利用低氧/厭氧工作站建立H9c2細胞缺氧復氧模型的探討

儲倩雯，李偉秋，魯詩史，黃丹梅，張艷美Δ

(1.汕頭大學醫學院 藥理教研室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院 分析細胞實驗室，廣東 汕頭 515041；3. 汕頭大學醫學院第一附屬醫院 藥劑科，廣東 汕頭 515041)

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利用低氧/厭氧工作站建立H9c2細胞缺氧復氧模型的探討

儲倩雯1，李偉秋2，魯詩史3，黃丹梅1，張艷美1Δ

(1.汕頭大學醫學院 藥理教研室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院 分析細胞實驗室，廣東 汕頭 515041；3. 汕頭大學醫學院第一附屬醫院 藥劑科，廣東 汕頭 515041)

目的 利用低氧/厭氧工作站，結合不同的缺氧條件，探討建立H9c2細胞缺氧復氧(hypoxia/reoxygenation， H/R)模型的最佳方法。方法 缺氧時將H9c2細胞置于低氧/厭氧工作站中，分別以完全培養基，無糖培養基和酸性缺氧液培養1、2、4、6、8 h，缺氧后換用完全培養基于培養箱中按常規條件培養1 h。流式細胞儀測定細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測細胞生存率，倒置顯微鏡下觀察H9c2細胞形態變化。結果 與對照組比較，缺氧時以完全培養基和無糖培養基處理的H9c2細胞H/R后，細胞內ROS含量和細胞存活率隨缺氧時間延長無明顯改變，且倒置顯微鏡下未觀察到明顯的形態變化。缺氧時以酸性缺氧液處理的H9c2細胞，隨H/R時程的延長，細胞內ROS含量不斷增加(P<0.01)，且細胞存活率逐漸降低(P<0.01)，倒置顯微鏡下觀察到細胞H:1 h/R:1 h后開始出現部分細胞皺縮，少量壞死細胞漂浮，隨時間延長損傷加重；缺氧8 h后，細胞皺縮成圓形，大量壞死細胞漂浮，復氧1 h后可見細胞膜表面不平滑，復氧液中仍有少量壞死細胞漂浮。結論 采用低氧/厭氧工作站，并結合酸性缺氧液，可成功建立重現性非常好的H9c2細胞H/R模型。

低氧/厭氧工作站；H9c2細胞；缺氧復氧模型

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)損傷是心臟缺血性疾病和心臟外科手術后常見的一種病理生理現象。體外心肌細胞缺氧復氧(hypoxia/reoxygenation， H/R)模型一直被廣泛應用于心臟I/R損傷的研究，對于探討I/R損傷的分子機制具有重要的意義。但國內外建立的H/R細胞模型沒有統一的標準，目前常用的方法主要有：混合氣體培養法、模擬缺氧/再灌注液培養法、氮氣飽和培養基法、液體石蠟覆蓋法等單純物理性模型[1]。而化學模型建立方法主要是利用氧清除劑二亞硫酸鈉和氯化鈷[2-3]。這些方法都存在一些缺點，如操作復雜，無法準確地控制缺氧過程的氧分壓，缺氧條件的重復性差等。探尋一個穩定，可靠，便于操作的H/R損傷的細胞模型，將為研究心臟I/R損傷提供一個可靠的平臺。來源于大鼠胚胎期心室的H9c2細胞株被用于本實驗中，該細胞株保持著心肌細胞的多種特性，被廣泛應用于心臟疾病的體外研究中。本研究利用新購置的低氧/厭氧工作站，結合不同的缺氧培養條件，以心肌I/R最重要的病理生理改變之一—活性氧(reactive oxygen species，ROS)[4]作為評判模型成功與否的標準，探討建立H9c2細胞H/R模型的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 H9c2細胞 (ATCC公司，美國)、胎牛血清(Biowest公司，法國)、DMEM培養基(Gibco公司，美國)，2′，7′-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma公司，美國)，噻唑藍(MTT)(Amersco公司，美國)。其余試劑均為國產分析純。低氧/厭氧工作站Invivo2 400(Ruskinn公司，英國)，CO2培養箱(Sanyo公司，日本)，倒置相差顯微鏡(Nilkon公司，日本)，Accuri C6流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)，全波長酶標儀(Molecular Devices公司，美國)，低溫高速離心機(Heraeus公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 H9c2細胞培養：將H9c2細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養基的培養皿中(同時含有100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中培養，1～2天換液。當細胞長至80%～90%時消化傳代。

1.2.2 實驗分組及H/R模型建立：將H9c2細胞隨機分為對照組、完全培養基處理H/R模型組、無糖培養基處理H/R模型組以及酸性缺氧液處理H/R模型組，除對照組外，各不同缺氧液處理的H/R模型組分別設定5個H/R時程(H:1 h/R:1 h，H:2 h/R:1 h，H:4 h/R:1 h，H:6 h/R:1 h，H:8 h/R:1 h)。

缺氧時各H/R組分別換用完全培養基、無糖培養基和酸性缺氧液，置于低氧/厭氧工作站中(1%O2，5%CO2，94%N2，37 ℃)，缺氧結束后均換用完全培養基置于培養箱中復氧培養1 h。對照組則于復氧前換用完全培養基培養1 h。實驗過程中使用的酸性缺氧液配方為NaCl：8.0064 g，KCl：0.8946 g，MgCl2：0.0467 g，CaCl2：0.0999 g，HEPES：0.953 g，Na lactate：3.735 mL，加水至1000 mL，調節pH至6.2[5]。在超凈臺內用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率：將H9c2細胞按1×104個/孔的密度接種于96板中，8孔/組，取平均值作為一次實驗結果。培養24 h后，按上述實驗分組及模型建立方法處理細胞。待復氧結束后，吸干培養基，每孔加入200 μL含10%MTT(5 mg/mL)的無血清DMEM培養基，置于37 ℃，5%CO2的培養箱中避光孵育4 h。吸干培養基，每孔加入200 μL的DMSO，震搖15 min，使結晶充分溶解，酶標儀于490 nm波長處檢測各組吸光度值。實驗重復4次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞內ROS濃度：將H9c2細胞接種于6 cm培養皿中，待細胞長至70%～80%時，按上述實驗分組及模型建立方法處理細胞。復氧結束后，倒掉培養基，用PBS洗2次，每皿加0.125%胰酶消化1 min，棄胰酶，各加1 mL含血清DMEM中止消化，收集細胞于1.5 mL 離心管中；離心，棄上清，用無血清DMEM清洗一次，各加入1 mL含10 μM DCFH-DA熒光探針的無血清DMEM培養基。于培養箱中(37 ℃，5%CO2)避光孵育30 min，每5 min上下顛倒震蕩一次。用PBS清洗3次，每管加入500 μL PBS重懸。于488 nm激發波長，525 nm發射波長條件下，用流式細胞儀檢測各組熒光強度。計數10000個細胞，以其平均熒光強度(mean flourscence indensity，MFI)反映各組細胞內ROS水平。實驗重復4次。

1.2.5 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態變化：待細胞長至70%～80%時，按上述實驗分組及模型建立方法處理細胞。分別在缺氧和復氧結束后，倒置顯微鏡下觀測細胞形態變化，分別記錄對照組，完全培養基、無糖培養基以及酸性缺氧液處理下的細胞 H:8 h/R:1 h組的形態變化。

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞存活率 以對照組細胞存活率為100%，完全培養基和無糖培養基處理的各時程H/R組細胞存活率差異無統計學意義。酸性缺氧液處理的H/R模型組的細胞存活率隨時間的延長逐漸下降，差異具有統計學意義(P<0.0001)。見表1。

表1 MTT法測定不同缺氧液處理的細胞的存活率變化Tab.1 The cell viability was detected by MTT assay under different hypoxic solution(±s，n=4)

*P<0.01，與對照相比，compared with control group；#P<0.05，與H:1 h/R:1 h相比，compared with H:1 h/R:1 h group；ΔP<0.05，與H:2 h/R:1 h相比，compared with H:2 h/R:1 h group

2.2 流式細胞儀測定細胞內ROS水平 各組細胞內ROS水平變化如表2所示。以對照組ROS的MFI為1，完全培養基處理的各時程H/R組細胞內ROS的MFI差異無統計學意義。以對照組ROS的MFI為1，無糖培養基處理的各時程H/R組細胞H:4 h/R:1 h 與H:1 h/R:1 h 相比，差異有統計學意義(P<0.05)，其余各組間差異無統計學意義。H:4 h/R:1 h與H:1 h/R:1 h相比，ROS水平增加約1.50倍，差異有統計學意義(P<0.05)，其余各組間差異無統計學意義。以對照組ROS的MFI為1，各酸性缺氧液處理的H/R模型組的MFI與對照組相比，隨時間延長逐漸增加，即細胞內ROS水平顯著升高(P<0.0001)，H:4/R:1 h起，細胞內ROS水平已是對照組的約2.57倍，且隨時間延長，呈遞增趨勢，H:8 h/R:1 h后細胞內ROS水平是對照組的3.31倍。說明低氧/厭氧工作站結合使用酸性缺氧液可使細胞內ROS水平顯著增加。見表2，圖2。

表2 流式細胞儀法測定不同缺氧液處理的細胞內ROS水平變化Tab. 2 The level of ROS was measured by flow cytometry under different hypoxic solution (±s，n=4)

*P<0.01，與對照相比，compared with control group；#P<0.05，與H:1 h/R:1 h相比，compared with H:1 h/R:1 h group；ΔP<0.05，與H:2 h/R:1 h相比，compared with H:2 h/R:1 h group

圖2 酸性缺氧液處理的細胞內 ROS水平變化的流式細胞儀原圖Fig.2 ROS level detected by flow cytometry under acidic hypoxic solution

2.3 倒置熒光顯微下觀察細胞形態變化 對照組細胞，呈梭形，折光率好，細胞膜表面光滑。缺氧時以完全培養基和無糖培養基處理的細胞H:8 h/R:1 h后，細胞形態未見明顯改變。以酸性缺氧液處理的細胞缺氧1 h后，部分細胞皺縮，體積變小，有少量壞死細胞漂浮，換復氧液的過程中漂浮的壞死細胞隨缺氧液一起被棄去，復氧1 h后，又見少量壞死細胞漂浮。隨著缺氧的時間延長，皺縮的細胞、漂浮的壞死細胞逐漸增多。缺氧8 h后，可見大部分細胞均皺縮成圓形，復氧1 h后可見細胞體積相對于缺氧前更小，部分壞死細胞漂浮，細胞膜表面不光滑。見圖3。

圖3 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞H/R后形態變化(×100)A：對照組，B：完全培養基處理下的細胞H:8 h/R:1 h組，C：無糖培養基處理下的細胞H:8 h/R:1 h組，D：酸性缺氧液處理下的細胞 H:8 h/R:1 h組Fig.3 The cellular morphology under inverted microscope after H/R(×100)A：control group，B：H:8 h/R:1 h group treated by complete medium，C：H:8 h/R:1 h group treated by glucose-free DMEM，D：H:8 h/R:1 h group treated by acidic hypoxic solution

3 討論

低氧/厭氧工作站是本實驗室新近購置的一臺貴重儀器，其可以精確控制氧分壓，精確度達0.1%，同時可準確控制二氧化碳濃度、溫度、濕度、pH值等參數，且操作過程簡單。在心肌I/R的體外研究中，大多使用自制缺氧盒[6]，厭氧袋[7]等，利用其構建細胞H/R模型時O2濃度，CO2濃度難以精確控制，低氧/厭氧工作站可以解決上述問題，降低裸手操作過程中造成的實驗誤差，使H/R模型更加穩定。由于低氧/厭氧工作站更廣泛應用于為厭氧菌提供厭氧氣體環境，利用該設備制作H/R模型時，是否需要配合其他實驗條件，尚不清楚。

I/R的機制目前尚未完全闡明，多數學者認為I/R發生的基礎是能量代謝障礙[8]。在構建H/R損傷模型時常常采用斷氧及斷糖兩種方式，后者包括使用無糖無血清培養基[9]、無糖Hanks液[10]，缺血緩沖液[11]等。研究表明，細胞內的糖代謝途徑很大程度上受供氧的影響，缺氧時，細胞內進行糖酵解生成乳酸，導致酸中毒。缺血后細胞外鉀離子積聚，Ferrier的研究顯示心肌梗死階段細胞外平均鉀離子濃度水平在10 mM左右[12]。本研究中的酸性缺氧液的配制綜合了以上因素，加入乳酸，調pH至6.2，提供一個酸性環境，另外，使用12 mM KCl，為細胞提供一個高鉀的環境[13]，更真實地模擬在體組織細胞I/R時的微環境。

體內的I/R并非單一的病理損傷，是多種機制參與的復合過程。本實驗選用完全培養基、無糖培養基和酸性缺氧液作為缺氧液，配合低氧/厭氧工作站，探討建立H/R模型的最佳方法。研究表明，I/R或H/R過程中會伴隨著大量自由基的產生，生成的自由基會經過多種途徑誘導細胞凋亡或壞死[14]。而作為最主要的自由基之一-ROS是目前公認的I/R損傷的一個重要的病理生理改變[15]。故本研究在確定H/R損傷模型是否構建成功時，選用ROS濃度是否激增作為評判指標之一。研究發現在不同H/R時程下，缺氧時以完全培養基處理的H9c2細胞，復氧結束后ROS水平無差別，以無糖培養基處理的H9c2細胞，在設定的缺氧時程內，ROS濃度最高僅約為對照組的1.5倍，而以酸性缺氧液處理的H9c2細胞，ROS水平隨缺氧時間的延長而不斷增加，H:8 h/R:1 h組ROS濃度為對照組的3.31倍。且細胞存活率的實驗結果顯示，以完全培養基以及無糖培養基處理的H9c2細胞，H/R后細胞存活率無明顯下降，而以酸性缺氧液處理的H9c2細胞，隨缺氧時程的延長，細胞存活率不斷下降，H:1 h/R:1 h組細胞存活率約為77%，在H:8 h/R:1 h后細胞存活率約為40%，以上結果表明低氧/厭氧工作站結合酸性缺氧液能建立重現性非常好的H9c2細胞H/R模型。

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(編校：譚玲)

Establishment of a hypoxia/reoxygenation model of H9c2 cell using hypoxia/anoxic workstation

CHU Qian-wen1, LI Wei-qiu2, LU Shi-shi3, HUANG Dan-mei1, ZHANG Yan-mei1Δ

(1.Department of Pharmacy, Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China; 2.Analytical Cytology Laboratory, Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China; 3.Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China)

ObjectiveTo investigate optimal method of establishing hypoxia/reoxygenation(H/R) model of H9c2 cell by using hypoxia/anoxic workstation under different conditions in hypoxia.MethodsH9c2 cell was placed into hypoxia/anoxic workstation and simultaneously cultured with complete medium, glucose-free DMEM and acidic hypoxic solution for 1,2,4,6 and 8 h respectively, and then reoxygenated with complete medium for 1 h in normoxic incubator. The level of ROS was measured by flow cytometry. The cell viability was detected by MTT assay. The cellular morphology was observed by inverted microscope.ResultsWith the extension of cell hypoxia time, there were no significant differences in the ROS level and cell viability in complete medium- and glucose-free DMEM-treated H/R groups compared with control group(P<0.05). There was no obvious morphologic change observed with inverted microscope, either. Nevertheless, when H9c2 cells were treated with acidic hypoxic solution in hypoxia, the ROS level continuously increased and the cell viability decreased with the extension of cell hypoxia time(P<0.01). Since H:1 h/R:1 h, some of the cells shrunk and a few necrotic cells floated in the media under the inverted microscope, and the damage was aggravated with the extension of hypoxia time. After the cells were exposed in hypoxia for 8 h, they wrinkled to be round and a large number of floating necrotic cells were observed. When the cells were reoxygenated for 1 h, the cytomembrane was not smooth and there were still a few necrotic cells floating in culture dish.ConclusionThe H9c2 cell H/R model with good repeatability can be established successfully by using hypoxia/anoxic workstation combining with acidic hypoxic solution.

hypoxia/anoxic workstation; H9c2 cell; hypoxia/reoxygenation model

國家自然科學基金項目(81473215和81072633)；廣東省自然科學基金項目(2015A030313448)；中央財政支持地方高校發展專項資金

儲倩雯，女，碩士在讀，研究方向：心血管藥理，E-mail:1521105227@qq.com；張艷美，通信作者，女，博士，教授，研究方向：心血管藥理，E-mail：ymzhang@stu.edu.cn。

R363

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1005-1678(2015)11-0011-04