過表達VHA－c1基因對擬南芥根長及ABA與糖響應的影響

蘇 杰，郭榮起，姜樹原，邸 娜，李國婧，王瑞剛＊

（1 內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古土右旗014109；2 內蒙古農業大學 生命科學學院，呼和浩特010018；3 內蒙古呼倫貝爾市農業科學研究所，內蒙古牙克石162650；4 包頭醫學院中心實驗室，內蒙古包頭014040；5 河套學院，內蒙古臨河015000）

液泡H＋－ATPase（V－ATPase），最早發現于液泡，存在于真核細胞各種分泌系統膜上［1］，是一種由13個亞基組成的寡聚酶，分V1和V02個結構域。V1域突出膜外，由A～H 共8個亞基構成。V0域鑲嵌于膜內，由a、c、c″、e和d共5個亞基組成［2］。

在對V－ATPase各亞基的研究中，c亞基倍受關注，它與酵母的Vma3p和F－ATPase的c亞基同源［1］。它的分子量約為16kD，是形成膜V0域的主要組件；同時，它是質子轉運的通道，與H＋轉運有關［3－4］。此 外，c亞 基 對V1－V0的 裝 配 也 是 必 不 可少的。缺少c亞基時，酵母突變體能夠合成V1域，但不能被組裝到膜上。此外，c亞基是細胞通訊中間隙聯結的部分，是神經遞質釋放介導體的組分，也是某種罕見的病毒癌基因產物的靶蛋白［3］。這些結果表明c亞基在細胞信號轉導過程中起重要作用。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）V－ATPase 的c亞基 屬 于 多 基 因 家 族（VHA－c），由VHA－c1（At4g34720）、VHA－c2 （At1g19910）、VHA－c3（At4g38920）、VHA－c4 （At1g75630）和VHA－c5（At2g16510）共5個同源基因編碼，它們編碼的脂質蛋白分子量約為16kD［2，4］。研究表明，光照、外源激素和營養等非生物脅迫與擬南芥V－ATPase c亞基基因表達調節有關。邸娜［5］證實VHA－c 基因對外源激素、高鹽、滲透脅迫及水分脅迫有響應。Padmanaban等［6］的研究表明，VHA－c 基因對細胞擴增起重要作用，尤其對根冠作用更加明顯。郭榮起［7］研究發現VHA－c1 沉默純合體的根和下胚軸長度短于對照。于秀敏等［8］的研究也揭示VHA－c2、VHA－c3和VHA－c5均可被4 ℃低溫和光照促進表達。這些結果都證明了擬南芥V－ATPase c亞基在植物響應非生物脅迫過程中可能具有重要作用。

為了更深入地了解擬南芥VHA－c 基因的功能，本實驗構建了VHA－c1基因的過表達載體轉化野生型擬南芥，并對VHA－c1基因的過表達純合體進行了暗培養、ABA 處理和糖處理，為進一步探明VHA－c 基因在植物非生物脅迫方面的抗性機制提供了初步的理論依據。

1 材料和方法

1．1 材 料

擬南芥野生型Columbia生態型（Col－0）由內蒙古農業大學植物分子生物學實驗室提供。培養條件：22 ℃，16h光照／8h黑暗，相對濕度約60%。

1．2 方 法

1．2．1 VHA－c1 基因過表達載體的構建及農桿菌轉化 采用CTAB 法［9］提取擬南芥基因組DNA。然后以擬南芥基因組DNA 為模板，擴增VHA－c1目的片段，PCR 引物的設計為。為了方便構建VHA－c1基因的表達載體，在2條引物的5′－端分別引入了KpnⅠ和SalⅠ的酶切位點。PCR 反應條件為：98 ℃預變性1 min；然后98 ℃變 性10s，58 ℃退 火30s，72 ℃延 伸2 min，共30個循環；最后72 ℃延伸6min。

將PCR 產物純化和凝膠回收，再連接到pGMT 載體（天根公司）進行測序。測序證明序列正確后，利用KpnⅠ和SalⅠ酶切pGM－T－c1載體獲得目的片段，與利用相同酶切的pCHF3 載體連接并轉化大腸桿菌DH5α，獲得目標過表達載體pCHF3－c1。將過表達質粒載體pCHF3－c1 用電擊法［10］轉化到農桿菌GV3101細胞中，取50μL 轉化產物涂于含25μg／mL Gent和100μg／mL Spect固體培養基上，28 ℃培養36～48h，篩選陽性克隆。

1．2．2 擬南芥的轉化及轉基因純合體的獲得 擬南芥的轉化采用浸花法［11］，轉化后將植株在正常條件下繼續培養3～4周，收取成熟種子。將種子播種于含30μg／mL Kan的1／2 MS選擇培養基中，22℃培養，10～12d后挑選陽性植株，待其成熟后分單株收取種子（T1代）；T1代種子按單株種于含30 μg／mL Kan的選擇培養基上，選擇有3∶1性狀分離的株系，將綠苗移至蛭石上培養，單株收取種子（T2代）；T2代種子按單株在含30μg／mL Kan的培養基上繼續篩選，不再分離的即為純合體株系，用于本次實驗的各項分析。

1．2．3 VHA－c1 轉基因植物半定量RT－PCR 鑒定 提取野生型和過表達轉基因純合體擬南芥的總RNA［12］，參照TakaRa公司反轉錄試劑盒說明書反轉錄得到cDNA。再以cDNA 為模板，對actin（At3g12110）和VHA－c1基因進行PCR 擴增，actin引物為actin－RT－F（5′－ATGGCAGATGGTGAAG－ACATTCAG－3′）和actin－RT－R（5′－GAAGCACTTCCTGTGGACTATTGA－3′），VHA－c1引物為c1－RT－F（5′－GATTTAAGATCTCAGATACAAAACTCCGAC－3′）和c1－RT－R（5′－TCCTACAATAAGCCCGTAAAGAGCAAGCGC－3′）。半定量RT－PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；然后，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，25個循環；最后72 ℃延伸5min［6］。將PCR 產物于1．5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析（Syngene公司凝膠成像儀）。

1．2．4 VHA－c1 轉基因純合體的暗培養 轉基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在1／2MS［13］培養基上，暗培養5d后，統計根的長度［6］。

1．2．5 不同濃度ABA 處理VHA－c1轉基因純合體（1）轉基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在1／2 MS培養基中，4℃春化3d，22℃、16h光照／8h黑暗條件下培養48h后，轉移至含有不同濃度ABA（0、4、8和12μmol／L）的1／8MS的方平板上，豎直放置，16h 光照／8h 黑暗培養4d，統計主根的長度。（2）轉基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在含有不同濃度ABA（0、0．5、1和2μmol／L）的1／2 MS培養基中，4 ℃春化3d，再于22 ℃、16h光照／8h黑暗條件下培養2d，統計萌發率［14］。

1．2．6 不同濃度糖處理VHA－c1轉基因純合體 轉基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在含有0、4%、5%和6%蔗糖或葡萄糖的1／2 MS 培養基中，4 ℃春化3d，再于22 ℃、16h光照／8h黑暗條件下培養3d，統計其萌發率［15－16］。

2 結果與分析

2．1 VHA－c1基因過表達載體構建和農桿菌轉化

以擬南芥基因組DNA 為模板，擴增VHA－c1基因的目的片段，擴增產物的片段為1 060bp（圖1），PCR 產物與pGM－T 載體連接后，命名重組質粒為pGM－T－c1，轉化大腸桿菌DH5α。挑取白色單菌落，進行PCR 擴增及酶切鑒定，送上海生工生物技術有限公司測序。驗證目的片段正確后，將陽性質粒pGM－T－c1和表達載體pCHF3用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切。連接酶切產物獲得重組質粒pCHF3－c1，轉化大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆的質粒，進行KpnⅠ和SalⅠ的雙酶切電泳。電泳結果與預期結果一致（圖2）。由此可見，過表達VHA－c1 基因的重組質粒pCHF3－c1構建成功。用電擊法將重組質粒pCHF3－c1轉化農桿菌GV3101，挑選培養在含Spect和Gent兩種抗生素的LB固體培養基上的單克隆，進行菌落PCR 檢測呈陽性，證明重組質粒pCHF3－c1已經轉入農桿菌GV3101中。

2．2 擬南芥VHA－c1轉基因植株的篩選

重組質粒pCHF3－c1經農桿菌介導轉入野生型擬南芥。經篩選獲得T1代轉基因株系22個，經進一步篩選，最終獲得7個T2代轉基因純系（過表達純合株系），這7個株系分別為c1－3－8、c1－9－1、c1－13－3、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13。

提取野生型（WT）擬南芥和VHA－c1過表達純合體總RNA，用半定量RT－PCR 進行檢測（圖3）。將WT 的VHA－c1轉錄水平定為100%，過表達純合 體 中c1－13－3 和c1－14－6 的mRNA 表 達 水 平 較強；c1－3－8、c1－9－1、c1－16－4、c1－26－13的mRNA 表達水平居中；c1－20－9 的mRNA 表達水平較弱。

圖1 VHA－c1目的片段的PCR 擴增M．DL2000；下同Fig．1 PCR amplification of VHA－c1gene M．DL2000；The same as below

圖2 重組質粒pCHF3－c1的酶切鑒定Fig．2 Identification of the recombinant pCHF3－c1 plasmid digested with KpnⅠand SalⅠ

圖3 VHA－c1轉基因純合體mRNA 表達水平WT．野生型（對照）；1～7分別是轉基因株系c1－3－8、c1－9－1、c1－13－3、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13Fig．3 The transcript level of VHA－c1gene in the overexpression transgenic plants WT．Wild type（control）；1－7．Transgenic plants c1－3－8，c1－9－1，c1－13－3，c1－14－6，c1－16－4，c1－20－9and c1－26－13，respectively

2．3 VHA－c1轉基因純合體的根變短

在 正 常 光 照 培 養 下（16h 光 照／8h 黑 暗），VHA－c1過表達純合體與野生型擬南芥未見明顯差異。根據Padmanaban 等［6］研 究 方 法，將VHA－c1過表達純合體和對照種子，暗培養5d后測量根長度（圖4）。結果（圖6）顯示，6個株系的平均根長比對照分別短12%、6%、12%、15%、3%和7%，且c1－14－6與對照之間根長的差異達到顯著水平，c1－16－4與對照之間根長的差異達到極顯著水平。這些結果表明，在黑暗條件下，VHA－c1基因過量表達抑制了根的生長。

2．4 ABA 處理下VHA－c1轉基因純合體主根伸長和種子萌發的變化

2．4．1 VHA－c1 轉基因純合體主根伸長和子葉的變化 不同濃度ABA 處理后，4個株系的VHA－c1轉基因純合體主根相對伸長量大于對照；隨著ABA濃度的增加，過表達純合體和對照植株主根生長被抑制的程度均增加，同時子葉的黃化程度增加，且VHA－c1轉基因株系子葉的展開程度要高于對照（圖5，以c1－3－8為例）。在4μmol／L ABA 濃度下，4個株系主根的相對伸長量平均比對照分別增加9%、13% 、13%和24%；在8μmol／L ABA 濃度下，分別增加17%、12% 、8%和6%；在12μmol／L ABA 濃度下，分別增加8%、6% 、4%和1%。部分ABA 濃度處理下主根的伸長量與對照之間的差異達顯著或極顯著水平（圖7）。

2．4．2 VHA－c1 轉基因純合體種子萌發率的變化不同濃度ABA 處理VHA－c1 轉基因純合體，結果顯示，當ABA 濃度大于2．0μmol／L 時，所有種子的萌發幾乎全部被抑制；當濃度介于0～2．0μmol／L時，所有VHA－c1過表達純合體和野生型種子的萌發都受到抑制，且隨著ABA 濃度的增大，種子萌發率 均 下 降。 在 不 同 ABA 濃 度 下，所 有VHA－c1轉基因株系的萌發率均大于野生型；0．5 μmol／L ABA時，7 個株系的萌發率比野生型增加30%、28%、32%、22%、30%、15% 和20%；1．0 μmol／L ABA，萌發率增加量分別為76%、79%、40%、43%、50%、69%和55%；在2．0μmol／L ABA濃度下，萌發率增加量分別為58%、12%、55%、48%、48%、24%和23%，大部分株系與WT 之間的差異達到顯著或極顯著水平（圖8）。以上結果表明，VHA－c1基因的過表達降低了根、子葉和種子對ABA 的敏感性。

圖4 在暗培養條件下2個VHA－c1轉基因純合體根的表型Fig．4 The root phenotype of two VHA－c1transgenic homozygous lines grown in dark

圖6 暗培養條件下VHA－c1不同轉基因純合體株系的根長比較c1的1～6分別為c1－3－8、c1－9－1、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13；＊和＊＊分別表示轉基因株系與野生型間在0．05和0．01水平存在顯著性差異；下同Fig．6 Comparison of the root length of different VHA－c1 transgenic homozygous lines grown in dark 1－6correspond to six transgenic homozygous lines c1－3－8，c1－9－1，c1－14－6，c1－16－4，c1－20－9and c1－26－13，respectively；＊and＊＊indicate significant difference between transgenic homozygous lines and wild types at 0．05and 0．01 level，respectively；The same as below

圖7 不同濃度ABA 處理后VHA－c1轉基因株系主根相對伸長量Fig．7 Relative taproot growth of VHA－c1 transgenic homozygotes with the treatment of different concentrations of ABA

圖8 不同濃度ABA 處理下VHA－c1純合體種子萌發率Fig．8 The germination rate of VHA－c1 transgenic homozygotes with the treatment of different concentrations of ABA

2．5 不同濃度糖處理下VHA－c1轉基因純合體種子萌發率的變化

許多研究發現，植物響應ABA 的生理過程與糖有關，于是我們接著對過表達純合體進行了糖處理。在濃度為4%、5%和6% Glc（葡萄糖）處理下，有5個株系的種子萌發率均高于WT（圖9，A），而在濃度為4%、5%和6%Suc（蔗糖）處理下，有4個株系的種子萌發率均高于WT（圖9，B）。

圖9 不同濃度葡萄糖（A）和蔗糖（B）處理下VHA－c1轉基因株系種子萌發率Fig．9 The germination rate of VHA－c1transgeneic homozygotes with the treatment of different concentrations of glucose（A）and sucrose（B）

3 討 論

3．1 VHA－c1在細胞擴展中的可能作用

V－ATPase某 些 亞 基（如A［17］、C［18－19］和E［20］）表達量的變化，影響了細胞擴展。其機理是V－ATPase利用液泡中ATP的γ－磷酸基團裂解時所釋放的能量，將質子泵到液泡腔中，產生H＋電化學梯度，使液泡酸化，為物質運輸提供能量，從而影響膨壓和細胞擴增［21］。

對于V－ATPase c亞基，Padmanaban等［6］已通過dsRNA 干擾發現擬南芥vha－c1突變株在暗培養下根和下胚軸長度都變短，揭示VHA－c1在細胞擴展中起重要作用。本實驗發現，暗培養下的擬南芥VHA－c1過表達純合體的根變短，再次證實VHAc1在細胞的擴展中起作用。至于根為何變短，推測可能是由于VHA－c1 的上游調控區存在光敏感元件AE－box、GATA 等，黑暗信號可能直接或間接影響VHA－c1的過量表達，進一步影響V－ATPase活性，使得細胞擴展時質子的轉運及液泡的酸化困難，使物質運輸時供能受阻。至于是主根分生區變短還是根細胞伸長受抑制，還有待于在細胞層次上進一步驗證。

3．2 VHA－c1可能參與ABA 和糖介導的信號轉導途徑

ABA 是一種調節植物生長發育的激素，參與植物生長過程，并且廣泛存在于各種植物諸多生理活動中，如參與種子休眠、葉及根的伸展以及葉片脫落等。Tsinatis等首次報道了ABA 誘導V－ATPase c亞基的表達［22］。研究發現，對外源ABA 有響應的植株其V－ATPase活性及H＋轉運活性增加［22－23］。本實驗對獲得的過表達純合體的種子和幼苗進行ABA 處理后發現，VHA－c1的過表達導致轉基因純合體種子萌發、主根伸長和子葉的擴展對ABA 的抑制不敏感。我們推測很可能是由于VHA－c1 基因的過量表達影響了V－ATPase的活性及H＋轉運活性，進而影響了植物在種子萌發和生長過程中對ABA 的響應和轉運。

有研究發現，植物響應ABA 的生理過程與糖有關。Chen等［14］發現，對ABA 不敏感的突變體hy5在種子萌發和幼苗生長方面對糖的抑制也不敏感，可能是由于糖處理減弱了種子或幼苗對ABA的響應。Finkelstein等［24］將野生型和對ABA 不敏感（abi）的擬南芥種子進行萌發實驗后發現，低濃度的葡萄糖、蔗糖或果糖影響ABA 的抑制作用。本實驗對過表達純合體進行了糖處理，結果顯示：過半數的VHA－c1過表達純合體株系的種子在用葡萄糖和蔗糖處理后，萌發率較野生型高。綜合ABA和糖處理的結果，VHA－c1的過表達導致種子的萌發對外源ABA 和糖處理都不敏感，至于在種子萌發時，ABA 和糖信號怎樣介導種子萌發的信號轉導，以及VHA－c1 的過量表達怎樣影響了V－ATPase的活性，從而降低了種子對ABA 和糖的敏感程度，還有待于進一步的研究證實。

綜上所述，本研究獲得了擬南芥VHA－c1過表達純合體，對其進行暗培養、ABA 處理和糖處理，發現其表型與野生型不同，為進一步研究VHA－c1基因在植物生長發育、激素響應和信號轉導過程中的功能奠定了基礎。

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