,為99%。

2.5 病原菌的脂肪酸(FAME)鑒定

FAME鑒定結果匹配程度遵循Buyer等[12]的原則：相似性系數＜0.2,結果不可用;相似性系數≥0.5,鑒定到種。供試病原細菌菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6的FAME鑒定結果與16S r DNA的鑒定結果一致,與X.campestris pv. campestris最相似,相似度分別為0.75、0.76、0.73、0.68、0.72。

供試菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6在BUGM培養基上培養24 h后,經Biolog自動微生物鑒定系統鑒定,結果表明,5株菌與X. campestris pv.campestris相似系數均大于0.5,分別是0.73、0.70、0.69、0.75、0.71。

2.7 室內藥劑篩選結果

K-B滅菌濾紙片法試驗結果表明：供試的8種殺菌劑對松花菜花球腐爛病菌的抑菌作用不同。72%農用硫酸鏈霉素WP、PHMB和三氯異氰尿酸對病菌有較好的抑制作用,其中PHMB在濃度為100 mg/L時仍有明顯的抑菌圈產生,中生菌素對病菌的生長有一定的抑制作用,而氯溴異氰尿酸僅在高濃度下對病菌有一定的抑制作用,氫氧化銅從高濃度到低濃度都可見抑菌圈,但都很小;噻唑鋅和噻菌銅在高濃度下對病菌也無抑制作用(表1)。

圖1 松花菜花球腐爛病癥狀、致病性試驗結果和病原菌單菌落形態Fig.1 Symptoms of broccoli flower-ball rot disease,results of pathogenicity and single colonies on NA medium

圖2 引物P1、P2對分離菌株的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of pathogenic bacterial strains using primers P1/P2

3 結論與討論

(1)從浙江省杭州市蕭山區采集的典型松花菜花球腐爛樣本中分離的菌株,經致病性測定、病原形態觀察、16S rDNA序列分析、脂肪酸鑒定和Biolog鑒定,明確為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種[Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dye]。此菌也稱甘藍黑腐病菌。大量文獻記載：甘藍黑腐病菌引起十字花科蔬菜黑腐病,在我國主要危害甘藍、結球白菜、不結球白菜、薹菜、芥菜、花椰菜、球莖甘藍、芥藍、青花菜、抱子甘藍、蕪青甘藍、羽衣甘藍、紫甘藍、蘿卜、薺菜等10余種十字花科蔬菜[10],該病菌主要危害十字花科蔬菜的葉片、葉柄和葉脈,對松花菜花球的危害卻鮮有報道。在浙江省調查的松花菜上,該病原菌主要危害花球,田間葉片很少見到癥狀,因此,我們把引起浙江省松花菜花球腐爛的病害稱為“松花菜花球腐爛病”。

(2)本次試驗測定了8種殺菌劑對病原菌株的抑菌效果,結果表明PHMB、農用硫酸鏈霉素和三氯異氰尿酸對病菌的抑制效果較好,中生菌素也有一定的抑制效果,而噻唑鋅、噻菌銅對該病菌無抑制作用。測定結果可為松花菜花球腐爛病的田間藥劑試驗提供基礎,但由于采用濾紙片法測定,結果受到藥劑溶解性和擴散能力的影響,具一定局限性,同時也與藥劑產品批號等有關。

表1 8種殺菌劑對病原菌菌株SHC-1的抑菌效果1)Table 1 Inhibition effect of 8 fungicides on the pathogen SHC-1 at different concentrations

(3)聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽是一種廣譜抗菌素,對細菌、真菌和酵母菌等均有殺滅作用,長期以來被廣泛用于醫藥行業,以及化妝品、個人護理產品、紡織品、食品工業等[7]。本次試驗表明PH MB對松花菜花球腐爛病病原菌具有較好的抑制作用,可為今后PH MB用于植物病害防治提供參考。

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(責任編輯：楊明麗)

Isolation,identification and fungicide screening of the pathogen of broccoli flower-ball rot disease in laboratory

Wang Guorong1, Liu Xiaoxi2, Wu Jindan2, Wang Wenfeng3, Su Zhenzhu2, Lou Binggan2

(1.Xiaoshan Agricultural Technology Extension Centre of Hangzhou City,Zhejiang 311203,China; 2.Institute of Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China;3.College of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Broccoli flower-ball rot disease has become a serious disease in recent years in broccoli-producing areas of Zhejiang Province.It mainly infects the flower-ball and stalks of broccoli,causing the flower-ball brown and rot,and the stalks black and withered,and finally leads to a serious economic loss.In this study,we collected samples with typical symptoms of this disease,isolated and purified the pathogen,and then conducted a series of experiments,including the pathogenicity determination,observation on morphological characteristics,analysis of 16S r DNA gene sequences and fatty acid methyl esters(FAME),and Biolog identification.All of these results showed that the pathogen was Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dye.Moreover,we selected 8 kinds of fungicides to do the bacterial inhibition assay in the laboratory with K-B sterile filter paper.The results showed that 72%agricultural streptomycin sulfate and PHMB had strong inhibition action to the pathogen,and zhongshengmycin and trichloroiso cyanuric acid also had inhibition action to the pathogen to a certain extent.

broccoli flower-ball rot disease; fungicide; PHMB; fungicide screening

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.011

2014-12-09

2015-02-02

浙江省“三農六方”資助項目(N20120623)

*通信作者 E-mail：bglou@zju.edu.cn