蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病病原鑒定及其生物學特性

張佳環, 劉 巍, 潘 姣, 邵璽文, 王志春,敖振超, 柳 建, 劉 暢, 馬周杰

(1.吉林農業大學農學院,長春 130118;2.吉林農業大學農業現代化綜合技術研究所,長春 130118;3.中國科學院東北地理與農業生態研究所,長春 130012)

蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病病原鑒定及其生物學特性

張佳環1*, 劉 巍1, 潘 姣1, 邵璽文2, 王志春3,敖振超1, 柳 建1, 劉 暢1, 馬周杰1

(1.吉林農業大學農學院,長春 130118;2.吉林農業大學農業現代化綜合技術研究所,長春 130118;3.中國科學院東北地理與農業生態研究所,長春 130012)

對蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病病原進行了分離、鑒定和生物學特性的研究。結果表明,該病原菌菌核黑色圓球狀,表面凸凹形態,直徑164～309μm,內部褐色擬薄壁組織;分生孢子淡褐色,1～3個隔膜,大小為(32～76)μm ×(5～22)μm;無性世代為Nakataea sigmoidea,有性世代為Magnaporthe salvinii。病原菌在25～30℃時生長較好,利用鼠李糖(P＜0.05)、硝酸鈣(P＜0.05)和硫酸鋅(P＜0.01)能力最強,在利用碳氮源和微量元素方面,與弱酸性和寒冷地水稻稈腐菌核病病原存在差異。

蘇打鹽堿地; 水稻稈腐菌核病; 病原; 菌核; 特性

水稻稈腐菌核病是于1876年在歐洲的意大利首次發現[1]。隨后,在全世界各大洲水稻種植區陸續都有報道[1-4]。1964年,在我國臺灣省首次發現[1]。之后,在南方稻區,并逐漸在東北各省的稻區被發現[5-10]。意大利學者Cattaneo描述了水稻稈腐菌核病病原的菌核形態,并將其命名為Sclerotium oryzae Catt.,隨后又通過多個學者的反復修正,不斷演變[1,10]。直至目前,此病害病原的無性繁殖階段被確定為半知菌Nakataea sigmoidea(Cavara)Hara,或者N.irregular Hara;有性繁殖階段為子囊菌Magnaporthe salvinii(Catt.)R.A.Krause&R.K.Webster[1,10-11]。有學者根據無性繁殖階段兩種病原菌的形態特征,以及引起的癥狀不同,又將水稻稈腐菌核病再分為小球菌核病和小黑菌核病[4,12]。

自從在我國發現水稻稈腐菌核病以來,此病就在水稻產區經常發生,有時甚至造成嚴重危害[12-13]。因此,相關學者對此病害給予了足夠的重視,反復研究病原的特性、病害的發生發展規律,以及探討有效的防治措施等[12-16]。近年來,在吉林省西部蘇打鹽堿地,水稻稈腐菌核病不斷發生和流行[1718]。本文針對水稻稈腐菌核病在蘇打鹽堿地的致病性、病原形態和分子生物學特征,以及生物學特性進行了深入研究,旨在為該病害的田間早期診斷和綜合防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離及鑒定

1.1.1 病樣采集及病原菌的分離

2009年10月和2010年10月,在吉林省的大安市和黑龍江省的綏化市,分別在水稻品種‘長白9’和‘龍粳25’上,采集到水稻稈腐菌核病的莖稈菌核樣品。揚州大學的紀兆林老師在江蘇省揚州市,從‘揚粳4227’水稻品種上,為我們采集到水稻稈腐菌核病的莖稈菌核樣品。2011年7月,在吉林省的大安市,在‘長白9’水稻品種上,又采集了水稻稈腐菌核病的莖稈病斑樣品。

菌核分離法：取發病莖稈中的菌核,在70%乙醇中消毒30 s,再用無菌水清洗3遍,待菌核干燥后放于PDA培養基上,每個培養皿5個菌核,28℃恒溫培養箱中培養。

組織分離法：將新鮮病斑用水沖洗干凈后,用刀片將病健交界處切成邊長2 cm左右的小方塊, 0.1%升汞消毒30 s,再用無菌水清洗3遍。待切塊干燥后放于PDA培養基上,每個培養基4個切塊,于28℃恒溫培養箱中培養。

1.1.2 致病性測定

在發病的水稻品種‘長白9’植株上,分別得到菌核分離物CHB9菌株和病斑分離物CHB8945菌株。之后,在PDA培養基上,培養菌株CHB9和CHB8945,使其產生菌核。溫室內栽培水稻品種‘長白9’,每桶水稻3穴。移栽后3周,利用產生的菌核直接均勻撒播在桶內的稻株莖基部接種,每桶500個菌核。4周后,水稻開始發病。以不撒播菌核的為陰性對照。

1.1.3 病原菌核顏色形態觀察和測定

利用超景深顯微鏡(digital microscope,keyence VHX-600)觀察菌核表面形態及色澤,分別測量100個菌核的直徑;取自然產生的和在PDA培養基上形成的菌核,制作石蠟切片[19]觀察內部結構。

1.1.4 病原菌分生孢子顏色形態觀察

將菌核于水瓊脂中培養來產生分生孢子及分生孢子梗[6,20],在超景深顯微鏡下觀察其形狀、顏色,測量大小。

1.1.5 病原菌ITS-r DNA序列擴增及分析

采用CTAB法,從病原菌的菌絲中提取DNA,用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA[21]。PCR擴增病原菌的ITS區域,使用通用引物,ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。擴增體系為10×PCR buffer 2.5μL; 25 mmol/L MgCl21.0μL;d NTP 2.0μL;Taq DNA酶0.5μL;模板DNA 1.0μL,無菌雙蒸水定容到25μL。PCR反應條件為：95℃預變性5 min;95℃變性1 min,48.5℃退火50 s,72℃延伸1 min,共35個循環;72℃水浴10 min,4℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,將該擴增產物送上海生物工程有限公司進行純化并測序。將測序結果登錄NCBI網站(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),進行序列BLAST。之后下載一致性較高的序列8個,并用Clustal X(1.8)軟件進行多重序列比對后,再用MEGA(4.0)軟件構建系統發育樹。

1.2 病原菌的生物學特性

分別從江蘇省揚州市‘揚粳4227’(弱酸性土壤)和黑龍江省綏化市‘龍粳25’(寒冷地)的水稻品種上,分離得到水稻稈腐菌核病菌株YJ4227和LJ25。以這2個菌株作對照,與CHB9菌株(從吉林省大安市發病的‘長白9’水稻品種上得到的菌核分離物)一起,進一步做病原菌生物學特性研究。

1.2.1 不同溫度下病原菌的生長

采用生長速率法。設置溫度為5、10、15、20、25、30和35℃。將供試菌株在PDA培養基上培養4 d,制備8 mm菌餅備用。取菌餅倒置于PDA培養基中心。放在上述溫度的恒溫培養箱中,每個溫度3次重復。采用十字交叉法定時測量菌落直徑,并對所得數據用SPSS軟件進行方差分析。

1.2.2 不同碳源條件下病原菌的生長

供試碳源為鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖+葡萄糖和鼠李糖+蔗糖10種碳源,以Czapek為基礎培養基,分別用供試碳源替換基礎培養基中的蔗糖,對照為不加碳源的培養基。取8 mm菌餅倒置在上述不同碳源培養基中心,3次重復,在28℃恒溫培養箱中培養。采用十字交叉法,培養4 d,測量菌落直徑,其他同1.2.1。

1.2.3 不同氮源條件下病原菌的生長

供試氮源為硝酸鈣、硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、草酸銨、氯化銨、天冬酰胺、尿素和碳酸銨10種,以Czapek為基礎培養基,分別用供試氮源替換基礎培養基中的Na NO3,對照為不加氮源的培養基。取8 mm菌餅倒置在上述不同氮源培養基中,重復3次。在28℃恒溫培養箱中培養。采用十字交叉法定時測量菌落直徑,其他同1.2.1。

1.2.4 不同微量元素條件下病原菌的生長

以Czapek為基礎培養基,供試微量元素硫酸鋅、硫酸亞鐵、四硼酸鈉、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸銅和檸檬酸鐵7種,在1 000 m L培養基中,分別加入15μg上述微量元素[22],以基礎培養基為對照。取8 mm菌餅倒置于上述不同微量元素培養基中,重復3次。在28℃恒溫培養箱中培養。采用十字交叉法定時測量菌落直徑,其他同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 分離自不同發病部位的病原菌的致病性比較

無論是初期產生病斑,還是后期產生菌核的癥狀,其基本癥狀特征與田間自然發病的相似。其最初發病部位,都是在水稻植株莖基部,接近水面處。病斑初期褐色,后期黑色,接近長方形,大小約(1～2)cm×(0.3～0.5)cm(圖1a～c)。隨著病情發展,病斑擴大,多個病斑聯合,呈現腐爛狀。發病約2個月后,在水稻結實到籽粒成熟期,接種發病的與田間自然發病的情況一樣,莖稈的中下部腐爛,葉鞘內部和莖稈里面都布滿白色菌絲,病情繼續發展,菌絲形成大量的黑色、圓球狀的菌核(圖1d～f)。

圖1 水稻稈腐菌核病在水稻品種‘長白9’上的癥狀Fig.1 Symptoms of sclerotiniose blight of rice stem rot on cultivar‘Changbai 9’

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的形態學鑒定

利用超景深顯微鏡,觀察結果顯示在水稻品種‘長白9’上自然發病產生的菌核,表面不平滑,呈現凸凹狀(圖2a),測量結果為菌核直徑范圍在164～309μm,平均直徑244μm。菌核分離菌株CHB9在PDA培養基上培養4～5 d后,菌絲長滿培養皿,10～12 d后形成黑色菌核(圖2b)。通過超景深顯微鏡觀察,結果顯示其外部形態特征與自然發病的情況基本一致,自然發病的與培養基上培養的菌核內部結構一致,均為擬薄壁組織,其切面中間大部分組織顏色較淺,呈淡褐色;切面周圍的2～3層顏色較深,呈黑褐色(圖2c～d)。

水瓊脂培養菌株CHB9菌核,第2天開始萌發菌絲,第5天開始產生分生孢子。菌核上可直接產生分生孢子梗,也可以是菌核萌發的菌絲上產生分生孢子梗,分生孢子梗再產生分生孢子(圖3a)。分生孢子初期呈水滴狀或彎月狀,有一隔膜或無隔膜,成熟后的分生孢子梭形或彎月形,有1～3個隔膜(圖3b～d)。分生孢子淡褐色。分生孢子梗少分支或不分支。分生孢子從產生到后期可以有1～39個。分生孢子大小為(32～76)μm×(5～22)μm。分生孢子梗長達290μm,梗直徑為2～17μm。吳海燕等人研究了來自寒冷地區黑龍江省佳木斯的水稻小球菌核病原形態,發現分生孢子有3個分隔[6],這與本研究明確的分生孢子存在1～3個隔膜的結果有差異。綜合上述菌核和分生孢子的形態學特征,確定菌株CHB9的無性世代為N.sigmoidea。

圖2 超景深顯微鏡下菌株CHB9的菌核形態Fig.2 Morphology of the pathogen from strain CHB9 under digital microscope

圖3 超景深顯微鏡下菌株CHB9的孢子及孢子梗形態Fig.3 Conidia and conidiophores of the pathogen from strain CHB9 under digital microscope

2.2.2 病原菌分子生物學鑒定

菌株CHB9的ITS區域PCR擴增產物電泳,檢測結果顯示位于Marker DL2000的500 bp條帶附近有一明顯的特異條帶(圖4)。測序結果所得ITS-rDNA序列為512 bp。分析結果顯示,CHB9的ITS-rDNA序列與Magnaporthe salvinii strain M71 (JX134673)、M.salvinii strain M69(JX134672)、M. salvinii isolate M21(JF414838)、M.salvinii strain ATCC 44754(DQ528792)和M.salvinii strain ATCC 32149(FJ746639)的一致性都達到95%以上,與前4個序列在系統發育樹中處于同一個分支(圖5),即與數據庫中所有5個M.salvinii中的4個親緣關系最近,結合形態學特征,進一步鑒定菌株CHB9的有性世代為M.salvinii。

2.3 病原菌的生物學特性

2.3.1 溫度對病原菌的影響

菌株CHB9、YJ4227和LJ25在PDA培養基上培養4 d。測定結果顯示,在25℃和30℃時,這3個菌株的生長速度快,菌落直徑與其他溫度處理差異顯著(P＜0.05;P＜0.01)(表1,圖6)。但是,在 15℃和20℃時,菌株CHB9的生長,比其他兩個菌株要好一些,說明菌株CHB9在溫度條件方面,可能有更寬泛的適應性。LJ25菌株來自黑龍江省綏化地區,YJ4227來自江蘇省揚州地區,這兩個地區南北差異較大。本研究結果顯示,來自這兩個地區的菌株對溫度的適應性也存在差異(表1,圖6)。

圖4 CHB9菌株ITS-r DNA擴增序列電泳結果Fig.4 PCR product of strain CHB9 ITS-r DNA

圖5 CHB9菌株ITS-rDNA的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of CHB9 strain based on the sequences of ITS-rDNA

表1 不同溫度下菌絲的生長量1)Table 1 Effects of temperature on mycelial growth of Nakataea sigmoidea

2.3.2 病原菌對碳源的利用

在病原菌對碳源利用的試驗中,菌株CHB9、LJ25和YJ4227培養4 d的測定結果顯示,菌株CHB9利用碳源的能力依次為鼠李糖＞蔗糖＞葡萄糖＞果糖＞海藻糖＞甘露醇＞蔗糖+鼠李糖＞葡萄糖+鼠李糖＞乳糖＞半乳糖;而菌株LJ25利用甘露醇的能力最強,其次是葡萄糖+鼠李糖;YJ4227利用鼠李糖最強,其次是果糖(圖7)。3個菌株對同一碳源的利用存在差異,除了甘露醇、葡萄糖+鼠李糖和半乳糖外,菌株CHB9對碳源的利用均比菌株LJ25和YJ4227的利用效果好,說明菌株CHB9對碳源的利用范圍更廣。

圖6 不同溫度下菌絲的生長量Fig.6 Effects of temperature on mycelial growth of Nakataea sigmoidea

圖7 不同碳源下菌絲的生長Fig.7 Effects of different carbon sources on mycelial growth of Nakataea sigmoidea

2.3.3 病原菌對氮源的利用

菌株CHB9、LJ25和YJ4227培養5 d的測定結果顯示,在供試的10種氮源中,菌株CHB9利用氮源的能力依次為硝酸鈣＞硝酸鉀＞硝酸銨＞硝酸鈉＞硫酸銨＞天冬酰胺＞草酸銨＞氯化銨＞尿素＞碳酸銨;菌株LJ25和YJ4227都是利用硝酸鉀的能力最強(圖8)。菌株CHB9可以利用除碳酸銨以外的所有氮源,而菌株LJ25只能利用硝酸鉀、其余氮源均不利于其生長,菌株YJ4227也只能利用硝酸鉀和硝酸鈉,說明菌株CHB9對氮源利用能力明顯強于菌株LJ25和YJ4227。

圖8 不同氮源條件下菌絲的生長Fig.8 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth of Nakataea sigmoidea

2.3.4 病原菌對微量元素的利用

菌株CHB9、YJ4227和LJ25培養5 d的測定結果顯示,在供試的7種微量元素中,菌株CHB9利用能力依次為硫酸鋅＞鉬酸鈉＞硫酸錳＞硫酸亞鐵＞檸檬酸鐵＞四硼酸鈉＞硫酸銅;LJ25菌株和YJ4227利用能力最強的分別是鉬酸鈉和檸檬酸鐵(圖9)。與對照比較,菌株CHB9可以利用除四硼酸鈉和硫酸銅以外的其他微量元素,菌株LJ25只能利用硫酸鋅和鉬酸鈉,菌株YJ4227對除硫酸銅以外其他微量元素利用能力均很強,說明在微量元素利用上,菌株CHB9與菌株LJ25和YJ4227均存在差異。

圖9 不同微量元素情況下菌絲的生長Fig.9 Effects of microelements on mycelial growth of Nakataea sigmoidea

3 討論

為了比較全面地鑒定蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病的病原,我們在水稻品種‘長白9’的同一發病植株上分離了2個菌株,即病斑分離物CHB8945和菌核分離物CHB9,確定了它們的致病性。在形態學方面,進一步明確了蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病病原突出的特征,即菌核表面呈現規則的凸凹形態、內部結構褐色擬薄壁組織,以及分生孢子1～3個隔膜。在研究過程中,我們在吉林省大安地區的12個水稻品種上,采集了12個菌株。它們的菌核表面和剖面,以及分生孢子等特征,均與文中研究菌株CHB9類似。在研究病原菌核和分生孢子的形態學特征,以及分子生物學鑒定過程中,選用了菌核分離物CHB9。對于非鹽堿地菌核和分生孢子特征,劉志恒等描述菌核表面粗糙,菌核剖面外層色黑,內層色淡褐[9];吳海燕等描述菌核表面光滑,菌核剖面外層黑褐色,內層淡褐色[12],分生孢子具有3個隔膜[6]。由此表明,本研究的蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病病原菌核和分生孢子特征與非鹽堿地的存在明顯差異。如果按照相關學者提出的病原菌核形態學標準[12],可以將蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病確定為小球菌核病。在進行生物學特性研究時,我們選用了來自寒冷地和弱酸性土壤水稻稈腐菌核病菌株LJ25和YJ4227為對照,與菌株CHB9一起進行試驗。研究結果顯示,蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病原在利用各種碳氮源,以及微量元素等方面都存在特殊性。

確定了病斑及菌核兩個分離物的致病性之后,我們進一步進行了反復的田間調查,發現此病害明顯地呈現病斑發生和菌核發生兩個階段。在此之前的有關水稻稈腐菌核病研究中沒有劃分這兩個階段[23-25],本研究明確強調此特征的意義在于指導病害早期診斷和防治。此外,在吉林省中部及東部的非蘇打鹽堿地稻區,我們也發現,雖然稈腐菌核病發生比較普遍,但基本上都是停留在病斑發生階段,沒有繼續發展到菌核發生階段,也沒有造成危害。綜合本研究結果,我們推測蘇打鹽堿地水稻稈腐菌核病發生發展規律,很可能與非蘇打鹽堿地存在不同。探明這一規律,應該是下一步工作的重點。

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(責任編輯：田 喆)

Pathogen identification and pathogenic biology of sclerotiniose blight of rice stem rot in sodium bicarbonate soils

Zhang Jiahuan1, Liu Wei1, Pan Jiao1, Shao Xiwen2, Wang Zhichun3, Ao Zhenchao1, Liu Jian1, Liu Chang1, Ma Zhoujie1

(1.College of Agronomy,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.Institute of Biotechnological Prevention and Control,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;3.Northeast Institute of Geography and Agricultural Ecology,Chinese Academy of Sciences,Changchun 130012,China)

The biological characteristics of the pathogen causing sclerotiniose blight of rice stem rot was isolated,identified,and studied.The results showed that the pathogenic fungus sclerotia was black,knaggy,globular outside,164-309μm in diameter,and brown inside,and the pathogenic conidia were light brown,1-3 septates, and(32-76)μm×(5-22)μm in size.The pathogenic asexual generation was Nakataea sigmoidea,and the sexual generation was Magnaporthe salvinii.The optimum temperature was from 25℃to 30℃for growth of the pathogen.Rhamnose(P＜0.05),calcium nitrate(P＜0.05),and zinc sulfate(P＜0.01)had significant promoting effect on the growth of the mycelia.The pathogen showed difference in the utilization of carbon source,nitrogen source,and microelements from the pathogens from non-sodium bicarbonate soils.

sodium bicarbonate soil; sclerotiniose blight of rice stem rot; pathogen; sclerotia; characteristics

S 435.111

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.012

2014-11-11

2015-04-07

“十一五”國家科技支撐計劃重點項目(2009BADB3B03);吉林省重大科技攻關專項(20130204036NY)

致 謝： 在本研究的病害標樣采集和病原分離過程中,得到揚州大學紀兆林博士和吉林農業大學陳長卿博士的熱情幫助,在此深表謝意。

*通信作者 E-mail：zhjh63@126.com