福州野生蕉FeSOD 家族基因的克隆及在低溫脅迫下的表達分析

馮 新，徐 蕾，賴恭梯，謝曉清，林玉玲，賴鐘雄

（福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州350002）

植物在生長發育過程中往往會受到各種生物和非生物脅迫的影響，從而誘發細胞內活性氧（ROS）的代謝失衡，產生氧化脅迫，引起細胞膜、蛋白、DNA 等氧化損傷進而導致細胞代謝紊亂，嚴重時細胞死亡。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是抗氧化酶系統的第一道防線，能快速地催化超氧陰離子自由基發生歧化反應生成分子氧和過氧化氫，過氧化氫再經過氧化氫酶或愈創木酚等過氧化物酶作用生成水，從而解除細胞內的氧化脅迫，保護植物免受氧化損傷［1］。根據酶活性中心金屬離子的不同，植物SOD 分為Cu／ZnSOD、MnSOD 和Fe－SOD。3種類型的SOD 具有不同的亞細胞定位，如Cu／ZnSOD 主要存在于細胞質、葉綠體和過氧化物酶體中，MnSOD 主要存在于線粒體中，而FeSOD主要存在于葉綠體和細胞質中［2］。由于超氧陰離子自由基不能透過磷脂膜，不同亞細胞定位的SOD 在各自的位置上行使相應的活性氧清除功能，以保證生物體各種代謝的正常進行。FeSOD 是唯一一種存在于厭氧古細菌中的SOD 同工酶，因而在進化上被認為是最古老的一類SOD，目前已在原核生物和植物中鑒定到FeSOD，但未在動物中發現［3］。FeSOD蛋白通常以同源二聚體或同源四聚體的形式存在，其酶活性僅受H2O2抑制。近年研究表明，FeSOD活性還受鐵伴侶蛋白CPN20的直接調控［3－4］。

植物FeSOD 家族基因一般有1～3個成員，目前已從擬南芥、油菜、小麥和楊樹等多種植物中克隆得到［5－9］。其基因組DNA 通常含有6～8 個內含子［9－10］。已有的研究表明FeSOD 家族基因參與植物的體胚發生過程，且不同成員表達模式存在差異［8，11］。單寧偉［12］研究發現，失水脅迫處理切花月季可誘導其花瓣產生3條新的FeSOD 酶條帶。轉錄水平研究表明FeSOD 基因的表達受光照、低溫、NaCl和百草枯等逆境脅迫的誘導［13－14］，此外，還受生長素、脫落酸、赤霉素和激動素等生長調節因子的調控［15］。在玉米中過表達擬南芥FeSOD 基因能有效提高玉米的耐寒和抗氧化能力，并使其生長速率加快［16］。因此，FeSOD 在植物的抗逆中也發揮重要作用。

中國作為香蕉的起源地之一，蘊藏著豐富的野生蕉資源，本實驗室經多年考察發現福建分布著大量的野生蕉資源，其中位于福州北峰海拔300～500 m 的二倍體野生香蕉（命名為福州野生蕉），在自然野生狀態下能耐受冬季－2 ℃以下低溫，是香蕉抗寒育種的重要種質資源［17］。而香蕉FeSOD 家族基因及其與抗寒性的關系至今未見報道。本研究以福州野生蕉為材料，克隆FeSOD 家族基因的不同成員，分析不同成員的基因結構、蛋白的結構域、基本理化性質、亞細胞定位等特征，并借助qRT－PCR 技術檢測不同成員在低溫脅迫過程中的表達情況，以期為探討香蕉的抗氧化能力與抗寒之間的關系奠定基礎，為香蕉的抗寒遺傳改良提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 植物材料與脅迫處理

本研究以福州野生蕉（Musaspp．）的組培苗為材料，選取植株大小和長勢一致的組培苗進行不同溫度（28 ℃、20 ℃、13 ℃、4 ℃和0 ℃）處 理，處 理 時間為36h，進行2次重復處理，處理結束后收集葉片于液氮中速凍，之后保存于－80 ℃超低溫冰箱用于后續研究。

1．2 核酸提取與cDNA 合成

分別采用Column Plant RNAOUT 2．0試劑盒（TIANDZ，China）和CTAB法［18］進行香蕉總RNA和DNA 的提取。選擇經紫外分光光度計檢測OD260／280在1．8～2．0之間，且凝膠電泳顯示其完整性良好的核酸備用。采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，EU）將總RNA 逆轉錄為帶AP（GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT）接頭的cDNA，作為ORF和3′－UTR 擴增的模板。采用SMARTTMRACE cDNA Amplification kit（Takara，Japan）進行cDNA 逆轉錄，用于5′－UTR 擴增。

表1 基因克隆及qRT－PCR引物序列信息Table 1 Primers used for gene cloning and qRT－PCR

1．3 引物設計及PCR擴增

根據GenBank上已知的植物FeSOD 基因序列和小果野生蕉（Musa acuminata var．DH－Pahang，AA group）基因組數據庫（http：／／banana－genome．cirad．fr／）中注釋為FeSOD 的序列信息，經序列多重比對分析，在FeSOD 各基因成員的保守區分別設計3′－RACE 和5′－RACE 引物，用于擴增3′末端和5′末端，經測序后，在DNAMAN 上進行序列拼接，根據拼接全長預測最大ORF 區，設計引物進行ORF驗證分析，本研究所用的引物信息見表1。以DNA 為 模 板，FSD1B－vF 和FSD1B－vR 為 引 物，擴增MuFSD1B 的gDNA 序列，用以分析可變剪接轉錄本的類型和基因結構。PCR 反應程序為：94℃預變性3min；94 ℃變性30s，Tm（根據引物具體溫度設定）退火30s，72 ℃延伸時間根據片段大小設定，共35個循環；72 ℃繼續延伸10min。PCR 擴增產物經1．0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收，連接到pMD 18－T（Takara，Japan）載體，并選取陽性克隆子送測。

1．4 基因序列分析

采用DNAMAN 6．0軟件進行核苷酸序列比對和拼接。使用在線軟件對福州野生蕉FeSOD 基因及其推導的氨基酸進行同源性（NCBI，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）、氨 基 酸 基 本 理 化 性 質（http：／／web．expasy．org／protparam／）、亞 細 胞 定 位（WoLF PSORT，http：／／wolfpsort．org／；Soft Berry，http：／／linux1．soft berry．com／；）、N 端目標序列（Predotar，https：／／urgi．versailles．inra．fr／predotar／predotar．html）、磷 酸 化 位 點（NetPhos 2．0，http：／／www．cbs．dtu．dk／services／NetPhos／）、功 能 位 點（Prosite，http：／／www．predict protein．org／）、保 守 結 構 域（SMART，http：／／smart．embl－heidelberg．de／）、二 級結構（Psired，http：／／bioinf．cs．ucl．ac．uk／）和三級結構（Swissmodel，http：／／swissmodel．expasy．org／）的預測與分析。采用Mega 5．02 軟件的鄰位相連法（Neighbor Joining）構建植物FeSOD 氨基酸的分子系統進化樹。采用ClustalX（1．83）軟件進行氨基酸序列的多重比對分析。

1．5 亞細胞定位分析

根據在線數據庫預測分析顯示福州野生蕉Fe－SOD 家族各基因成員均定位于葉綠體的可能性最大，因而本研究以MuFSD1A 為代表進行亞細胞定位驗證。根據MuFSD1A 基因ORF 序列設計帶酶切位點NcoⅠ的上游引物MuFSD1A－subF（CAT－下劃線標示酶切位點，粗體標示保護性堿基，下同），帶酶切位點SpeⅠ的下游引物MuFSD1A－subR擴增MuFSD1A 基因片段并連接到pMD18－T（Takara），經測序后，雙酶切，連接到pCAMBIA1302載體GFP的N 端，構建融合表達載體35S∷MuFSD1AGFP，采用凍融法導入農桿菌EHA105中，并用注射法侵染煙草葉片。同時用水和pCAMBIA1302 空載體注射的煙草葉片分別作為陰性和陽性對照，3d后于激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000）下觀察35S∷MuFSD1A－GFP的定位情況并拍照。

1．6 福州野生蕉FeSOD 各基因成員在不同溫度處理下的qRT－PCR分析

以Chen等［19］篩選的在非生物脅迫下表達較穩定的CAC（clathrin adaptor complexes medium）基因作為本研究定量分析的內參基因，引物序列為CAC－QF（AACTCCTATGTTGCTCGCTTATG）和CAC－QR（GGCTACTACTTCGGTTC TTTCAC），擴增片段148bp。以經不同溫度處理植株的cDNA為模板，在基因的特異位置設計定量引物（表1），分析福州野生蕉各FeSOD 基因在不同溫度處理下的表達情況。根據SYBR ExScript試劑盒（Takara，Japan）說明書配制熒光定量PCR 反應液，在Lihgt－Cycler480儀器上進行PCR 擴增，重復3 次。PCR反應條件為：95 ℃預 變 性30s；95 ℃變性10s，57℃退火30s，72 ℃延伸30s，共40個循環。首先，以不同處理的cDNA 模板混合樣的15倍稀釋液為模板，經qRT－PCR擴增后分析各基因的擴增曲線、融解曲線（60～95 ℃）和PCR 產物的凝膠電泳條帶，以確定引物的特異性。隨后，在樣品擴增的同時，對不同處理的cDNA 模板混合樣進行5倍梯度系列稀釋，分別對FeSOD 各基因成員和內參基因CAC進行擴增，獲得標準曲線和擴增效率。數據采用Excel和geNORM（version 3．5）［20］軟件進行分析。

2 結果與分析

2．1 福州野生蕉FeSOD 家族基因不同成員cDNA全長序列的克隆與分析

以福州野生蕉葉片總RNA 逆轉錄的cDNA 為模板，經RACE擴增得到2條大小分別為661bp和868bp的3′－末端（圖1，A、B），以及2條大小分別為690bp和439bp的5′－末端（圖1，C、D）。在DNAMAN 上對已獲得的3′－末端序列和5′－末端序列進行比對及拼接，發現可能存在2個基因成員，進一步設計ORF 驗證引物，經RT－PCR 擴增得到分別為903bp和1 211bp的2個片段（圖1，E、F），TA 克隆后送測。測序結果顯示，這2 條序列與DNAMAN 拼接結果一致。將這2條序列的核苷酸和推導的氨基酸序列分別在NCBI上進行Blast分析，結果顯示，與數據庫中已知的百脈根（Lotus japonicus）、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）、葡 萄（Vitis vinifera）、蓖麻（Ricinus communis）、水稻（Oryza sativa）和龍眼（Dimocarpus longan）等的FeSOD／FeSOD 的序列有較高的同源性，因此推斷已成功獲得福州野生蕉FeSOD 的2 個基因成員，分別命名為MuFSD1A（登錄號為JX844026）和MuFSD1B（登錄號為KJ786318）。

圖1 MuFSD1A 和MuFSD1B 的PCR 擴增M．D2000DNA ladder（Solarbio）；Mo．500bp DNA ladder marker（Takara）；A．MuFSD1A－3′－末端；B．MuFSD1B－3′－末端；C．MuFSD1A－5′－末端；D．MuFSD1B－5′－末端；E．MuFSD1A－ORF驗證；F．MuFSD1B－ORF驗證，1為正常轉錄本，2和3為可變剪接轉錄本；G．MuFSD1B－gDNA 擴增；箭頭所指為特異條帶Fig．1 PCR amplification of MuFSD1Aand MuFSD1B M．D2000DNA ladder（Solarbio）；Mo．500bp DNA ladder marker（Takara）；A．MuFSD1A－3′－end；B．MuFSD1B－3′－end；C．MuFSD1A－5′－end；D．MuFSD1B－5′－end；E．MuFSD1A－ORF verification；F．MuFSD1B－ORF verification，1is normal transcript，2and 3are variant transcripts；G．MuFSD1B－gDNA amplification；arrows show the specific bands

MuFSD1A 的cDNA 全長為1 277bp，開放閱讀框為903bp，編碼300 個氨基酸，5′－UTR 為114 bp，3′－UTR 為260bp；MuFSD1B 的cDNA 全長為1 378bp，開 放 閱 讀 框 為783bp，編 碼2 6 0個 氨 基酸，5′－UTR 為133bp，3′－UTR 為462bp。與小果野生蕉（Musa acuminata DH－Pahang，AA group）基因組中注釋為FeSOD 的序列進行比對發現，MuFSD1A 開放閱讀框的cDNA 序列與小果野生蕉基因組中編號為GSMUA＿Achr11P23560的FeSOD序列長度一致，且相似性達到97．79%。而MuFSD1B 的ORF 序列與基因組中注釋為FeSOD的另外4 條序列（編號分別為GSMUA＿Achr10P－27220、27190、27230 和27210）有較高的相似性（圖2），推測它們為同源基因。但本研究獲得的福州野生蕉MuFSD1B 的ORF 序列比小果野生蕉的長，編碼1個更長的蛋白。

2．2 福州野生蕉FeSOD 可變剪接轉錄本與基因結構分析

在驗證MuFSD1B 的ORF 時，獲得了2 個比MuFSD1B 的ORF 條帶略長的轉錄本（圖1，F）。經測序后，與MuFSD1B 的ORF 序列比對顯示，這2條轉錄本的3′端分別多出了1段（87bp）和2段（87bp和172bp）的序列。為了進一步分析這2條轉錄本的特征，以福州野生蕉DNA 為模板，MuFSD1B－vF 和MuFSD1B－vR 為 引 物，擴 增 得 到MuFSD1B 基因4 982bp的gDNA 片段（圖1，G），測序結果分析表明開放閱讀框的gDNA 序列為4 189bp。與gDNA序列比對結果表明，這2條轉錄本分別是由MuFSD1B 基因在轉錄過程中的第7個內含子和第7、8個內含子共同駐留產生的可變剪接轉錄本，因而將這2條轉錄本分別命名為MuFSD1Bvariant1（登錄號為KJ786319）和MuFSD1B－variant2（登錄號為KJ786320）。

圖2 福州野生蕉MuFSD1B 與小果野生蕉FeSOD 基因的序列比對GSMUA＿Achr10P27220、27190、27230和27210為小果野生蕉基因組中注釋為FeSOD 的序列。顏色由深到淺表示序列間一致性由高到低Fig．2 Sequence alignment of MuFSD1Band FeSODs from M．acuminata DH－Pahang GSMUA＿Achr10P27220，27190，27230and 27210are sequences from the genome database of M．acuminata DH－Pahang，which are annotated as FeSOD．Colors vary from dark to light means that the identities of sequences are from high to low

由于MuFSD1A 的ORF序列與小果野生蕉的GSMUA＿Achr11P23560 基因高度相似，因而采用GSMUA＿Achr11P23560的gDNA 序列（4 075bp）為參考序列分析MuFSD1A 的外顯子和內含子組成。如圖3顯示，MuFSD1A 基因由8個外顯子和7個內含子組成，最長和最短的外顯子分別為210 bp和24bp，而最長和最短的內含子分別為2 281 bp和72bp；MuFSD1B 基因由9個外顯子和8個內含子組成，最長和最短的外顯子分別為189bp和24bp，而最長和最短的內含子分別為1 804bp 和79bp。MuFSD1A 和MuFSD1B 的起始密碼子和終止密碼子均為ATG 和TGA，而可變剪接轉錄本MuFSD1B－variant1 和MuFSD1B－variant2 均 由于第7個內含子駐留導致終止密碼子提前，變為TAA，因而都具有7個外顯子和6個內含子。所有福州野生蕉FeSOD 基因成員的內含子剪切位點均符合真核生物內含子剪接規律，即“GT－AG”規則。

2．3 福州野生蕉FeSOD氨基酸序列比對與生物信息學分?析

雖然MuFSD1A 基因和MuFSD1B 基因推導的氨基酸序列的相似性比較低，僅有33．33%，但與來自擬南芥的3 個FeSOD（AtFSD1、AtFSD2 和AtFSD3）的多重序列比對結果顯示（圖4），MuFSD1A 和MuFSD1B 均具有植物FeSOD 保 守的金屬結合位點和區別于MnSOD 的特征氨基酸，且SMART 軟件分析顯示這2個成員均含有Sod＿Fe＿N 結構域和Sod＿Fe＿C 結構域。這些結果表明本研究所獲得的MuFSD1A 和MuFSD1B這2個成員均具有FeSOD 的基本功能和特性。

采用生物信息學方法進一步對所獲得的這2個FeSOD 成員進行理化性質和結構特征的分析，以了解其蛋白的生物學活性及潛在的功能。結果（表2）表明，MuFSD1A 和MuFSD1B 均為親水蛋白，但MuFSD1A 為酸性不穩定蛋白，而MuFSD1B 為堿性穩定蛋白。亞細胞定位結果均顯示MuFSD1A和MuFSD1B 定位于葉綠體的可能性最大。Predotar v1．03 分 析 結 果 亦 顯 示 MuFSD1A 和MuFSD1B均具有導向葉綠體的N 端目標序列，這也驗證了亞細胞預測結果的準確性，說明福州野生蕉的FeSOD 主要是參與葉綠體中超氧陰離子自由基的清除。NetPhos 2．0軟件預測顯示MuFSD1A具有16個磷酸化位點（絲氨酸位點10個，蘇氨酸位點3個，酪氨酸位點3個），而MuFSD1B具有14個磷酸化位點（絲氨酸位點7個，蘇氨酸位點2個，酪氨酸位點5個）。此外，MuFSD1A 具有6個蛋白激酶C磷酸化位點，6個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個N 端?；稽c，1個酰胺化位點和1個Mn／Fe－SOD 特 征 位 點；而MuFSD1B 具 有2 個cAMP 和CGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，4個蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，1個N 端?；稽c和1個Mn／Fe－SOD 特征位點。以上磷酸化位點分析結果表明，福州野生蕉FeSOD 中存在豐富的磷酸化位點，且不同成員間磷酸化位點及類型的差異可能與它們在香蕉不同的發育進程或逆境脅迫中受到不同因子的調控（磷酸化或去磷酸化）有關。二級結構分析顯示MuFSD1A 蛋白由42．67%α－螺旋，6．33%β－折疊和51．00%無規則卷曲 組 成，而MuFSD1B 蛋 白 由50．77% α－螺 旋，6．93%β－折疊和42．31%無規則卷曲組成。以PDB數據庫中相似性最高的FeSOD（編號為1unf．1）為模板構建福州野生蕉FeSOD 蛋白的三級結構模型亦顯示，MuFSD1A 和MuFSD1B 的三級結構存在明顯差異（圖5）。綜上，本研究獲得的福州野生蕉MuFSD1A 和MuFSD1B這2個成員在蛋白的理化性質，磷酸化位點及類型，二級和三級結構均存在明顯差異，暗示它們的具體功能可能存在差異。

圖3 福州野生蕉FeSOD 家族基因的基因結構Fig．3 Genomic structure of FeSODfamily genes from the wild banana in Fuzhou

2．4 福州野生蕉FeSOD的系統進化分析

圖4 福州野生蕉與擬南芥FeSOD 氨基酸序列的多重比對▼表示保守的金屬鍵結合位點氨基酸；＊表示FeSOD催化活性中心的氨基酸酪氨酸；◆表示FeSOD區別于MnSOD的特征氨基酸，而Sod＿Fe＿N 和Sod＿Fe＿C 結構域分別用單和雙直線表示。MuFSD1A 和MuFSD1B為福州野生蕉FeSOD；AtFSD1、AtFSD2和AtFSD3為擬南芥FeSODFig．4 Multiple sequence alignment of the FeSOD amino acids from the wild banana in Fuzhou and A．thaliana▼represents residues essential for conserved metal ligand binding sites；＊represents tyrosines essential for catalytic activity；◆represents residues important for distinguishing FeSOD from MnSOD；Sod＿Fe＿N and Sod＿Fe＿C domains are marked with single and double lines，respectively．MuFSD1Aand MuFSD1Bare FeSODs from the wild banana in Fuzhou；AtFSD1，AtFSD2and AtFSD3are FeSODs fromArabidopsis thaliana

表2 福州野生蕉FeSOD的基本理化性質Table 2 Basic parameters of FeSOD from the wild banana in Fuzhou

為了分析福州野生蕉中FeSOD 不同成員的進化關系，采用Mega 5．02對MuFSD1A、MuFSD1B和來自NCBI中已知的其他17種植物FeSOD 基因的氨基酸序列進行聚類分析（圖6），結果顯示植物FeSOD 基因的氨基酸序列可分為兩大分支（Ⅰ和Ⅱ），各分支的FeSOD 可能具有不同的基因起源。Ⅰ和Ⅱ大分支中均包含2個小分支，即雙子葉植物分支和單子葉植物分支。福州野生蕉MuFSD1A位于Ⅰ大分支的單子葉植物類中，與馬蹄蓮FeSOD的親緣關系最近；而MuFSD1B 聚到Ⅱ大分支的單子葉植物類中，與海棗FeSOD 的親緣關系最近，其次為手參、二穗短柄草、小麥、水稻和玉米的，與雙子葉植物的親緣關系較遠。香蕉2個成員聚類到不同的大分支中，這與它們氨基酸間的低一致性相符合（33．33%），暗示它們來自不同的基因祖先。

2．5 福州野生蕉FeSOD 基因的亞細胞定位

將水（陰性對照）、pCAMBIA1302（陽性對照）和35S∷MuFSD1A－GFP分別注射煙草葉片進行瞬時表達，25 ℃培養3d后于激光共聚焦顯微鏡下觀察福州野生蕉MuFSD1A 蛋白的亞細胞定位情況。結果（圖版Ⅰ）表明，陰性對照未見GFP綠色熒光信號（圖版Ⅰ，A），但保衛細胞中葉綠體的自發紅色熒光信號可以觀察到（圖版Ⅰ，B、D）；陽性對照可以觀察到在葉綠體、細胞質、細胞膜和細胞核上均有GFP綠色熒光信號（圖版Ⅰ，E、H），同時可觀察到葉綠體的自發紅色熒光信號（圖版Ⅰ，F），及其與綠色熒光信號疊加（圖版Ⅰ，H）；轉35S∷MuFSD1AGFP的煙草可在其保衛細胞的葉綠體上觀察到明顯的GFP綠色熒光信號和自發紅色熒光信號（圖版Ⅰ，I、J、L），此外還觀察到在其細胞質中也存在比較弱的GFP綠色熒光信號（圖版Ⅰ，I、L），說明福州野生蕉MuFSD1A的蛋白主要定位在葉綠體中，這與生物學信息學的預測結果一致。

圖5 福州野生蕉FeSOD 的三級結構Fig．5 Tertiary structure of FeSOD from the wild banana in Fuzhou

圖6 福州野生蕉與其他植物FeSOD 基因氨基酸序列的進化樹分析進化樹分支點的數字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節點可信度的百分比，各物種FeSOD的GenBank登錄號列在括號內。標尺表示進化距離Fig．6 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of FeSODfrom the wild banana and other plants Numbers at the nodes represent the reliability percent of Bootstrap values based on 1 000replications．The GenBank accession numbers of FeSOD from various plants are in brackets．The bar represents evolutionary distances

圖7 福州野生蕉FeSOD 在不同溫度處理下的定量表達Fig．7 qRT－PCR analyses of FeSODunder different temperature treatments

2．6 福州野生蕉FeSOD 家族基因在不同溫度條件下的表達分析

福州野生蕉具有較強的抗寒能力，而植物抗逆能力被認為與其抗氧化能力密切相關，分析福州野生蕉FeSOD 家族基因對低溫的應答模式有助于了解該類型基因在香蕉抗寒中的作用。由于MuFSD1B 可 變 剪 接 轉 錄 本MuFSD1B－variant1和MuFSD1B－variant2的特異序列（即所包含的駐留內含子序列）存在較多的同種或2種堿基連續結構，本研究分析MuFSD1B 基因所有轉錄本類型的總體表達模式。qRT－PCR 結果顯示（圖7），當處理溫度高于香蕉生長的限制溫度13 ℃時，MuFSD1A和MuFSD1B 基因相對表達量均變化不大，當溫度低于13℃時，MuFSD1A 基因表達量隨著溫度的下降持續上升，在4 ℃時的表達量是28 ℃時2倍，而溫度降到0 ℃時，其表達量是28 ℃時3 倍以上。MuFSD1B 基因表達量在4 ℃時下降到28 ℃時的0．5倍以下，之后保持基本不變。以上結果說明福州野生蕉FeSOD 家族基因參與低溫應答，且不同成員發揮不同的功能，其中MuFSD1A 基因受低溫誘導，且表達強烈，可能在香蕉抗寒中起主要作用。

3 討 論

3．1 福州野生蕉FeSOD 家族基因具有2個成員

植物FeSOD 家族基因在不同物種中的成員數量不同，如擬南芥中存在3 個FeSOD 基因（AtFSD1，AtFSD2，AtFSD3）［5］，楊樹中亦存在3個FeSOD 基因（PtFSD2．1，PtFSD2．2，PtFSD3）［9］，龍眼中存在2個FeSOD 基因（DlFSD1a，DlFSD1b）［8］，巴爾干苔苣中僅有1個（HrFSD1）［21］。小果野生蕉基因組中注釋為FeSOD 的基因序列共有5條［22］。其中GSMUA＿Achr11P23560基因與福州野生蕉MuFSD1A 的一致性高達97．79%，說明該基因成員在香蕉不同類群間極為保守。另外4條基因GSMUA＿Achr10P27190（678bp，complete）、27210（144bp，fragment）、27220（717bp，complete）和27230（198bp，fragment）均與福州野生蕉MuFSD1B 基因（ORF為783bp）同源。染色體定位表明小果野生蕉的GSMUA＿Achr1 0 P－27190、27210、27220和27230基因在10號染色體上成簇排列，且它們的cDNA 序列和gDNA序列間均具有高度的相似性，說明它們是由基因重復而來，不同長度的ORF可能是由各重復基因間的轉錄和翻譯起始位點不同導致。曾在這4條基因cDNA 的特異5′端設計引物嘗試擴增福州野生蕉中可能存在的不同翻譯起始位點的FeSOD 基因，但均未得到任何條帶，而在它們的保守區設計引物經RACE和RT－PCR驗證僅獲得1條序列（MuFSD1B），推測該基因成員的轉錄調控機制在香蕉不同類群中存在差異。同樣的，本研究克隆得到的MuFSD1B 的gDNA 序列與小果野生蕉的4條gDNA序列也高度相似，因而可以確定福建野生蕉中僅存在此1成員。綜上，福州野生蕉FeSOD 家族基因由MuFSD1A 和MuFSD1B2個成員組成。

3．2 低溫脅迫下MuFSD1A 和MuFSD1B 基因的功能差異

溫度低于13℃即可限制香蕉生長，而中國香蕉的主產區處于香蕉栽培的北緣區域，易受到冬季低溫的影響而造成減產或品質下降［23］。已有研究表明香蕉的抗寒能力與其SOD 等抗氧化酶的活性變化密切相關［24－25］。而葉綠體中的光合作用是受低溫影響最明顯的過程之一［26］。葉綠體型FeSOD 主要參與清除光合傳遞鏈上產生的過多ROS，保證光合作用的順利進行，進而提高植株的抗氧化能力［27］。福 州 野 生 蕉 的2 個FeSOD 成 員（MuFSD1A 和MuFSD1B）主要定位在葉綠體，但其氨基酸序列間的相似性低。系統進化分析表明MuFSD1A 和MuFSD1B 基因來自不同的基因祖先，可能存在功能分化。Kliebenstein 等［5］研究表明擬南芥中的AtFSD2和AtFSD3 基因對光脅迫、Ozone介導的氧化脅迫和UV－B脅迫表現出不同的應答模式，說明植物FeSOD 家族不同成員的具體功能存在差異。已有研究表明低溫等逆境條件能改變相關蛋白的磷酸化水平進而調控其活性或亞細胞定位進一步參 與 逆 境 應 答［28－29］。福 州 野 生 蕉MuFSD1A 和MuFSD1B蛋白的理化性質、磷酸化位點的數量和類型、二級結構及三級結構上均存在明顯差異，說明它們生物學活性存在一定差異，且可能通過不同的磷酸化或去磷酸化方式，改變酶活性和蛋白構像，參與由低溫引起的各種氧化脅迫應答過程。李林玲等［30］研究發現銀杏葉綠體型GbFeSOD 基因的表達受4 ℃低溫誘導。過表達分析表明轉擬南芥Fe－SOD 基因的玉米植株比非轉基因表現出更耐寒的能 力［16］。福 州 野 生 蕉MuFSD1A 和MuFSD1B 基因在溫度低于13℃時的轉錄表達變化明顯，說明它們 參與低 溫 應 答，這 與 李 琳 玲［30］和Tsang 等［13］的研究結果一致。但MuFSD1A 和MuFSD1B 基因的表達模式存在明顯差異，其中MuFSD1A 基因顯著被低溫誘導表達，且隨著脅迫溫度的降低表達量不斷增加，而MuFSD1B 基因的表達受到抑制，說明福州野生蕉FeSOD 不同成員在低溫脅迫下可能行使不同的功能，其中MuFSD1A 基因可能在香蕉抗寒中起主要作用，需進一步通過過表達或RNA干擾進行驗證。

3．3 內含子駐留可能是香蕉FeSOD 基因可變剪接的普遍方式

可變剪接是基因轉錄調控的一種重要機制，通過不同的剪接方式可從同一個mRNA 前體產生各種mRNA 轉錄本，進而翻譯出具有不同生物學功能的蛋白亞型，在生物體的發育、組織分化及應對環境變化等過程中發揮重要作用［31－32］。基因的可變剪接現象普遍存在于各種真核生物中，但其普遍性和特性在不同物種間存在明顯差異［33］。近年的研究表明，植物SOD 家族基因的部分成員也存在多種可變剪接現象［8］。其中FeSOD 基因的可變剪接轉錄本在 水 稻、龍 眼 和 荔 枝 中 均 有 報 道［8，34－35］。龍 眼 的DlFSD1b基因存在4個可變剪接轉錄本（DlFSD1bvariant1～4），分別由內含子駐留、外顯子被選擇性切除及前面這2個種剪接模式共同作用產生，而荔枝可變剪接轉錄本LcFe－SOD7b和水稻可變剪接轉錄本OsFe－SODb均是由內含子駐留產生。福州野生蕉的2 個 可 變 剪 接 轉 錄 本（MuFSD1B－variant1 和MuFSD1B－variant2）均是由內含子駐留產生，說明內含子駐留剪接模式是香蕉FeSOD 基因可變剪接轉錄本形成的普遍方式。

此外，Feng等［34］研究發現雖然水稻的可變剪接轉錄本OsFeSODb產生的是一個截短蛋白，但其氨基酸序列含有植物FeSOD 4個保守金屬結合位點中的3個和區別于MnSOD 的所有特征氨基酸，且原核表達結果表明該截短蛋白具有SOD活性，能行使SOD功能。MuFSD1B－variant1和MuFSD1B－variant2轉錄本翻譯的蛋白均由于內含子駐留而提前終止，產生一個228aa的截短蛋白，有意思的是，這2個轉錄本翻譯的蛋白序列完全相同，且與水稻的OsFeSODb類似，同樣擁有FeSOD 的3個保守金屬結合位點和所有的FeSOD 特征氨基酸，因而，推測在同為單子葉植物的香蕉中，這2個可變剪接轉錄本翻譯的蛋白很可能也具有SOD 活性，但需要進一步通過原核表達驗證。

［1］ KARUPPANAPANDIAN T，MOON J C，KIM C，et al．Reactive oxygen species in plants：their generation，signal transduction，and scavenging mechanisms［J］．Australian Journal of Crop Science，2011，5（6）：709－725．

［2］ PILON M，RAVET K，TAPKEN W．The biogenesis and physiological function of chloroplast superoxide dismutases［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2011，1 807（8）：989－998．

［3］ ALSCHER R G，ERTURK N，HEATH L S．Role of superoxide dismutases（SODs）in controlling oxidative stress in plants［J］．Journal of Experimental Botany，2002，53（372）：1 331－1 341．

［4］ KUO W Y，HUANG C H，LIU A C，et al．CHAPERONIN 20mediates iron superoxide dismutase（FeSOD）activity independent of its cochaperonin role in Arabidopsis chloroplasts［J］．New Phytologist，2013，197（1）：99－110．

［5］ KILEBENSTEIN D J，MONDE R A，LAST R L．Superoxide dismutase in Arabidopsis：an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization［J］．Plant Physiology，1998，118（2）：637－650．

［6］ YANG Y Y（楊鴦鴦），LI Y（李 云），DING Y（丁 勇），et al．Cloning of Cu／Zn－superoxide dismutase of Brassica napus and its induced expression by Sclerotinia sclerotiorum［J］．Acta Agronomica Sinica（作物學報），2009，35（1）：71－78（in Chinese）．

［7］ LI J（李 娟），YANG L X（楊立新），ZHENG W Y（鄭文寅），et al．Cloning and sequence analysis of stress tolerance relative gene FeSOD in wheat（Triticum aestivum）［J］．Journal of Nuclear Agricultural Sciences（核農學報），2013，27（8）：1 111－1 117（in Chinese）．

［8］ LIN Y L,LAI Z X．Superoxide dismutase multigene family in longan somatic embryosa comparison of CuZn－SODFe－SODand Mn－SOD gene structure，splicing，phylogeny，and expression［J］．Molecular Breeding，2013，32（3）：595－615．

［9］ MOLINA－RUEDA J J，TSAI C J，KIRBY E G．The populus superoxide dismutase gene family and its responses to drought stress in transgenic poplar overexpressing apine cytosolic glutamine synthetase（GS1a）［J］．PLOS One，2013，8（2）：E56421．doi：56410．51371／journal．pone．0056421．

［10］ KATYSHEV A I，ROGOZIN I B，KONSTANTINOV Y M．Identification of new superoxide dismutase transcripts in plants by EST analysis：Alternative polyadenylation and splicing events［C］／／Proceedings of the Fifth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure，2006：61－64．

［11］ BAGNOLI F，CAPUANA M，RACCHI M L．Developmental changes of catalase and superoxide dismutase isoenzymes in zygotic and somatic embryos of horse chestnut［J］．Australian Journal of Plant Physiology，1998，25（8）：909－913．

［12］ 單寧偉．超氧化物歧化酶（SODs）與切花月季‘Samantha’失水脅迫耐性間的關聯［D］．北京：中國農業大學，2004．

［13］ TSANG E W，BOWLER C，HEROUART D，et al．Differential regulation of superoxide dismutases in plants exposed to environmental stress［J］．The Plant Cell，1991，3（8）：783－792．

［14］ LIU Y L（劉亞麗），YANG G Y（楊桂燕），ZHANG K M（張凱敏）．The analysis of 2 Tamarix hispida FeSOD genes’clone and expression under salt stress［J］．Journal of West China Forestry Science（西部林業科學），2014，43（4）：31－36（in Chinese）．

［15］ KUREPA J，HEROUART D，VAN M M，et al．Differential expression of CuZn－and Fe－superoxide dismutase genes of tobacco during development，oxidative stress，and hormonal treatments［J］．Plant ＆Cell Physiology，1997，38（4）：463－470．

［16］ VAN B F，SLOOTEN L，STASSART J M，et al．Overproduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize［J］．Plant ＆Cell Physiology，1999，40（5）：515－523．

［17］ LAI ZH X（賴鐘雄），CHEN Y（陳 源），LIN Y L（林玉玲），et al．Discovery and taxonomy of wild banana（Musaspp．，‘AA’Group）in Fuzhou［J］．Subtropical Agriculture Research（亞熱帶農業研究），2007，3（1）：1－5（in Chinese）．

［18］ STEWART C N，VIA L E．A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications［J］．Bio．Techniques，1993，14（5）：748－750．

［19］ CHEN L，ZHONG H Y，KUANG J F，et al．Validation of reference genes for RT－qPCR studies of gene expression in banana fruit under different experimental conditions［J］．Planta，2011，234（2）：377－390．

［20］ VANDESOMPELE J，DE PRETER K，PATTYN F，et al．Accurate normalization of real－time quantitative RT－PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］．Genome Biology，2002，3（7）：research0034．0031－0034．0011．

［21］ APOSTOLOVA E，RASHKOVA M，ANACHKOV N，et al．Molecular cloning and characterization of cDNAs of the superoxide dismutase gene family in the resurrection plant Haberlea rhodopensis［J］．Plant Physiology and Biochemistry，2012，55：85－92．

［22］ D′HONT A，DENOEUD F，AURY J M，et al．The banana（Musa acuminata）genome and the evolution of monocotyledonous plants［J］．Nature，2012，488（7410）：doi：10．1038／nature11241．

［23］ LI N（李 娜），HUO ZH G（霍治國），HE N（賀 楠），et al．Climatic risk zoning for banana and litchi’s chilling injury in south China［J］．Chinese Journal of Applied Ecology（應用生態學報），2010，21（5）：1 244－1 251（in Chinese）．

［24］ ZHOU B Y（周碧燕），LIANG L F（梁立峰），HUANG H B（黃輝白），et al．Effect of low temperature and paclobutrazol on superoxide dismutase and abscisic acid of banana（Musaspp．）［J］．Acta Horticulturae Sinica（園藝學報），1995，22（4）：331－335（in Chinese）．

［25］ YANG Q S，WU J H，LI C Y，et al．Quantitative proteomic analysis reveals that antioxidation mechanisms contribute to cold tolerance in Plantain（Musa paradisiaca L．；ABB Group）seedlings［J］．Molecular ＆Cellular Proteomics，2012，11（12）：1 853－1 869．

［26］ HE J（何 潔），LIU H X（劉鴻先），WANG Y R（王以柔），et al．Low temperature and photosynthesis of plants［J］．Plant Physiology Communications（植物生理學通訊），1986，（2）：1－6（in Chinese）．

［27］ ARISI A C，CORNIC G，JOUANIN L，et al．Overexpression of iron superoxide dismutase in transformed poplar modifies the regulation of photosynthesis at low CO2partial pressures or following exposure to the prooxidant herbicide methyl viologen［J］．Plant Physiology，1998，117（2）：565－574．

［28］ GUO J W（郭軍偉），WEI H M（魏慧敏），WU SH F（吳守鋒），et al．Effects of low temperature on the distribution of excitation energy in photosystem and the phosphorylation of thylakoid membrane proteins in rice［J］．Acta Biophysica Sinica（生物物理學報），2006，22（3）：197－202（in Chinese）．

［29］ WANG W（王 尉），GUO N（郭 寧），XU M ZH（徐明照），et al．Expression in vitro of OsPIN1agene and analysis of phosphorylation sites［J］．Chinese Journal of Tropical Crops（熱帶作物學報），2014，35（8）：1 528－1 532（in Chinese）．

［30］ LI L L（李琳玲），CHENG H（程 華），XU F（許 峰），et al．Molecular cloning，characterization and expression of iron superoxide dis－mutase gene fromGinkgo bilobaJ．Journal of Fruit Science果樹學報2009266840－846in Chinese．

［31］ GUO X Q（郭小勤），LI D B（李德葆）．Pre－mRNA alternative splicing in plants［J］．Journal of Agricultural Biotechnology（農業生物技術學報），2006，14（5）：809－815（in Chinese）．

［32］ PAN J W（潘教文），LI D Q（李德全）．Cellular localization of components of mitogen－activated protein kinase（MAPK）cascades and alternative splicing［J］．Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology（中國生物化學與分子生物學報），2010，26（5）：393－400（in Chinese）．

［33］ KEREN H，LEV－MAOR G，AST G．Alternative splicing and evolution：diversification，exon definition and function［J］．Nature Reviews Genetics，2010，11（5）：345－355．

［34］ FENG W，HONGBIN W，BING L，et al．Cloning and characterization of a novel splicing isoform of the iron－superoxide dismutase gene in rice（Oryza sativa L．）［J］．Plant Cell Reports，2006，24（12）：734－742．

［35］ LIAN C L（練從龍），LAI ZH X（賴鐘雄），LU B G（盧秉國），et al．Cloning and bioinformatics analysis of Fe－SODgene from embryogenic callus of an ancient litchi tree［J］．Chinese Journal of Tropical Crops（熱帶作物學報），2014，35（1）：74－81（in Chinese）．

圖版Ⅰ 35S∷MuFSD1A－GFP蛋白在煙草中的亞細胞定位A、E和I為488nm 激發光下GFP蛋白的綠色熒光信號；B、F和J為561nm 激發光下葉綠體的自發紅色熒光信號；C、G 和K 為煙草細胞的明場圖；D、H 和L為疊加圖；A～D為用水處理的陰性對照；E～H 為用pCAMBIA1302處理的陽性對照；I～L 為35S∷MuFSD1A－GFP處理。箭頭1．葉綠體；箭頭2．細胞質；箭頭3．細胞膜；箭頭4．細胞核。PlateⅠ Subcellular localization of 35S∷MuFSD1A－GFP protein in tobacco cells Fig．A，E and I images present the green fluorescence of GFP under excitation wavelength of 488nm；Fig．B，F and J images present the auto－fluorescence of chloroplast under excitation wavelength of 561nm；Fig．C，G and K images present outlook of tobacco cells；Fig．D，H and L images are the merged images．Fig．A～D are negative controls treated with water；Fig．E～H are positive controls treated with pCAMBIA1302；Fig．I～L are treated with 35S∷MuFSD1A－GFP．Arrow 1is chloroplast；Arrow 2is cytoplasm；Arrow 3is cellular membrane；Arrow 4is nucleus．