龍眼體細胞胚胎發生過程中DlWUS 的克隆與表達分析

張冬敏，田奇琳，楊曼曼，林玉玲，賴鐘雄

（福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州350002）

體細胞胚胎發生是植物體外再生的一種有效方法，目前已經有許多經濟作物利用體細胞胚胎發生來獲得體外再生植株，并且因為體細胞胚胎發生的生長發育過程類似于合子胚，所以也常常作為研究高等植物合子胚生長發育的模式材料。外植體誘導體細胞胚胎發生無論是直接從胚性細胞誘導還是經愈傷組織形成的胚性愈傷組織最后形成，都需經過一個胚性細胞階段［1］。早年的研究多集中于外源激素對植物體細胞胚胎發生的影響，近年越來越多與體細胞胚胎發生相關的基因被鑒定出來，其中包括編碼同源異型結構域蛋白新亞基的轉錄因子WUSCHEL（簡稱WUS）。WUS 是WUS HOMEO－BOX（WOX）家族成員，具有典型的HOX、WUS box 和EAR－like位點［2－5］。主要在莖端分生組織的干細胞組織中心和花分生組織中表達，被認為是決定干細胞命運的基因。在干細胞形成前開始表達，誘導周圍細胞形成并維持干細胞特性，加速周邊干細胞的分裂速度，與CLAVATA3（CLV3）形成一個負反饋調節環，共同維護分生組織中干細胞團數量的穩定，促進體細胞胚胎的形成［6－7］。

WUS 的表達可以誘導植物的體細胞向胚性細胞轉變，進而提高植物體細胞胚胎發生能力［8－9］。一般認為，植物體細胞胚胎發生是由于外源施加的生長素促發信號級聯反應進而誘導體細胞胚胎發生，因此植物體細胞胚胎發生需依賴于較高濃度的外源生長素，而研究發現WUS 的超表達可使擬南芥（Arabidopsis）體細胞在無外源激素誘導下形成體細 胞胚［10］。Zheng 等［11］將 擬 南 芥AtWUS 轉 入 陸地棉中，異位表達的AtWUS 使得陸地棉（Gossypium hirsutum）CRI12 品種的愈傷分化率從原先的0．61%上升到47．75%，可見WUS 轉錄因子參與調控植物體細胞胚胎的形成。

雖然植物體細胞胚胎發生是植物體外再生的有效方法，但存在體細胞胚誘導率及轉換率的問題，目前還有許多植物較難誘導體細胞胚胎發生，如擬南芥以及一些多年生木本植物。因為WUS 轉錄因子在體細胞胚胎發生過程中發揮了重要作用，所以研究其在植物體細胞胚胎發生過程中的表達規律對改善難體胚發生植物的體胚發生能力意義深遠。龍眼（Dimocarpus longan Lour．）作為重要的南方經濟果樹，是較早建立體胚高頻再生系統的木本植物，早在1997年賴鐘雄等［12－13］就利用龍眼‘紅核子’LC2懸浮細胞系誘導的胚性愈傷組織誘導并建立龍眼體細胞胚胎發生系統，之后由陳春玲等［14］進一步研究，目前已經可以同步化培養獲得龍眼不同發育階段的體細胞胚胎。因此，本研究以現有的龍眼體細胞胚胎發生系統為材料，分離和克隆龍眼WUS 基因，并通過實時熒光定量PCR 研究其在龍眼體細胞胚胎發生過程中的表達規律以及外源激素處理對其表達的影響，期望為解決多年生木本植物體細胞胚胎發生困難的問題提供解決方向。

1 材料和方法

1．1 供試材料

以賴鐘雄等［13］建立的龍眼‘紅核子’LC2懸浮細胞系誘導并由福建農林大學植物工程研究所繼代保存的胚性愈傷組織為試驗材料。按照龍眼體細胞胚胎發生同步化調控的方法［14－15］誘導獲得龍眼不同體細胞胚胎發生階段的材料，包括：球形胚、不完全胚性緊實結構、心形胚、魚雷形胚和子葉胚，以及不同激素處理的龍眼胚性愈傷組織用于實時熒光定量PCR 材料。激素處理參照曾麗蘭［16］的方法，取繼代培養20d、生長良好的龍眼胚性愈傷組織，分別接種于添加吲哚乙酸IAA（0．0、0．5、1．0和1．5mg／L）、赤霉素GA3（0．0、3．0、6．0、10．0、12．0 和25．0 mg／L）及 水 楊 酸SA（0．0、50．0、75．0 和100．0 μmol／L）的MS液體培養基中，25 ℃，150r／min震蕩培養24h。

1．2 方 法

1．2．1 DlWUS 基因克隆 采用TriPure Isolation Reagent（Roche）提取龍眼各個體細胞胚胎發生階段（胚性愈傷組織、球形胚、魚雷形胚和子葉胚）混合材料的總RNA，具體步驟參見試劑說明書；按照GeneRacer Kit（Invitrogen）的使用說明逆轉錄合成cDNA 第一鏈，用于DlWUS 基因cDNA 序列的擴增。龍眼胚性愈傷組織DNA 的提取參照王鳳華等［17］的方法。

采用同源克隆與RACE 法，以GeneRacer Kit（Invitrogen）逆轉錄合成的龍眼混合體胚材料cDNA第一鏈為模板，根據NCBI上已登錄的其他植物WUS 基因的核苷酸序列，在其保守區域設計引物WUS－F1和WUS－R1，進行保守區的擴增，利用獲得的保守區序列設計3′－RACE 引物對WUS－3P和WUS－3NP，5′－RACE 引物對WUS－5P 和WUS－5NP，分別進行巢式PCR，擴增DlWUS 的3′和5′端序列；依據拼接獲得的DlWUS 全長序列，在該序列的5′和3′端分別設計引物WUS－F2和WUS－R2，進行該基因序列的全長cDNA 擴增，同時以龍眼胚性愈傷組織DNA 為模板，全長cDNA 擴增引物進行PCR 反應，獲得龍眼WUS 的DNA 序列，引物具體信息列于表1。反應程序：94℃預變性3min，94℃變性30s，退火30s（退火溫度見表1），72 ℃延伸按1kb／min設置，共35個循環，72 ℃終延伸10min。

表1 DlWUS基因克隆與表達分析引物信息Table 1 Primers used in DlWUSgene cloning and Real－time quantitative PCR

1．2．2 龍眼WUS 基因的生物信息學分析 以DNAMAN 6．0對擴增獲得的序列進行拼接；利用ORF Finder在線軟件尋找序列開放閱讀框并推導編碼的氨基酸序列；采用ExPASy Protpara在線軟件分析DlWUS 編碼的氨基酸序列的理化性質；利用SignalP 4．1Server預測DlWUS 編碼蛋白質的信號肽；采用WoLF PSORT 在線軟件預測DlWUS的亞細胞定位情況；使用TMpred Server預測Dl－WUS 的跨膜區；用NetPhos 2．0Server預測Dl－WUS 基因翻譯后修飾的磷酸化位點；采用NCBI Blastp 預測DlWUS 的保守結構域；利用COILS Server預測DlWUS 形成的卷曲螺旋的傾向性；利用SOPMA 在線軟件預測DlWUS 的二級結構；利用MEGA 5．2軟件的Neighbor－Joining（鄰位相接法，NJ 法）進行WUS 的系統進化樹構建，并用Bootstrap法（重復1 000次）對構建的進化樹進行評估。

1．2．3 DlWUS 基因的實時熒光定量PCR 分析 胚性愈傷組織、不完全胚性緊實結構、球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚及經激素處理的胚性愈傷組織的總RNA 的提取方法同1．2．1；采用SYBR Ex－ScriptTM試劑盒（TAKARA 公司）反轉錄合成cDNA 第一鏈，用于DlWUS 基因的熒光定量分析，具體步驟參見試劑盒使用說明。以EIF－4a、EF－1a 和FSD 基因作為內參基因，以引物WUS－qF、WUSqR（表1）進行實時熒光定量PCR，采用三步法，將不同發育階段的龍眼體胚cDNA 模板混樣進行5倍梯度系列稀釋制作標曲，處理樣品cDNA 模板稀釋15倍后進行熒光定量PCR，3次重復，具體的反應體系及擴增程序參照Lin等［18］。最終獲得的數據 利 用 公 式2－Δα及Excel、geNORM（version 3．5）［19］軟件進行分析。

2 結果與分析

2．1 DlWUS 基因cDNA全長與DNA序列的克隆

以合成的龍眼混合樣的全長cDNA 第一鏈為模板，以引物WUS－F1／WUS－R1進行PCR 擴增獲得了預期的136bp保守序列；以引物WUS－3P／3P，WUS－3NP／3NP進行巢式PCR，擴增獲得774bp 3′端序列，包括150bp 3′－UTR（含poly A）；以引物WUS－5P／5P，WUS－5NP／5NP 進行巢式PCR，擴增獲得253bp的5′端序列，包括102bp的5′－UTR。利用DNAMAN 6．0將獲得的3段序列進行拼接，龍眼WUS 基因cDNA 序列全長1 110bp，經NCBI的GenBank數據庫在線Blastn，結果顯示與其他物種的WUS 基因一致性較高，初步推斷擴增得到的三段序列為龍眼WUS 基因的序列。以設計的全長擴增引物WUS－F2和WUS－R2進行PCR 擴增，獲得867bp的目的序列，與拼接結果相同，均包含完整的開放閱讀框；將該轉錄本的核苷酸序列在NCBI的GenBank數據庫中進行在線Blastn分析，結果顯示該序列與其他物種的WUS 基因同源性較高，其中與臍橙（Citrus sinensis，EU032533）、蓖麻（Ricinus communis，XM002530689）和 葡 萄（Vitis vinifera，XM002266287）的一致性分別為70%、70%和83%，由此認為擴增得到龍眼WUS 基因的cDNA 全長序列，將其命名為DlWUS（GenBank登錄號為KM017506）。以龍眼胚性愈傷組織DNA為模板，以全長引物擴增獲得1 805bp的DNA 序列，與cDNA 序列比對表明，其包含2個內含子和3個外顯子。

2．2 DlWUS 基因的生物信息學分析

利用DNAMAN 6．0和ORF Finder分析，龍眼DlWUS 基因cDNA 全長1 110bp，包括102bp的5′－UTR、150bp的3′－UTR（含poly A）和858bp的開放閱讀框，共編碼285 個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。利用ExPASy Protpara、SignalP 4．1Server和TMpred Server在線軟件對DlWUS 編碼的氨基酸序列進行分析，結果顯示：該蛋白分子式為C1368H2069N391O453S11，分子量為31 593．4 Da，理 論 等 電 點5．68，不 穩 定 系 數 為49．60，總平均疏水性為－0．873，不具有信號肽，在169～191位置間存在一個長度23bp、由內向外的跨膜螺旋，分值為660，由此推測該蛋白為不穩定親水酸性跨膜蛋白，且不屬于分泌型蛋白。使用WoLF PSORT 在線軟件預測DlWUS的亞細胞定位，結果顯示：DlWUS 定位于細胞核的可能性最大。用NetPhos 2．0Server對DlWUS 基因翻譯后修飾預測，結果顯示：該蛋白具有23個磷酸化位點（Ser16，Thr3，Tyr4）。

WUS屬于同源異型結構域（homeodomain）蛋白超級家族，通過NCBI Blastp 預測龍眼DlWUS的保守結構域，結果表明，龍眼DlWUS具有Homeodomain結構域，在肽鏈的第26～92 位氨基酸間（圖1）。利用COILS Server對DlWUS形成的卷曲螺旋的傾向性進行預測，結果表明DlWUS在200～250位氨基酸間極易形成卷曲螺旋。利用SOPMA在線軟件對DlWUS進行二級結構預測，結果表明：DlWUS的二級結構由20%α－螺旋、3．16%β－轉角、10．18%延伸鏈和66．67%無規則卷曲組成。為了更全面的了解DlWUS 編碼的蛋白的特性，利用DNAMAN 6．0將其與其他物種該蛋白進行多重比對，發現DlWUS 具有WUS轉錄因子的保守序列：WUS box和EAR－like位點（圖2），進一步表明Dl－WUS 屬于典型的WUS 轉錄因子。

2．3 DlWUS 基因編碼的蛋白同源性及進化分析

將龍眼DlWUS 基因推導的氨基酸序列經NCBI Blastp 比 對 分 析 發 現，DlWUS 與 大 豆（Glycine max）、蓖 麻（Ricinus communis L．）、臍 橙（Citrus sinensis）的同源性相對較高，分別在58%、61%和56%。為了進一步了解龍眼DlWUS 的進化關系，本研究選擇經NCBI Blastp 比對，與DlWUS 同源性較高的13種植物，采用MEGA 5．2中的N－J法構建系統進化樹（圖3）。結果表明，根據種屬關系，WUS可分為兩大類，單子葉植物聚為一類，雙子葉植物聚為一類，而龍眼與臍橙的親緣關系最近，聚在一個分支內。

2．4 龍眼DlWUS 在不同體胚階段中的表達分析

采用實時熒光定量PCR 分析DlWUS 在龍眼胚性愈傷組織、不完全胚性緊實結構、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚共6個階段的相對表達。結果（圖4，A）表明，雖然DlWUS 在這6個階段均有響應，但是DlWUS 在胚胎發育早期（胚性愈傷組織和不完全胚性緊實結構）的相對表達量很低，而在球形胚時期的表達量達到最高，說明龍眼體細胞胚胎發生過程中，DlWUS 主要在球形胚時期表達。

圖1 DlWUS 的保守結構域Fig．1 The conserved domain of DlWUS

圖2 DlWUS 與其他物種WUS 基因編碼的氨基酸的多重比對圖中物種名稱按順序分別為：龍眼，大豆，臍橙，梅，煙草，葡萄，苜蓿，蓮，毛白楊；Homeodomain、WUS box與EAR－like是WUS的保守結構域Fig．2 Alignment of amino acid sequences of DlWUS with WUSfrom other species Above the species name according to the order：Dimocarpus longan，Glycine max，Citrus sinensis，Prunus mume，Nicotiana sylvestris，Vitis vinifera，Medicago truncatula，Nelumbo nucifera，Populus tomentosa；，respectively；Homeodomain，WUS box and EAR－like are the conservative domain of WUS

2．5 龍眼DlWUS 在不同激素（IAA／GA3／SA）濃度處理下的表達分析

植物激素在植物生長發育過程中扮演了重要角色，參與調節植物生命活動的許多環節，為了了解IAA、SA 和GA3對龍眼DlWUS 表達的影響，利用實時熒光定量PCR 技術分析了不同激素濃度處理后DlWUS 表達的變化。結果表明：在設置的4個IAA 濃度梯度內，與對照相比，DlWUS 基因的表達均有所提高，并且當外源施加IAA 濃度達到1．0 mg／L時，DlWUS 的相對表達量增加顯著（圖4，B）。經不同GA3濃度處理后，當GA3濃度小于等于12mg／L 時，GA3可促進DlWUS 的表達，并且在12mg／L時，促進效果最明顯；而當外源施加的GA3濃度達到25mg／L 時，對DlWUS 表達的促進作用消失（圖4，C）。經不同SA 濃度處理后，與對照相比，低濃度（≤50μmol／L）SA 處理的龍眼胚性愈傷組織中DlWUS 的表達量明顯下降，而當SA濃度達到100μmol／L 時，相對于對照組，DlWUS的表達量略高（圖4，D）。

圖3 WUS系統進化樹圖中分支點的數字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節點可信度Fig．3 Phylogenetic tree of WUS The number at the nodes represents the reliability percent of bootstrap values based on 1 000replications

圖4 DlWUS 在龍眼體細胞胚胎發生過程及不同激素（IAA、GA3、SA）處理下的相對表達A．龍眼體細胞胚胎發生過程DlWUS mRNA 的相對表達：1．胚性愈傷組織；2．不完全胚性緊實結構；3．球形胚；4．心形胚；5．魚雷形胚；6．子葉胚；B．外源IAA 處理；C．外源GA3 處理；D．外源SA 處理Fig．4 Relative expressions of DlWUSat different stages of longan SE and different concentrations of IAA／GA3／SA A．Relative expressions of DlWUSat different stages of longan SE（1．The friable－embryogenic callus；2．Incomplere compact pro－embryogenic cultures；3．Globular embryos；4．Heart embryos；5．Torpedo embryos；6．Cotyledonary embryos）；B．Different concentrations of IAA；C．Different concentrations of GA3；D．Different concentrations of SA

3 討 論

3．1 DlWUS 參與龍眼體細胞胚胎發生并調控體細胞胚胎發育后期的形態建成

生物信息學分析表明：DlWUS 編碼的蛋白具有WUS 轉錄因子特有的保守序列WUS box 和EAR－like位點，其都屬于抑制型結構域，在WUS 基因中WUS box發揮主要作用，缺失WUS box的突變體植株喪失了異位表達WUS 形成體細胞胚胎的功能［20］。另外Zhang等［21］在擬南芥、水稻等植物WOX 家族基因的研究中發現，WUS box是WOX家族中對植物分生組織具有調控作用的成員特有的序列，由此推斷龍眼DlWUS 基因可能在誘導植物形成體細胞胚中發揮作用，并且參與植物分生組織的調控。

在擬南芥的研究中發現，WUS 最早在16－細胞早 期球形 胚 時 期 開 始 表 達［10，22－23］，而CLV3 的 表 達則稍晚于WUS，在心形胚時期才開始表達［24－26］。本研究對DlWUS 進行實時熒光定量PCR 分析結果表明，在龍眼體細胞胚胎發生過程中，雖然DlWUS在體細胞胚胎發生6個階段中均有反應，但除了在球形胚時期其轉錄水平較高外，其他5個階段其轉錄水平都較低，說明在體細胞胚胎發生過程中Dl－WUS 主要在球形胚時期發揮作用，并影響后期體胚的形態建成。陳春玲等［27］研究發現，在龍眼體細胞胚胎發生過程中，內源IAA 主要在胚性愈傷組織和球形胚時期累積，但由于PIN1蛋白在球形胚時期才開始表達促發生長素的極性運輸［1，28］，而WUS的表達受生長素濃度梯度的調控，因此推測在球形胚時期，PIN1蛋白的極性定位促使IAA 極性運輸并呈梯度分布進而誘導了WUS 的表達，而WUS 基因的表達又啟動了CLV3 基因的表達，由于CLV3與WUS 間的負反饋調節作用，使得體胚發育后期DlWUS 的表達維持在一個相對穩定的狀態，并且推測在龍眼心形胚時期很可能有干細胞的形成，即開始形成胚根、胚芽原基。

3．2 外源激素影響龍眼DlWUS 的表達

3．2．1 外源IAA 改變DlWUS 的表達 生長素是植物生長發育所必須的內源激素，也是目前已知的可以調控植物干細胞的外源信號［29］。生長素濃度梯度與PIN1蛋白對生長素極性運輸的調控對誘導WUS 表達和體細胞胚胎發生至關重要［30］。PINs蛋白的極性定位影響生長素的區域分布，同時區域性的施加生長素也能誘導PINs蛋白的表達，改變PINs蛋白的極性定位［30－33］。在PIN1蛋白介導下，植物體內的生長素進行極性運輸，形成生長素濃度梯度，在生長素濃度梯度的特定區域，誘導WUS 的表達，進而誘導形成體細胞胚［1，34－35］。WUS 的表達需要特定的生長素濃度，在這個臨界值范圍內，外源生長素誘導了WUS 的表達，因而確定外源生長素施加的濃度范圍顯得尤其重要。在本試驗中，不同濃度的外源IAA 處理后，相較于對照，龍眼胚性愈傷組織中DlWUS 的表達量明顯有所提高，并且在外源施加IAA 濃度為1．0 mg／L 時表達量達到峰值，是對照的35倍左右。由此推測，在龍眼體細胞胚胎發生過程中，外源IAA 誘導PIN1蛋白極性重建，生長素濃度梯度重新分配，從而促進了DlWUS的表達，并且很有可能外源施加IAA 的濃度在1．0 mg／L左右是誘導DlWUS 表達的一個臨界點。

3．2．2 外源施加低濃度GA3促進DlWUS 的表達 赤霉素是植物生長發育過程中的一種重要激素，參與植物生命周期中的多個生物過程，包括種子萌發，莖的生長等［36］。在本試驗中，經不同濃度的外源GA3處理后，DlWUS 的表達相較于對照有所提高，并且在外源施加GA3濃度達到12 mg／L 時達到峰值，是對照的2．5倍左右，說明DlWUS 對外源施加赤霉素有積極的響應，并且DlWUSDNA 的內含子中含有赤霉素應答元件P－box，由此初步推斷外源施加低濃度的GA3可以促進DlWUS 的表達，進而在植物體細胞胚胎發生過程中發揮作用。

3．2．3 外源施加低濃度SA 抑制DlWUS 的表達 水楊酸作為一種廣泛存在于植物體內的一種內源信號分子，是提高植物抗逆性的重要激素之一，在外源施加一定濃度范圍內對誘導植物體細胞胚也有促進作用，但是不同的植物需要的誘導濃度不同。Hosseini等［37］的研究認為外源施加低濃度的SA 可促進胡蘿卜體細胞胚的形成，而高濃度的SA 則抑制體細胞胚的形成；在Luo等［38］對沙打旺進行研究時發現，當外源施加SA 150μmol／L 時，其體細胞胚胎發生頻率最高。本試驗結果表明，在外源施加SA 濃 度 低 于100μmol／L 時，DlWUS 的 表 達 量 都受到不同程度的抑制，并且在50μmol／L 時抑制效果最明顯，這與匡華琴［39］的研究認為外源水楊酸抑制WUS 表達的結論基本相符，而當外源施加SA 濃度達到100μmol／L時，DlWUS 的表達量相對于對照略有提高。初步推測，在龍眼體細胞胚胎發生過程中，外源施加低濃度的SA 抑制了DlWUS 的表達，進而對龍眼體胚的生長發育進行調控，而外源施加較高濃度的SA 對DlWUS 是否有促進作用還有待進一步的試驗證明。

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