中華水韭孢子囊發育研究

李 婧，連永權，李 范，劉保東＊

（1 哈爾濱師范大學 黑龍江省普通高等學校植物生物學重點實驗室，哈爾濱150025；2 黑龍江職業學院，哈爾濱150111）

水韭科（Isoetaceae）是古老的孑遺擬蕨類水生植物，全球零散分布約250種，多為珍稀瀕危保護物種［1］，中國僅5種水韭，且均為特產種［2］。由于生存環境不斷惡化，野生數量減少，全科均被列為國家一級保護物種［3］。中華水韭（Isoetes sinensis）曾是長江中下游濕地常見蕨類，對自然環境變化較為敏感［4］，隨著近幾十年該地區經濟活動的快速發展，數量急劇下降，已列為國家極危級（CR）保護物種［5］。He通過細胞學研究指出減數分裂過程中染色體的行為變化可能是有性生殖的限制因素，但不是種群數量下降的主要原因；陳進明等［7］就中華水韭的遺傳多樣性進行分析，認為遺傳結構是限制種群發展的主要成因之一；中華水韭對溫度這一古老因素具有抗性［8］，對現代常用除草劑的抗性較低［9］；邢建嬌等［10］通過人工繁殖和栽培指出培養基質是其瀕危的重要原因；李范［11］提出中華水韭在發育幼期是有緣膜存在的，隨著植株生長而逐漸消失。迄今為止，尚未有中華水韭孢子囊發育過程以及發育特征與瀕危關系等方面的相關報道。

孢子囊作為蕨類植物無性生殖的唯一場所，蘊涵著大量保守而穩定的系統學信息［12］，分子生物學也認為孢子囊是蕨類植物重要的溯祖形態［13］。真蕨亞門的經典分類包括厚囊蕨綱、薄囊蕨綱和原始薄囊蕨綱，孢子囊是分綱的主要依據；不少目或科的分類也主要依據孢子囊的特征，如著生方式、環帶的有無、開裂方式等［14］。就卷柏屬（Selaginella）而言，孢子囊也有重要的系統學和生殖生物學參考價值，劉保東等在研究24種卷柏的孢子囊排布規律后指出，大小孢子囊的著生位置和數量既能反映出物種間的親緣關系，又與有性生殖能力有關［15］。

水韭科（Isoetaceae）與卷柏科（Selaginellaceae）同屬石松亞門（Lycophytina）。兩者大孢子囊和小孢子囊分別著生在不同葉片的基部［13］，水韭偶爾還會出現混生型孢子囊［16］，葉舌的結構也遠比卷柏類復雜［11］，孢子囊的發育特征應具有較高的系統學研究價值［17］；國產水韭中，中華水韭瀕危程度最高，盡管瀕危原因尚不明確，但孢子囊的發育直接決定著孢子的數量和質量［18］，是中華水韭無性生殖的關鍵環節。本實驗用半薄切片法，連續觀察了中華水韭大小孢子囊的發育過程，從無性生殖的角度為探討其瀕危原因提供直觀可靠的理論證據，也為研究水韭類的親緣關系提供保守而穩定的溯祖形態。

1 材料和方法

實驗材料中華水韭（Isoetes sinensis）原產浙江省華頂山，由浙江大學丁炳揚教授采集并贈送活體植株，經劉保東［19］人工繁殖并栽培在哈爾濱師范大學蕨類培養室（126°42′E，45°24′N）。取個體發育不同階段的人工繁殖栽培苗，在解剖鏡下檢查孢子囊的發育情況以及與葉片的關系。切取不同發育程度的孢子囊，用FAA 固定并經過常規半薄切片，在Olympus BH－2型光學顯微鏡下觀察并拍照。

將成熟且完好的小孢子囊，放在10 mL 量筒內，滴加約5 mL 蒸餾水后，在水中將小孢子囊挑破，取出孢子囊碎片，定容至10 mL 并搖動成均勻懸濁液，吸取1mL懸濁液再稀釋至10mL，以此連續稀釋數次后，用移液器吸取0．01mL 滴加在載玻片上，置顯微鏡記錄全部小孢子的數量后，換算出小孢子囊中小孢子的總數。將成熟且完好的大孢子囊直接置于載玻片的一滴蒸餾水中，挑破孢子囊壁，直接記錄大孢子的數量。大小孢子囊的孢子產量均取隨機檢測10個數值的平均值。

2 觀察結果

2．1 大小孢子囊的發育節律及其孢子產量

中華水韭在個體發育初期的1～20枚葉片上，均無孢子囊著生，約20枚葉片后，每枚葉片的基部近軸面均著生1個孢子囊，每個孢子囊內只發育出大孢子或小孢子，大小孢子異囊異葉，大小孢子葉相間排列（圖版Ⅰ，1）。在人工培養條件下，孢子囊隨孢子葉持續發生，不受自然條件的季節限制，在相應的葉片伸長生長過程中完成減數分裂，并未發現同時發育有大小孢子的混生孢子囊。

中華水韭的兩種孢子囊在形態大小上都基本相同（圖版Ⅰ，2），小孢子囊幼嫩時為淺黃色，成熟后暗灰色（圖版Ⅰ，3），小孢子的平均產量是5．36×105個；大孢子囊幼嫩時為淺黃綠色（圖版Ⅰ，4），成熟后灰色（圖版Ⅰ，3），大孢子的平均產量是408個。

2．2 大小孢子囊的早期分化

當中華水韭的個體從合子發育到約20枚葉片的幼植物體時，以后分化的每個葉片，其基部都發育出一個孢子囊，孢子囊的分化稍遲于葉原基的分化。當每個葉原基的高度發育到2mm 左右時，孢子囊幾乎與葉片的維管束同步分化，孢子囊位于維管束的近軸面（圖版Ⅰ，5），稍呈截球形隆起，孢子囊的分裂能力較為旺盛，著色略深于葉片組織，此時的大小孢子囊在形態結構上都很簡單，沒有明顯的差別。當葉片發育至1cm 長短時，孢子囊隨著葉片的伸長也向上下延長，呈橢球形與葉片組織緊密相連，且向外明顯突起，但內部的細胞還沒有明顯的分化（圖版Ⅰ，6）。其后孢子囊的突起速度顯著慢于上下延長的速度，而且孢子囊隆起部分向周圍擴展，孢子囊與葉片相連的面積顯著小于其表面積（圖版Ⅰ，7）。當葉片長度達到3cm 以上后，孢子囊在快速隆起的同時，內部細胞也發生著明顯的分化，橫隔絲原始細胞及孢子母細胞的細胞質濃度不斷加深（圖版Ⅰ，8），但大小孢子囊的區別仍不明顯。

2．3 小孢子囊的發育

當葉片長度達到10cm 以上時，孢子囊內染色較深的區域進一步加深，大小孢子囊的特征逐漸顯現，首先會出現十多條橫隔絲及小孢子分生組織（圖版Ⅰ，9），最初的橫隔絲較寬、著色較深，細胞排列密集，其后，一些橫隔絲出現島嶼化溶解（圖版Ⅰ，10），小孢子母細胞的減數分裂幾乎是同步進行，半數以上的小孢子囊敗育，所以產生的小孢子顏色較淺，胞質透明（圖版Ⅰ，11），近半數的小孢子囊內雖然產生了不少顏色較深、胞質濃密的小孢子，但隔絲較粗壯（圖版Ⅰ，12）。在正常發育的小孢子囊內，小孢子母細胞分裂旺盛，能迅速發育成四分體，而且遠軸側的孢子囊壁較厚且不規則（圖版Ⅰ，13），近軸側的孢子囊壁與葉片維管束融為一體（圖版Ⅰ，14）。四分體密集，細胞核較大，著色較深（圖版Ⅰ，15），當葉片長度達到20cm 以上且不再伸長后，小孢子囊內四分體的中壁和外壁（周壁）才不斷形成（圖版Ⅰ，16）。小孢子囊無柄，也無明顯的開裂結構。

2．4 大孢子囊的發育

在葉片長度達到10cm 以上時，大孢子囊內先出現少數橫隔絲（圖版Ⅰ，17）。大孢子母細胞為不整齊發育，即一些大孢子四分體已經形成，一些大孢子母細胞還在減數分裂之中（圖版Ⅰ，18）。四分體各具有1個細胞核，胞質染色較深（圖版Ⅰ，19）。有近半數的大孢子囊敗育，整個孢子囊內除少數分化不完全的隔絲外，其余區域均近乎透明（圖版Ⅰ，20）。在近半數正常發育的大孢子囊內，多數大孢子的四分體呈圓形（圖版Ⅰ，21），隨著大孢子的發育，內含物不斷充實，三層孢子壁分化明顯（圖版Ⅰ，22）。也有少數大孢子囊外觀上與正常發育的基本相似（圖版Ⅰ，23），但其內部的大孢子多數敗育，即孢子壁內陷，內含物較少（圖版Ⅰ，24）。大孢子囊的減數分裂發生在葉片伸長生長過程中，當葉片停止生長后，孢子壁才逐漸分化，敗育的大孢子囊要么萎縮干癟，要么基本類似于正常大孢子囊。大孢子囊無柄，也無明顯的開裂結構，從切片上觀察，在可育的大孢子囊中，隔絲較粗，所占體積比例要明顯大于小孢子囊。

3 討 論

孢子囊既是現代蕨類植物學重要的分類原則之一，也是蕨類植物進行無性生殖的唯一場所［12］，孢子囊的孢子產量一直是蕨類植物生殖方式的重要參考依據 。葉創興等 提出，水韭大、小孢子囊內孢子的個數相差1 000倍，劉星［22］的統計顯示中華水韭大小孢子的直徑基本相差10倍，我們觀察到中華水韭兩種孢子囊的體積基本相等，這些似乎都支持葉創興的觀點。然而事實上，隔絲在可育大孢子囊內所占的體積較大，在小孢子囊內則相反，因此，小孢子的數量一定大于大孢子1 000倍，這一結論得到了本研究統計結果的支持。

幼期的小孢子囊有較粗的隔絲，以保證造孢組織的有絲分裂［17］。但小孢子囊內的十多萬個小孢子母細胞同時進行減數分裂，此時若環境稍有改變，就很容易破壞小孢子的營養供給從而造成敗育。中華水韭的孢子囊都是在葉片伸展時期即產地的初春季節進行減數分裂，而該季節寒潮和干旱多發［23］。筆者認為，環境因素引起的小孢子囊敗育應該是導致中華水韭瀕危的一個重要原因。盡管大孢子母細胞的不整齊發育避開了偶然環境因素所導致的敗育環節，但近半數的隔絲一開始就發育不良，從根本上限制了大孢子母細胞的減數分裂，其必然性敗育的致危程度要大于小孢子囊的偶然性敗育。

筆者認為多數植物學教科書［17］關于水韭屬植物最外圍是不育葉，向內依次為大孢子葉和小孢子葉以及尚未分化的幼葉，這一描述存在不妥。據筆者觀察，中華水韭為多年生草本植物，既然存在大小孢子葉，“最外輪的葉片”也一定是可育葉，因為幼孢苗時期的前幾十枚葉片很早就已脫落［10］。外輪葉片不斷隨其孢子囊的過熟而不斷脫落，內部的孢子葉則逐漸由內輪變成外輪，“外輪是大孢子葉”的結論只能是特殊時期的靜態描述。從生殖生態學的角度看，如果外一輪多枚葉片都具有相同的大孢子囊，那么這些大孢子囊間必然存在分化時間和成熟程度的不同，而導致內一輪葉片的小孢子囊遠不能及時分化和成熟，以致產生嚴重的雌雄不遇后果，進而影響到有性生殖。觀察得出，中華水韭的大小孢子葉不存在外輪內輪的單一孢子囊現象，大小孢子葉基本是隨機的相間排列。盡管單個小孢子囊同時成熟，單個大孢子囊不同時成熟，而每株中華水韭在一個生長季可以成熟多枚大小孢子囊，因此，中華水韭不存在生殖演化上的缺陷，只是小孢子囊對環境的依賴性較強，且大孢子囊的敗育比例過高。

水韭的近緣植物石松屬（Lycopodium）和卷柏屬（Selaginella），多為旱生，孢子能借風力進行遠距離傳播，孢子囊都有固定的開裂結構和方式［18］；卷柏屬的孢子囊還能通過基部細胞失水收縮而幫助孢子釋放 ，多數卷柏的大孢子囊都位于孢子葉穗的基部，易于被動受精［15］，具有較高的繁殖能力。然而，水韭屬的大小孢子囊都不存在開裂結構，也沒有固定的開裂方式，始終生長在泥水里，只能通過孢子葉基部破裂或腐爛而釋放孢子［17］，這也應該是導致中華水韭瀕危的原因之一。

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圖版Ⅰ 中華水韭大小孢子囊（b．大孢子囊；s．小孢子囊；Sp．孢子囊；Va．維管束）1．大孢子囊與小孢子囊在莖端的排布；2．成熟的孢子囊；3．發育良好的大孢子囊與小孢子囊；4．幼小的大孢子囊；5．孢子囊與葉原基的維管束；6．孢子囊向外隆起；7．孢子囊向上下延展；8．孢子囊內部開始分化；9．小孢子囊的橫隔絲及分生組織；10．橫隔絲島嶼化溶解；11．敗育的小孢子囊；12．具粗壯隔絲的小孢子囊；13．正常發育的小孢子囊及其遠軸側囊壁；14．正常發育的小孢子囊及其近軸側囊壁；15．小孢子囊內的四分體；16．成熟中的小孢子；17．正常發育的大孢子囊；18．四分體形成中；19．大孢子四分體及造孢組織；20．敗育初期的大孢子囊；21．可育的大孢子囊；22．正在成熟的大孢子；23．部分敗育的大孢子囊；24．敗育的大孢子囊。PlateⅠ Sporangium of I．sinensis（b．Macrosporangium；s．Microsporangium；Sp．Sporangium；Va．Leaf primordium）Fig．1．Distribution of macrosporangium and microsporangium on the stem end；Fig．2．Mature sporangium；Fig．3．Well developed macrosporangium and microsporangium；Fig．4．Young macrosporangium；Fig．5．Sporangium and vascular bundle of leaf primordium；Fig．6．Sporangium hunch out；Fig．7．Sporangium is expanding；Fig．8．Internal structure differentiation in sporangium；Fig．9．Trabecula and meristem of microsporangium；Fig．10．Trabecula is dissolving；Fig．11．Abortive microsporangium；Fig．12．Microsporangium with thick trabecula；Fig．13．Normal developed microsporangium and its abaxial wall；Fig．14．Normal developed microsporangium and its adaxial wall；Fig．15．Tetrad in microsporangium；Fig．16．Mature microsporangium；Fig．17．Normal developed megasporangium；Fig．18．Tetrad forming；Fig．19．Tetrad of macrospore and sporogenous tissue；Fig．20．Megasporangium in early abortion；Fig．21．Fertile megasporangium；Fig．22．Developing megaspore；Fig．23．Partly abortive megasporangium；Fig．24．Abortive megasporangium．