楊樹爛皮病內生拮抗菌的篩選及鑒定

陳越渠, 李立梅, 毛 赫, 張立民, 王牧原, 李殿鋒, 張曉軍*

(1.吉林省林業科學研究院,長春 130033;2.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所,北京 100091; 3.吉林省林業調查規劃院,長春 130022;4.吉林省雙遼市林業局森防站,吉林 136400)

楊樹爛皮病內生拮抗菌的篩選及鑒定

陳越渠1,2, 李立梅1, 毛 赫1, 張立民1, 王牧原3, 李殿鋒4, 張曉軍1*

(1.吉林省林業科學研究院,長春 130033;2.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所,北京 100091; 3.吉林省林業調查規劃院,長春 130022;4.吉林省雙遼市林業局森防站,吉林 136400)

從健康楊樹枝條上分離到1株能有效抑制楊樹爛皮病菌的內生細菌,編號為NS3。該菌株對供試的13種植物病原菌均有抑制作用,抑菌譜廣,其中對楊樹爛皮病和楊樹潰瘍病病原菌抑制作用最強,其活菌的平均抑菌帶寬度達到25.6 mm以上,發酵液的抑菌圈直徑達到48.6 mm以上;人工接種防治試驗結果表明：發酵液的無菌濾液對楊樹爛皮病具有良好的生防作用,保護作用和治療作用分別達85.4%和69.6%,與生產上用于防治該病的常用藥劑防治效果差異不顯著;根據其菌株形態、生理生化特征和16S rDNA序列比對,最終將該菌株鑒定為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。

枯草芽胞桿菌; 分類鑒定; 生防作用

植物內生菌(endophyte)是指其生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官的細胞間隙或細胞內,并且對植株不(或暫時不)造成可見危害的細菌[1]。植物內生細菌分布于植物的不同組織中,依靠植物提供充足的營養物質,同時因受到植物組織的保護,不受外部惡劣環境的影響,具有穩定的生態環境。因此,內生細菌相對于附生細菌更易于發揮生防作用,其防病機理主要表現在通過產生抗生素類、水解酶類、植物生長調節劑和生物堿類物質,或與病原菌競爭營養物質或空間,增強宿主植物的抵抗力以及誘導植物產生系統抗性等途徑抑制病原菌生長[2]。植物內生細菌是植物病害防治的潛在資源菌,國內外已有很多報道[3-12]。關于從楊樹枝條中篩選楊樹爛皮病菌土著拮抗細菌的研究,國內僅見任嘉紅等的報道[12]。本研究從45株楊樹內生細菌中,篩選獲得了1株能夠有效防治楊樹爛皮病的拮抗菌株,編號為NS3。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 楊樹樣品

從吉林省雙遼地區采集楊樹枝條若干份進行內生細菌的分離。

1.1.2 供試植物病原菌

楊樹爛皮病菌(Vasal sordida)和楊樹潰瘍病菌(Botryosphaeria dothidea)由本研究室分離保存。蘋果斑點落葉病菌(Alternaria alternata f.sp.mali)、甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. melonis)、水稻惡苗病菌(Fusarium moniliforme)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、大豆炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、煙草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)由沈陽農業大學植物病毒研究室饋贈。

1.1.3 供試培養基

細菌分離純化采用營養瓊脂(NA)培養基,菌株篩選及抑菌譜測定選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基。

菌種發酵用液體培養基：牛肉膏3.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母膏1.0 g,葡萄糖10.0 g,蒸餾水1 000 mL, p H 7.0～7.2。

1.1.4 16S r DNA序列分析試劑

樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒購自賽百盛; 16S r DNA forward primer/reverse primer 2、16S r DNA Bacterial Identification PCR Kit和Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0購自TaKaRa。陽性對照為已測定菌株的16S r DNA PCR產物。

1.2 方法

1.2.1 楊樹內生菌的分離

分離方法參照《植物研究方法》[13],采用逐級平板稀釋涂布分離,每天觀察并挑選菌落形態不同的菌株轉接到NA斜面上培養,并編號保存。采用組織印跡法檢驗楊樹組織表面消毒的效果：取最后1次無菌水沖洗液100μL涂于NA培養基上,3次重復,培養3 d后,若培養皿中無菌落生長,則表示材料表面消毒徹底,否則,該分離結果不能使用。

1.2.2 楊樹內生菌室內抑菌活性測定

以楊樹爛皮病菌為靶標菌,通過對峙培養,測定1.2.1分離得到的內生菌的抑菌活性。將楊樹爛皮病菌制成直徑7 mm的菌餅,放置在培養皿中央,用接種環挑取培養72 h的內生菌,在距離菌餅上下2.5 cm處平行畫線,28℃恒溫培養72 h后測量內生細菌與病原真菌之間抑菌帶寬度。選擇拮抗活性強的菌株發酵,進行抑菌譜的測定。

1.2.3 菌株發酵液制備

在裝樣量為500 m L的三角瓶內裝發酵培養液200 m L,根據1.2.2的結果,選擇抑菌活性強的菌株NS3轉接至發酵培養液中,28℃,150 r/min恒溫振蕩培養4 d,得到的發酵液經8 000 r/min離心15 min,取上清液用細菌過濾器去除菌體,備用。

1.2.4 發酵液抑菌譜測定

采用杯碟法,將活化的各病原菌制成孢子懸浮液(10×15倍下,30～40個/視野),吸取300μL加入70 m L融熔態PDA培養基中,制成混菌平板,培養皿中央放置牛津杯,加入菌株發酵液100μL, 28℃恒溫培養72 h后十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5 菌株發酵液對楊樹爛皮病的防治效果

1.2.5.1 楊樹爛皮病菌的接種

選擇1年生楊樹扦插苗用于接種。將楊樹爛皮病菌接種于PDA培養基,26℃恒溫培養5～7 d,用d=7 mm打孔器打成菌餅備用。用刀片將楊樹干部劃傷,將楊樹爛皮病菌菌餅貼在傷口處,用脫脂棉蘸楊樹葉片汁液保濕,每處理15株,3次重復,保濕7 d后去除菌餅。

1.2.5.2 菌株發酵液對楊樹爛皮病的保護和治療作用

分別于接種前5、10、15 d和去掉菌餅后5、10、15 d,將NS3發酵上清液5倍稀釋液、50%退菌特(25%福美雙、12.5%福美鋅、12.5%福美甲胂)可濕性粉劑、40%福美胂可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(3種農藥均為河北冠龍農化有限公司生產)及清水對照均勻涂抹于楊樹干部,于最后一次施藥后7 d觀察苗木發病情況,計算防治效果。

病情指數分級標準,參考吉林省地方標準[14]：

Ⅰ級(代表值0)—無病;

Ⅱ級(代表值1)—病斑橫向長度占樹干周長的1/4以下;

Ⅲ級(代表值2)—病斑橫向長度占樹干周長的1/4～2/4以下;

Ⅳ級(代表值3)—病斑橫向長度占樹干周長的2/4～3/4以下;

V級(代表值4)—病斑橫向長度占樹干周長的3/4及以上～樹木瀕死或者死亡。

1.2.6 菌株鑒定

1.2.6.1 菌株形態觀察

菌株形態特征、培養性狀、生理生化指標根據《伯杰細菌鑒定手冊》[15]。利用掃描電鏡觀察楊樹內生細菌的形態,處理方法參考楊瑞等的方法[16]。

1.2.6.2 菌株總DNA提取

將純化的NS3菌株保存在試管斜面中,培養24 h后,挑取菌株,利用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒提取菌株總DNA。

1.2.6.3 16S r DNA序列分析

PCR反應條件：94℃變性5 min;94℃變性1 min,53℃復性1 min,72℃延伸2 min,35次循環; 72℃延伸5 min,4℃保存,其他按照各試劑盒的操作流程操作,將回收產物送至大連寶生物公司測序。

2 結果與分析

2.1 菌株初篩

經過2次平板稀釋純化后,挑取單菌落,獲得了形態、大小、顏色一致的純化菌株45株,將這些菌株在NA斜面上培養,4℃保存,作為原始菌株備用。

所得的45株菌株中有6株對楊樹爛皮病病菌的抑制效果較好,其抑菌帶寬度大于15 mm(表1),其中,菌株NS3抑菌效果最好,抑菌帶寬度達28.3 mm,因此選定NS3為下一步試驗的菌株,進行深入研究。

表1 內生菌活體對楊樹爛皮病菌的抑菌活性1)Table 1 Inhibition activity of antagonistic bacteria to Vasal sordida

2.2 內生菌NS3及其發酵液的抑菌譜

平板對峙試驗結果顯示：內生菌NS3對所有供試菌株均有一定的抑制作用(表2)。其中對楊樹爛皮病菌、楊樹潰瘍病菌和水稻惡苗病菌的抑制作用最強,可見清晰的抑菌帶,抑菌帶平均寬度達到25 mm以上,對大豆炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、煙草靶斑病菌和水稻紋枯病菌具有較強的抑制作用,抑菌帶寬均在20 mm左右,而對其他6種供試病原菌,抑菌帶寬亦達10 mm以上。

表2 內生菌NS3活體和發酵液的抑菌譜Table 2 Antimicrobial spectrum of antagonistic microorganism and fermented broth of NS3

發酵液抑菌活性測定結果表明：菌株NS3的發酵液對楊樹潰瘍病菌和楊樹爛皮病菌有明顯的抑制作用,尤其是對楊樹爛皮病菌,抑菌圈直徑達50.5 mm,對楊樹潰瘍病菌的抑菌圈直徑亦達到48.6 mm(表2),與其他供試病原菌差異顯著,且其發酵液仍保持了較廣的抑菌譜,即內生菌NS3無論活體菌還是發酵液,其抑菌譜均較廣,有進一步研究的價值。

2.3 NS3發酵液對楊樹爛皮病的防治效果

不同方式處理的苗木發病率和病情指數見表3,對照苗木發病率和病情指數分別為82.2%和49.4;接種前采用NS3處理的苗木發病率為20%,病情指數為7.23,接種后涂藥處理的發病率和病情指數分別為42.2%和15,保護作用和治療作用分別為85.4%和69.6%;40%福美胂可濕性粉劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑處理的保護作用均為89.8%,治療作用分別為74.4%和79.3%。隨著調查時間的延長,發現清水對照處理的苗木在之后的幾周內病斑逐漸擴大,在病斑處可見明顯的分生孢子器,個別出現分生孢子角;各處理感病的植株病斑幾乎沒有繼續擴大,病斑處未見分生孢子器。上述結果表明,NS3發酵液對楊樹爛皮病菌有顯著的抑制作用,即使楊樹已感染楊樹爛皮病菌,也有較好的治療效果。保護作用和治療作用均略低于所供試的3種藥劑,但均差異不顯著。

表3 NS3發酵液對楊樹爛皮病的防治效果Table 3 Control effects of fermented broth against Vasal sordida

圖1 菌株NS3芽胞形態Fig.1 The spores of strain NS3

2.4 菌株NS3的分類地位

2.4.1 菌株NS3的形態特征

菌株NS3經革蘭氏染色確定為革蘭氏陽性菌。在NA培養基上生長良好,培養24 h后菌落為圓形或近圓形,乳白色,不透明,表面不光滑,不產色素,隨著培養時間延長,菌落變干,邊緣突起,菌落上有褶皺及突起,亞甲基蘭染色后光學顯微鏡下可見菌體呈桿狀,電鏡下觀察,芽胞橢圓形至柱狀(0.6～0.9)μm×(1.0～1.5)μm(圖1)。

2.4.2 菌株NS3的生理生化特性

對菌株NS3各種生理生化反應進行測定,部分結果見表4。碳源利用測定表明,該菌株可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、果糖,不能利用木糖;耐鹽性測定表明,該菌株在7%NaCl培養基中,仍然可以生長,根據《伯杰細菌鑒定手冊》,初步判定菌株NS3為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。

2.4.3 菌株NS3的16S rDNA鑒定

取DNA 1μL,進行3%瓊脂糖凝膠電泳,結果(圖2a)表明,所提的DNA完整性很好,無污染,可用于下一步試驗。菌株NS3的16S r DNA基因擴增產物如圖2b所示。結果表明,擴增產物的大小約為1.5 kb,擴增效果良好。與報道的枯草芽胞桿菌16S r DNA大小一致。用Agarose Gel DNA Purifi-cation Kit進行目的片段的切膠回收,回收片段的大小約為1.5 kb(圖2c),可以用于序列測定。菌株NS3的16S r DNA基因擴增片段全長為1 040 bp (圖2b)。與GenBank數據庫中相關細菌菌株的16S r DNA序列相比,菌株NS3與已知的細菌Bacillus subtilis strain H1(基因登錄號KM084864.1)的16S r DNA同源性最高,達到99%,選擇與菌株NS3同源性較高的序列,進行系統發育分析,結果表明菌株NS3與Bacillus subtilis strain H1(KM084864.1)和Bacillussubtilis subsp.subtilis CICC 10076(GQ375227.1)親緣關系最近,因此初步確定菌株NS3為枯草芽胞桿菌(基因登錄號KM667974)。

表4 菌株NS3的生理生化特征1)Table 4 Cultural characteristics of strain NS3

圖2 NS3基因組DNA,16S rDNA PCR產物和16S rDNA PCR回收產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis of the genomic DNA and 16S r DNA PCR products of strain NS3

圖3 菌株NS3及相關菌株的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus subtilis strain NS3

3 結論與討論

楊樹爛皮病是一種世界性的寄主主導型病害,嚴重影響楊樹產業的發展,目前對該病的防治尚無理想的方法。

本研究從楊樹枝條分離得到土著內生細菌,以楊樹爛皮病菌為靶標菌進行篩選,最終選定1株抑菌效果最強的菌株,編號為NS3。該菌株發酵液的無菌濾液,不僅在體外平皿試驗中表現出了對楊樹爛皮病菌強烈的抑制作用,同時,對人工接種楊樹爛皮病菌的楊樹苗也表現出了良好的防病效果,具有開發應用前景。

菌株NS3對供試植物病原真菌有較廣譜的抗性,對楊樹爛皮病、楊樹潰瘍病的抑制作用最強,活菌對峙培養對上述兩種病原菌的平均抑菌帶寬度達到25.6 mm以上,杯碟法測定發酵液對上述兩種病原菌的抑菌圈直徑達到48.6 mm以上,人工接種防治試驗表明,其發酵液中的生物活性物質對楊樹爛皮病具有顯著的防治效果,其保護作用和治療作用分別達85.4%和69.6%,與生產上用于防治該病的常用藥劑防治效果差異不顯著,且該發酵液與化學農藥相比,低毒、無殘留,與環境友好,更符合可持續控制理念。

本研究經生理生化特征、電鏡形態觀察及16S r DNA序列比對,最終確定NS3為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。這是國內首次以林業病害病原菌為靶標篩選內生拮抗細菌,并將其鑒定到種,對林業病害的生物防治具有重要意義。

如果能很好地利用拮抗菌作為楊樹爛皮病生物防治的手段,對恢復和建立生態平衡,以及楊樹爛皮病的綜合治理具有非常重要的意義。楊樹爛皮病的室內生物防治試驗及人工接種防治試驗的結果,可為今后生物藥劑的研制和生產提供理論依據。而該生防菌與其他細菌在楊樹體內的消長動態關系、發酵條件、生防劑型的研制等問題還有待今后進一步研究。

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(責任編輯：楊明麗)

Screening of antagonistic bacteria of Valsa sordida and identification of the strain NS3

Chen Yuequ1,2, Li Limei1, Mao He1, Zhang Limin1, Wang Muyuan3, Li Dianfeng4, Zhang Xiaojun1

(1.Jilin Academy of Forestry Sciences,Changchun 130033,China;2.Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China; 3.Jilin Forestry Survey and Planning Institute,Changchun 130022,China;4.Control and Quarantine Station of Forest Pest,Shuangliao Forestry Bureau,Jilin 136400,China)

An antagonistic bacterial strain NS3 against Vasal sordida was isolated from poplar branches.The NS3 strain displayed a broad-spectrum inhibition to all the 13 pathogenic fungi tested in this study.Of them,its inhibitive effect to Vasal sordida and Botryosphaeria dothidea was the strongest,with a width of inhibition zone of more than 25.6 mm and a diameter of 48.6 mm averagely for NS3 fermented broth.Meanwhile,the inoculation test suggested its great potential for biocontrol.The protection and curation of the fermented broth against V.sordida were raised to 85.4%and 69.6%,respectively.On the basis of the morphological and physiological-biochemical characteristics as well as 16S r DNA sequence analysis,the bacterium was identified as Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis; taxonomic identification; biocontrol effect

S 763.1,S 718.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.023

2015-03-23

2015-06-16

林業公益性行業科研專項(201204501);吉林省科技發展計劃青年基金(201201092);吉林省科技發展計劃重點項目(20110267)

*通信作者 E-mail：0431zxj@163.com