山藥種質資源的ISSR 分析及初級核心種質庫的構建

劉向宇，霍秀文＊，楊 明，王 東，周翼虎，趙智宏，邰麗華

（1 內蒙古農業大學 農學院，內蒙古野生蔬菜種質資源與創新重點實驗室，呼和浩特010019；2 內蒙古師范大學 生命科學與技術學院，呼和浩特010022）

山藥（Dioscorea opposita Thunb．）是百合目（Liliales）薯 蕷 科（Dioscoreaceae）薯 蕷 屬（Dioscorea）植物，為一年或多年生纏繞性藤本植物［1－3］。山藥能形成肥大的地下塊莖，其肉質細膩，風味鮮美，可供人們食用，同時山藥還是重要的中藥成分之一，具有增強人體免疫能力、延緩衰老、抑制腫瘤、抗氧化活性等作用［4］。但是由于山藥在悠長的歷史中各地區相互引種交流，造成市場上山藥出現品種混雜、同名異物和同物異名的現象，嚴重制約了山藥產業的發展。因此，收集優質高產的山藥種質資源，并快速、準確地篩選優質種質，培育高產優質、高抗的新品種或為解決問題的關鍵。

植物遺傳多樣性資源是生物遺傳的基礎。近年來隨著遺傳資源的急劇增加，種質資源的保存利用成為急需解決的問題。Frankel［5－6］和Brown［7］提出以最小的資源份數最大限度地代表該物種的遺傳多樣性，即核心種質的概念，在一定程度上解決了這一問題。近年來國內外關于核心種質的研究較多，但多是基于表型性狀。表型性狀包括植物的農藝性狀和有效成分含量等，而這些性狀多為數量性狀，易受環境條件及栽培措施的影響。因此，完全按照其作為核心種質構建的方法是不夠準確的。分子標記的方法與表型數據相比，不受環境、采樣部位的影響，并且穩定性相對較高，能從根本上反映植物群體以及個體之間的關系［8］。近年來采用分子標記技術研究植物種質遺傳多樣性并構建核心種質在很多農作物以及經濟作物中得到了廣泛的應用，邱麗娟等［9］、白成科 等［10］、周 延 清 等［11］、吳 慧 芳 等［12］和 李 慧 峰等［13］分別對大豆、山茱萸、地黃、天麻和甘薯的研究都得到了可靠的結果。本實驗運用ISSR 分子標記技術對來自中國不同產地的35份山藥種質資源進行遺傳多樣性分析，并利用聚類分析結果采用最小遺傳距離逐步抽樣法（LDSS）構建山藥的初級核心種質庫，為今后進一步構建山藥核心種質奠定基礎，為山藥種質資源的保護利用提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 材 料

供試35份材料（表1）種植于內蒙古農業大學科技園區山藥種質資源圃。參考錢韋等［14］的取樣方法，于2013年8月采集了種質資源圃生長旺盛期的山藥幼嫩葉片，將采集的葉片放入有標記的塑封袋中，立即放入冰盒，帶回實驗室置于－80 ℃冰箱中冷凍備用。

1．2 PCR 反應

采用試劑盒（天根生化有限公司）提取35份材料的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光 光 度 計 檢 測DNA 純 度 和 濃 度（ng／μL），將OD260／OD280在1．7～1．9 之間的DNA 稀釋，－20℃保存備用。

參考 周 延 清 等［15］、胡 建 斌 等［16］、黃 玉 仙［17］的ISSR 引物，選用了32 條引物以山藥基因組DNA為模板進行PCR 反應。篩選出電泳條帶清晰、多態性高、重復性好的12條引物（表2），分別對35份樣品基因組DNA 進行PCR 擴增。PCR 反應體系為25μL［18］：模 板DNA 5 μL（約50 ng／μL），1．0 μmol／L 引物2μL，2×Taq PCR Mix（0．1 U／μL Taq Polymerase、500 μmol／L dNTP each、20 mmol／L Tris－HCl pH 8．3、100 mmol／L KCl、3 mmol／L MgCl2）12．5μL，ddH2O 5．5μL。PCR 擴增程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，53℃退火45s，72 ℃延伸90s，45個循環，最后72 ℃延伸10min，4 ℃保存以備電泳，擴增產物用1．5%瓊脂糖凝膠于90 V 電壓下電泳90 min 后，用GAS700IB凝膠成像系統拍照分析。

1．3 數據分析

利用0、1矩陣的統計方式構建ISSR 數據庫。采用POPGENE 32軟件分析擴增產物的多態位點數、多態位點比率、Shannon信息指數（I）等遺傳多樣性指數。采用NTsys2．10e［19］聚類分析軟件UPGMA 法進行聚類分析，構建聚類圖。

1．4 初級核心種質庫構建及其評價

用NTsys2．10e軟件對種質資源聚類分析后，在聚類圖中依據不同的遺傳相似系數進行最小距離逐步抽樣法（LDSS）構建核心種質［20］。具體方法為：通過觀察35份山藥種質的UPGMA 聚類圖，將遺傳相似系數較大的種質組合隨機刪除1份，再將剩余的種質再次聚類分析；再次刪除遺傳相似系數較大的成對種質中的1份種質。以此類推，直到篩選出能夠達到要求的核心種質。第1次抽樣時，選出一定份數種質，運用NTsys2．10e軟件對其進行聚類分析；第2次抽樣在第1次抽樣聚類分析的基礎上進行，以此類推。每次抽樣后，均采用POPGENE32軟件分別對構建的核心種質的ISSR－PCR擴增數據進行核心種質的遺傳多樣性分析，進而評價初級核心種質的代表性。

表1 供試山藥材料及來源Table 1 Accessions of yam and source of germplasm

2 結果與分析

2．1 ISSR 標記的多態性分析

從32條ISSR 引物中共篩選出12 條多態性好、條帶清晰的引物，分別對35 份山藥材料進行PCR 擴增，均得到條帶清晰、多態性高、重復性好的圖片，圖1為其中的引物ISSR－4對35份山藥材料進行PCR 擴增的電泳圖。由圖1可以看出每個樣品體系中均得到了清晰、豐富的條帶，可進行下一步的多樣性分析。

12條引物（表2）對35份山藥材料共擴增出142個位點，每條引物最多能得到14條清晰條帶（ISSR－10、ISSR－11），最少有9條（ISSR－4、ISSR－20）。除ISSR－2、3、4、25外，每條引物擴增出的多態性條帶比率均達100%。在這142條帶中，有138條重復性好、清晰的多態性條帶，多態性條帶比率高達97．18%，表明本研究所收集的山藥種質資源在分子水平上具有豐富多態性，種質具有很好的代表性。

圖1 引物ISSR－4對35個山藥材料的PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜M．DL2000；1～35．編號同表1；下同Fig．1 Agarose gel electrophoresis of PCR products from primer ISSR－4in 35yam accessions M．DL2000；1－35．Same as Table 1and as below

表2 供試ISSR 引物及其PCR 擴增的多態性Table 2 ISSR primers and polymorphism of PCR amplification

表3 最小距離逐步抽樣法構建山藥核心種質的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity index of core collection of yam by LDSS

2．2 山藥種質資源遺傳多樣性分析

由POPGENE32軟件分析結果（表3）可知，35個樣品的擴增條帶平均Shannon’s信息指數（I）為0．423 0，平均Nei’s基因多樣性指數（h）為0．269 4，等位基因數目（Na）為1．971 8，每個位點平均有效等位基因數（Ne）為1．427 1。35份山藥材料的遺傳一致性為0．464 8～0．971 8 之間，遺傳距離在0．028 6～0．693 1之間，其中河南鐵棍山藥－4（5號）與廣東大薯（35 號）之間的遺傳距離最大（0．693 1），而山西侯馬山藥（7號）與遼寧沈陽山藥（8號）之間的遺傳一致性最高（0．971 8）。

2．3 聚類分析

采用NTsys2．10e軟件對35 份山藥種質材料進行聚類分析（圖2）。由圖2可以看出，種質間的遺傳相似系數介于0．54～0．97之間，在遺傳相似系數Gs＝0．628時，35份山藥種質聚為兩大類，為廣東淮山藥（30號）、海南山藥（34號）與廣東大薯（35號）聚為一類，其它種質聚為一大類。在遺傳相似系數Gs＝0．66處，35份山藥種質被聚為四大類，其中廣東淮山藥（30號）單獨聚為一類。河北安國一點紅（10號）與河南菜山藥（15號）聚為一類；海南山藥（34號）與廣東大薯（35號）聚為一類，其它種質聚為一大類，其中河南惠樓小紅皮（9號）、內蒙古羅家營山藥（29號）和內蒙古畢克齊長山藥（24號）較為特殊在這一大類中分別單獨聚類。

圖2 35份山藥種質資源的UPGMA 聚類圖Fig．2 Dendrogram of 35yam accessions based on UPGMA

圖3 抽樣4構建山藥核心種質庫的ISSR 分子標記聚類圖1、9、12、15、16、18、24、29、30、31、34．初級核心種質庫的11個山藥樣品Fig．3 Dendrogram of core collection of yam No．4sampling by ISSR based on UPGMA 1，9，12，15，16，18，24，29，30，31and 34are 11samples of primary core collection of yam

2．4 山藥核心種質庫的構建及數據分析

對35份山藥種質的聚類結果進行最小距離逐步抽樣法（LDSS）構建核心種質。共抽樣6次，每次抽樣構建山藥核心種質的遺傳多樣性如表3。

由表3可以看出，隨著抽樣種質數目的減少，遺傳多樣性參數總體上變化較小。有效等位基因數目變化較小，且抽樣4的有效等位基因數目最接近抽樣前的值。Nei’s基因多樣性指數（h）和Shannon’s信息指數（I）均有略增，而分別在抽樣5和抽樣4中達到最高值。多態性位點百分率呈現下降趨勢，在抽樣5、6（尤其是抽樣6）下降較明顯。抽樣4所構建的種質庫的抽樣數是抽樣前的31%。綜合上述分析，取抽樣4為初級核心種質（圖3）。

3 討 論

山藥在中國已有2 500多年的栽培歷史，許多地區都有栽培，且地區與地區之間相互引種交流較頻繁，再加上山藥易受周圍環境影響，導致部分物種外部形態特征相近、變異范圍重疊及珠芽、花、果實、種子等器官很難在同一栽培地區全部形成，因此很難從形態學上鑒定相關物種是否為相同種或類群［17］。

本實驗通過12 條ISSR 引物，對所收集的35份山藥材料進行PCR 擴增，共擴增出142條清晰的條帶，多態性位點比率為97．18%，表明山藥種質資源在分子水平上具有豐富的多態性。周延清等［15］用7條ISSR 引物對28份山藥品種擴增出的多態性條帶比率為83．01%，Shannon’s指數為0．319 1；雷伏貴等［21］采用24 條引物對94份山藥材料共擴增出356條ISSR 譜帶，其多態性比率為96．6%；華樹妹等［22］對34份山藥資源進行RAPD 分析，24條引物共擴增出182條譜帶，其多態性比例為88．5%。用不同方法對不同山藥材料的研究均表明了山藥DNA 分子水平上的高度多態性。

本實驗35 份山藥材料的有效等位基因數（1．427 1）、Nei’s 基 因 多 樣 性 指 數（0．269 4）和Shannon’s指數（0．423 0）均表明了35份山藥材料具有豐富的遺傳多樣性。35份山藥材料的遺傳距離也表明樣品間存在遺傳差異，如河南鐵棍山藥－4（5號）與廣東大薯（35號）在DNA 分子水平存在很大的差異，而山西侯馬山藥（7號）與遼寧沈陽菜山藥（8號）之間親緣關系較近。楊明［18］研究表明，形態上河南鐵棍山藥－4葉片呈淺裂三角形，塊莖龍頭細長且表皮呈淡黃色；廣東大薯葉片呈箭形，塊莖無龍頭且表皮呈棕紅色，它們之間差異很大。而山西侯馬山藥在地上部和地下部與遼寧沈陽菜山藥之間都較相近，本實驗結果與形態分類基本相符。

本實驗聚類分析中將35份山藥種質分為兩大類，根據形態特征等來區分，其中廣東淮山藥（30號）、海南山藥（34號）與廣東大薯（35號）可歸為田薯，其它山藥種質可歸為普通山藥。周延清等［15］用ISSR 聚類將28 個山藥品種劃分為4 組；雷伏貴等［21］也用聚類分析將94份山藥資源分為薯蕷群、參薯群、山薯群、褐苞薯蕷群等4類群，并證明在分子水平上山藥是以類群為單位進行分類的。華樹妹等［22］通過RAPD 技術將34份資源分為普通山藥、田薯、扁山藥和福建大薯4類，且當遺傳相似系數為0．68時，可將普通山藥分為長山藥和棒山藥2個亞類。與上述研究結果相比，本實驗所分類群相對簡單，這可能與本實驗材料引種區域的局限性有關，但本實驗結果與上述研究結果還是相近的。廣東淮山藥（30號）在所在類群中單獨聚為一類，說明這一份種質的基因組與其所攜帶的遺傳信息與其它種質之間的差異較大，并與它們之間的親緣關系較遠。遼寧沈陽菜山藥（8號）與山東鄒平山藥（17號）雖然是在地理距離上相距較遠，生態環境不同，卻在分子水平上聚為同一類，遺傳距離僅為0．050 6，表明這2個來自不同地區的種質資源之間在分子水平上親緣關系較近，推測可能是由于山藥在不同地區之間引種所引起的。山西侯馬山藥（7號）、山西張紹山藥（14號）、河北保定山藥（22號）、山東嘉祥細毛山藥（31號）這4個山藥品種聚為一類，這與陳占勇等［23］對10份山藥材料進行花粉形態聚類結果基本一致。

本實驗所選的7份河南鐵棍山藥資源聚在一個亞群，其中河南鐵棍－1（4 號）、河南鐵棍－5（28 號）、河南鐵棍－6（2號）、河南鐵棍－7（27號）這4 份河南鐵棍山藥聚在一起，且它們之間遺傳距離0．210 9～0．028 6也印證了這一點。河南鐵棍－4（5 號）與河南溫縣鐵棍山藥－2（25 號）之間的遺傳距離較小為0．127 5，說明兩者之間親緣關系較近。而河南鐵棍－3（13號）與其它河南鐵棍山藥之間的遺傳距離均達到了0．3以上，且與河南鐵棍－5（28號）之間遺傳距離達到0．501 5。這些河南鐵棍山藥雖來自于河南省，但由于長期以來各地區相互引種，可能造成品種混雜現象，這也證實了當地一些種植戶的說法。有關進一步的解釋有待今后深入研究。

核心種質的概念是由Frankel在1984 年提出來的，發展至今已有近30年了，核心種質的研究在這30年中已經取得了很大的進展，目前已有很多人開始利用分子標記技術對核心種質庫中的種質代表性和遺傳多樣性進行評價，并且這種方法已成為一種有效和應用廣泛的方法［24－25］。

徐海明等［26－27］研究表明，完全隨機取樣法和分層聚類取樣法是構建核心種質的兩種重要的取樣方法。多數研究者采用后者或把二者結合起來的方法，以保證核心種質的代表性。關于總體取樣比例，Brown指出大多數植物資源核心種質取樣比例為5%～10%［7］，也有學者認為遺傳冗余度在0．2～0．9之間時取樣比例在20%～30%才合適［28］。李自超等［29］認為各物種適宜的核心種質規模不應簡單化而定，對應具體的物種，應按照該物種的遺傳多樣性來定。本實驗對35份山藥種質資源進行最小距離逐步抽樣法構建核心種質，并對各抽樣進行遺傳多樣性分析，結果表明隨著抽取種質數目的減少，各種質庫遺傳多樣性參數變化較小，但多態性位點百分率呈現下降趨勢。綜合上述分析，確定抽樣4為初級核心種質。抽樣4構建的種質庫的抽樣數是抽樣前的31%，Nei’s基因多樣性指數和Shannon’s信息指數分別為0．328 0和0．495 5，而且多態位點比率和等位基因數均達到抽樣前的90%以上，符合核心種質資源代表初始種質資源遺傳多樣性達到70%～80%的要求［30］，表明抽樣4所構建的種質庫具有較高的代表性。從抽樣4的聚類結果中看，其中的山西北洋山藥（1號）、河南惠樓小紅皮（9號）、河南菜山藥（15 號）、山東濟南溫縣鐵棒山藥（16號）、內蒙古畢克齊長山藥（24號）、內蒙古羅家營山藥（29號）、廣東淮山藥（30號）種質分別單獨聚類，為較特殊種質，可以在今后的種質資源保存、評價及核心種質庫構建的過程中作為重要種質。

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