碳離子輻照對菘藍藥性品質和分子水平的誘變效應

閻 侃，李雪虎

（1 蘭州大學 生命科學學院，蘭州730000；2 中國科學院 近代物理研究所，蘭州730000）

菘藍（Isatis indigotica）系十字花科兩年生草本植物，根葉分別是中國大宗使用的傳統中藥材板藍根和大青葉，它們具有較好的治療流行性感冒［1］、咽喉腫痛［2］和抗癌癥［3］的功效。化學分析發現，菘藍中的主要藥用成分為4（3H）喹唑酮和靛玉紅等［4］。4（3H）喹唑酮對流感病毒和柯薩奇病毒的活性有較強的抑制作用［5］。靛玉紅有較強的抗癌作用，可有效抑制人類乳腺癌細胞MCF－7 的生長［6］。野生菘藍中4（3H）喹唑酮和靛玉紅的含量極少，工業化提取要求高，代價大。隨著菘藍在制藥行業中的使用量越來越大，如何培育有效藥用成分含量高的新品種成為一個重要科學問題。

重離子輻照是一種新型的誘發突變源，具有高傳能線密度和獨特的電離峰［7］。碳離子輻照作為重離子輻照的一種，具有突變譜廣，突變性狀容易穩定，正向突變率高等獨特的優勢［8］。近些年來，在利用重離子輻照育種或篩選突變體的過程中，獲得了大量其他誘變方式難以獲得的表型，并在生產和科研中得到成功運用，比如碳離子輻照菊屬植物使之顏色發生改變并生成了舌狀花的形狀［9］；碳離子輻照擬南芥（Arabidopsis thaliana）產生了葉子形狀發生改變的突變體［10］，這些突變體產生的原因多是由于重離子輻照導致DNA 發生了突變。

目前評價和確認新的突變體常用的分子標記有RAPD［11］、AFLP［12］、ISSR［13］和SRAP［14］等。重 離子輻照突變體利用分子標記技術進行鑒定的也很多。比如，4He2＋對日本扁柏（Chamaecyparis obtusa）的莖芽原基輻照后，進行了RAPD 分析，以檢驗不同突變體的DNA 變化差異［15］；空間重離子對水稻（Oryza sativa）輻照后，利用AFLP 分析突變體基因組的變化特點［16］。但是RAPD 的擴增結果重復性較差，容易受各種因素的影響；AFLP對于反應條件和DNA 純度要求過高；ISSR 可能在特定基因組DNA 中沒有配對區域。SRAP 是一種新型的基于PCR 的分子標記，為顯性標記，是由美國加州大學的Quiros等［14］于2001 年在蕓薹屬作物中開發出來的。該標記對基因的開放閱讀框的特定區域進行擴增，重復性較好，步驟簡潔，目前已成功地應用于遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析、重要性狀相關基因的克隆等方面，比如對于雙齒圍沙蠶（Nereis succinea）的基因多樣性分析［17］和對花燭（Anthurium andraeanum）遺傳連鎖圖譜的建立［18］。因此，研究第一次運用SRAP 技術對于碳離子輻照突變體進行了分析。

為了培育含有高藥效成分的菘藍品系，本研究利用劑量呈梯度遞增的碳離子輻照菘藍干種子，探討不同劑量輻照下菘藍生理指標和藥性質量的變化，同時還首次運用SRAP、SDS－PAGE和蛋白磷酸化染色分別從DNA 水平、蛋白水平和蛋白修飾水平系統評價了不同劑量碳離子輻照對菘藍分子層面的影響，這將對重離子輻照的突變特性研究和菘藍的分子生物學研究提供重要參考。

1 材料和方法

1．1 種子輻照、種植和生長狀況測定

本研究所采用的野生型菘藍種子經中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所藥物研究室羅永江副研究員鑒定為十字花科兩年生草本菘藍種子。將野生型的干種子在中國科學院近代物理研究所重離子加速器上進行12C6＋輻照誘變。碳離子的能量為270 MeV／u，劑量比率是20 Gy／min，設30Gy、60Gy、90Gy和120Gy 4個劑量梯度。野生型和輻照突變體統一種植于輻照植物培養間，每個劑量采用1 000粒M1種子統計成苗率；以繁殖3代以上穩定遺傳的輻照突變體為材料，培養3個月后進行指標測定，至少30棵植株統計根平均鮮重。

1．2 靛玉紅和4（3H）喹唑酮的樣品制備和含量測定

（1）靛玉紅 將菘藍根在60 ℃水浴蒸干，殘渣用色譜級甲醇定容，0．45μm 濾膜過濾，濾液作為檢測樣品。含量檢測使用高效液相色譜儀，流動相為甲醇∶水（75∶25），流速為1．0mL／min，檢測波長為289nm。

（2）4（3H）喹唑酮 將菘藍根粉碎，用濾紙包好放入玻璃器皿中，加色譜級甲醇，于超聲波清洗器中超聲0．5h，再重復2次后，合并3次濾液，0．45μm濾膜過濾。含量檢測使用高效液相色譜儀，流動相為乙腈∶甲醇∶水（5∶20∶75），流速為0．8 mL／min，檢測波長為225nm。

1．3 總蛋白表達分析

1．3．1 總蛋白的提取 菘藍根加液氮研磨至粉末，加入2×SDS－PAGE loading buffer（100 mmol／L Tris－HCl（pH 6．8），4% SDS，0．2% BPB，20%甘油，5%β－巰基乙醇），在沸水浴5min，18 000g離心10min，取上清加4倍體積的丙酮，－20 ℃沉淀過夜后離心棄上清，加80%的丙酮洗沉淀1～2遍，沉淀干燥后加入2×SDS－PAGE loading buffer溶解。

1．3．2 考馬斯亮藍染色和蛋白磷酸化染色 采用Bradford法測定樣品蛋白濃度后［19］，加入1×SDSPAGE loading buffer with dye上樣于10%的SDSPAGE膠中，待溴酚藍剛剛跑出膠后，取膠于固定液（10% 乙酸，50%甲醇）中孵育30min后，換新固定液，孵育過夜。去離子水漂洗30 min×2。暗下于稀釋3倍的pro－Q（Invitrogen 公司）染液中孵育2 h，暗下脫色液（50 mmol／L 乙酸鈉（pH 4．0），20%乙腈）脫色30min×4，去離子水洗2次。通過UVP凝膠成像系統成像。之后把膠在考馬斯亮藍染液（10%磷酸，0．12%考馬斯亮藍G－250，20%甲醇，10%硫酸銨）中孵育2h，脫色（10%甲醇，10%乙酸）過夜后，掃描儀成像。

1．4 基因表達分析

1．4．1 DNA 的提取 取幼嫩葉片，采用DNA 提取試劑盒（Axygen公司）提取基因組DNA，具體提取方法參照試劑盒說明書。DNA 的總量和質量通過nanodrop2000和電泳來分析。

1．4．2 DNA擴增 SRAP分子標記引物購于華大基因公司，具體序列見表1。擴增儀器為BIO－RAD的S1000型號PCR 儀。通過前期正交分析獲得的最佳擴增體系為：r Taq（takara）0．3μL，Mg2＋1．5 μL，dNTP（2．5mmol／L）1．5μL，DNA（20ng／μL）2．5μL，引物（10μmol／L）1．5μL，10×buffer 2．5 μL，dH2O 13．7μL。擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃30s，35 ℃1 min，72 ℃2 min，循環5次；94 ℃30s，52 ℃1 min，72 ℃2 min，循環35次；72 ℃10 min。產物在1．5%的瓊脂糖凝膠中電泳。

1．5 數據分析

采用SRAP擴增出的條帶來統計基因座，一個條帶即代表一個基因座，記為1，同一大小處突變體或野生型中未出現該條帶則表示該基因座發生改變，記為0。不同劑量的突變體分別與野生型進行比較，用軟件Popgene計算多態性比率和Nei－Li’s距離指數。蛋白條帶和磷酸化蛋白條帶的增減由軟件Quantity One進行分析。

表1 菘藍SRAP－PCR的引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers for I．indigotica SRAP－PCR

2 結果與分析

2．1 碳離子輻照對菘藍出苗率和根鮮重的影響

隨著12C6＋輻照劑量從30Gy逐漸增高到120Gy，菘藍種子成苗率也比野生型（WT）下降了16．6%～66．6%（圖1，A），同時90d齡的M1代植株的根平均鮮重也不斷下降，相比野生型對照降低了22．93%～71．20%，各輻照材料間均差異顯著（圖1，B）。可見，不同劑量碳離子輻照均不利于菘藍種子成苗和幼苗生長。

2．2 碳離子輻照對菘藍次生代謝產物含量的影響

HPLC技術現已廣泛運用于天然產物的分析和測定，已有研究者成功利用醇浸提法提取了菘藍葉子的次生代謝產物，并用HPLC測定了其中靛藍前體的含量［20］。本研究表明，不同劑量的碳離子輻照后，菘藍根的醇浸出物量較野生型均顯著下降，且有隨輻照劑量增加而逐漸降低的趨勢（圖2，A）。同時，輻照前后菘藍根中兩個主要藥效成分靛玉紅和喹唑酮［4］的HPLC 檢測結果顯示：根靛玉紅（圖2，B）和根喹唑酮（圖2，C）的含量均隨著輻照劑量的增大先升高后下降，并均在30Gy輻照時均達到了最大值，此時分別比野生型對照顯著升高了2．3倍和2．2倍；同時，兩種活性成分含量在60Gy輻照時也顯著高于野生型，而在120Gy輻照時卻顯著低于野生型。以上結果說明碳離子輻照顯著降低了菘藍根次生代謝產物含量，但適宜劑量輻照（30和60Gy）能顯著提高其根中主要藥效成分靛玉紅和喹唑酮含量，改良藥物品質。

圖1 不同劑量碳離子輻照下菘藍的成苗率（A）和根平均鮮重（B）WT 為野生型，30Gy、60Gy、90Gy和120Gy分別表示不同劑量輻照材料；不同字母表示不同材料間在0．05水平存在顯著性差異；下同Fig．1 The seedling surviving rate（A）and average root fresh weight（B）of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses WT is wild type，while 30Gy，60Gy，90Gy and 120Gy are materials treated by different carbon ion irradiation doses；Different letters meant significant differences among treatments at 0．05level；the same as blow

2．3 碳離子輻照對菘藍基因組的影響

為了分析輻照后菘藍植株的變異情況，本研究借助SRAP分析了樣本在DNA 水平的多樣性。采用了15 條SRAP 通用引物（表1），組合形成了56對不同的引物，對野生型和不同劑量輻照后的菘藍DNA 分別進行擴增。通過統計，野生型和突變體中一共擴增出了387個基因座，其中309個具有多態性。每對引物擴增出的基因座數的統計結果見表2。其中，不同引物對擴增產生的多態性基因座數從4個到13個不等；引物組合Me1Em4擴增最多達到13 個 基 因 座，而 Me2Em4、Me5Em2、Me5Em3、Me5Em4和Me5Em7引物組合只擴增出了2 個基因座。通過軟件Popgene分析，56對引物的平均多態性基因座比率為79．84%。圖3，A～C 分別展示在1．5% 的 瓊 脂 糖 凝 膠 上 Me2Em1、Me1Em2、Me3Em6這3對SRAP引物的擴增條帶，其擴增產物條帶的大小在200～2 000bp之間。

圖2 不同劑量的碳離子輻照下菘藍根的醇浸出物（A）、靛玉紅（B）和喹唑酮（C）的含量Fig．2 The contents of alcohol extracts（A），indirubin（B）and quinoxalinol（C）in the root of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses

多態性基因座占基因座總數中的比率稱為多態性基因座比率。與野生型對照比較，在387個基因座總數（表2）中，30Gy、60Gy、90Gy和120Gy輻照菘藍的多態性基因座比率分別為：33．59%、37．73%、40．31%和43．41%（表3）。可見，碳離子輻照后的菘藍在DNA 水平與對照表現出明顯的不同，且其多態性隨著輻照劑量的增加而增強。

另外，用56對引物組合擴增出的野生型和輻照突變體得到的條帶數據來確定Nei－Li’s距離指數。其中，最高的距離指數是0．727 3，出現在30Gy與120Gy 輻照材料之間，而最低的距離指數是0．409 3，出現在30Gy與60Gy輻照材料、30Gy輻照材料與野生型對照組之間；所有樣品之間平均距離指數為0．518 4（表4）。

進一步基于SRAP 分子標記做出的UPGMA的進化樹將野生型和突變體分為了兩個簇，一個簇包括60Gy和120Gy輻照材料，另一個簇包括了其他的輻照突變體和野生型對照組，含有對照組的簇又包含了兩個子簇，一個是60Gy，另一個是野生型和30Gy（圖4），這樣就更加直觀低展現出了不同劑

量的輻照突變體之間基因組變異度的關系。

表2 菘藍SRAP數據統計Table 2 Statistics for SRAP data of I．indigotica

圖3 不同劑量的碳離子輻照下菘藍的SRAP分析結果A～C分別為引物組合Me2Em1、Me1Em2、Me3Em6的PCR擴增結果Fig．3 SRAP analysis of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses A－C are PCR results amplified by primer pair Me2Em1，Me1Em2and Me3Em6，respectively

表3 不同劑量碳離子輻照下菘藍的多態性基因座比率Table 3 Polymorphic locus ratio of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses

表4 不同劑量碳離子輻照下菘藍的Nei－Li’s距離指數Table 4 The Nei and Li’s distance index of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses

2．4 碳離子輻照對菘藍總蛋白表達水平的影響

碳離子輻照不僅會導致DNA 水平的突變，也會導致蛋白水平的變化。突變體的蛋白水平變化（條帶的增加或缺失）可以用SDS－PAGE 方法檢測［21］。本研究中野生型和碳離子輻照菘藍總蛋白表達水平使用SDS－PAGE進行了檢測，再經考馬斯亮藍G－250染色后（圖5），通過軟件Quantity One利用蛋白Maker估算了所有條帶的分子量，并分析了同一分子量處條帶的增減。結果發現，野生型和突變體菘藍中一共分離出了19個條帶，其中9條具有多態性，具體統計結果見表5；與野生型相比，輻射突變體均出現了新增或消失的條帶，30Gy、60Gy、90Gy和120Gy 輻照菘藍的多態性比率分別為42．11%、36．84%、36．84%和42．11%（表6）。這說明各劑量碳離子輻照對菘藍的蛋白質表達水平造成了不同程度的影響，而輻照突變體總蛋白的表達水平與基因組的變化程度并不呈正相關關系。

2．5 碳離子輻照對菘藍磷酸化蛋白表達水平影響

圖5 不同劑量的碳離子輻照下菘藍的考馬斯亮藍染色SDS－PAGE膠圖Fig．5 SDS－PAGE gel of carbon ion irradiated（different doses）I．indigoticastained by CBB

磷酸化是一種蛋白質的翻譯后修飾形式，參與調控了很多生命過程，因此檢測蛋白質的磷酸化狀態可以有效反映輻照對植物的生長發育的影響。Pro－Q 是一種特異的磷酸化蛋白熒光染料，它可對磷酸化基團特異性地著色。野生型和各劑量輻照菘藍的SDS－PAGE膠經Pro－Q 染色后（圖6），通過軟件Quantity One分析，野生型和突變體中一共有10個條帶被著色，其中8條具有多態性，具體統計結果見表7。與 野 生 型 相 比，各 劑 量（30、60、90 和120Gy）輻照菘藍突變體條帶多態性比率分別為60%、60%、70%和50%（表8）。由此可見，碳離子輻照對菘藍蛋白磷酸化水平產生了影響，也就意味著碳離子輻照對調控菘藍生長發育的分子機制產生了影響，而這種變化跟其總蛋白表達水平一樣，與其基因組的變化程度并不呈正相關關系。

表5 不同劑量的碳離子輻照下菘藍的總蛋白條帶統計Table 5 Statistics for total protein bands of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses

表6 不同劑量的碳離子輻照下菘藍的多態性蛋白條帶比率Table 6 Polymorphic protein bands ratio of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses

圖6 不同劑量的碳離子輻照下菘藍的Pro－Q 染色SDS－PAGE膠圖Fig．6 SDS－PAGE gel of carbon ion irradiated（different doses）I．indigoticastained by Pro－Q

表7 不同劑量的碳離子輻照下菘藍的磷酸化蛋白條帶統計Table 7 Statistics for total phosphoprotein bands of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses

表8 不同劑量的碳離子輻照下菘藍的多態性磷酸化蛋白條帶比率Table 8 Polymorphic phosphoprotein bands ratio of I．indigotica under different carbon ion irradiation doses

3 討 論

磷酸化是蛋白質翻譯后修飾中很重要的一種，磷酸化修飾會改變蛋白質的活性，完成蛋白激酶在激活態和失活態之間的轉變，如胰島素受體［22］。根據目前的研究，調控植物和動物生長發育的各大主要途徑幾乎都有蛋白激酶的參與，如第六大類植物激素油菜素內酯的受體BRI1［23］，通過一系列磷酸化修飾將信號從細胞外轉導至細胞內［24］，從而調節植物的細胞伸長、光形態建成、育性等至關重要的生命過程［25－26］。可見，蛋白質的磷酸化狀態可以從宏觀調控水平有效地反映生物的生長發育狀態是否受到影響。因此，本研究使用了磷酸化染料Pro－Q 對梯度劑量的碳離子輻照突變體進行了分析，這在重離子誘導突變體的特性研究中還未見報道。結果發現，碳離子輻照對菘藍的蛋白表達以及蛋白磷酸化水平均造成了較大的改變，這些改變可能是因為輻照造成的基因突變或者表觀遺傳學改變。同時，本研究還發現基因組突變頻率與輻照強度呈正相關，但總蛋白和磷酸化蛋白多態性并不如此，說明植物在抵抗重離子輻照造成的傷害時有著補償性的應對機制，這其中的分子機理有待進一步的研究。

利用碳離子輻照培育植物新品種有廣泛的應用前景。相比一般低傳能線密度的輻照，比如X 射線、伽馬射線等，碳離子輻照具有高傳能線密度和強生物學效應，能獲得很多其他誘變源難以獲得的表型［7－8］。據統計，到目前為止已通過輻射誘變的方法獲得了3 100多種植物突變體［27］。此類研究還主要集中在花卉觀賞性表型的培育［9］和抗脅迫的農作物的育種，如抗旱［21］、抗鹽［28］等。利用碳離子輻照進行藥用植物誘變育種的研究目前還相對較少。本研究利用碳離子輻照對藥用植物菘藍進行了誘變，首先對最佳的輻照劑量進行了選擇，其選擇應該由處理后的生長參數決定［29］。已有報道表明，高劑量的伽馬射線會導致甘蔗（Saccharum sinense）高比率的突變率，但是同時甘蔗的成活率也下降了［30］。誘變育種必須綜合考慮突變率和成苗率之間的關系。本次研究發現，菘藍種子成苗率和3個月時的根鮮重均隨碳離子輻照劑量增加而明顯降低；相對其他劑量處理，30Gy對菘藍生長抑制最小，實際突變率已處于較高水平，是一個相對較好的誘變劑量。另外，靛玉紅和喹唑酮是菘藍中最重要的藥用成分，前者具有抗病毒功效［1］，后者具有良好的抗癌功效［3］。HPLC的檢測發現30Gy的輻照劑量導致菘藍根中喹唑酮和靛玉紅含量分別比野生型升高了2．2倍和2．3倍，相比其他劑量也含量最高，且差異均達到顯著水平，這也進一步說明了30Gy是菘藍輻照育種最佳的誘變劑量。而更大劑量如90Gy和120Gy輻照處理，兩種有效成分的含量并沒有大幅度的改變，可能是因為高突變率導致多種調控途徑受影響，啟動了反饋抑制調節。

本研究還使用了SRAP 分子標記分析了菘藍輻照突變體基因組的變化，目前對碳離子輻照突變體使用SRAP 分析還未見報道。不同于其他分子標記的是，SRAP的上游引物特異結合外顯子區域，下游引物特異結合內含子區域或啟動子區域，因不同個體內含子、啟動子與間隔區長度不同而產生多態性，因此SRAP 是對基因開放閱讀框的擴增，能夠通過遺傳作圖更有效定位到有利性狀的主效基因［14］。作者前期通過正交實驗建立起了菘藍進行SRAP分析的最佳條件，并對輻照突變體進行擴增后數據穩定可信，這為以后的研究中菘藍有利基因座的圖位克隆提供了技術參考。本研究中最佳條件下SRAP數據顯示，碳離子輻照菘藍突變率在30～120Gy劑量范圍內隨著輻照劑量的增強而增加，這也與其他重離子輻照植物的基因組變化趨勢相符，且結果重復性較好，說明SRAP是一個很好的研究重離子誘變特性指標。

綜上所述，本研究采用不同劑量（30～120Gy）碳離子輻照對傳統中藥材菘藍進行誘變處理，發現30Gy是最佳輻照劑量；30Gy碳離子輻照后，導致菘藍根中主要的活性成分喹唑酮和靛玉紅含量提高了2．2倍和2．3倍，且相比于其他劑量處理，30Gy對菘藍根的產量影響最小。同時，SRAP 分子標記分析結果表明，碳離子輻照后的菘藍在DNA 水平與對照表現出明顯的不同，且其多態性隨著輻照劑量的增加而增強；誘變后的菘藍植株在蛋白水平和蛋白修飾水平也有較大的改變。本研究將為菘藍在醫藥行業中的大規模應用提供基礎，也對其他藥用植物的誘變育種產生示范作用。

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