回回甘松飲含藥血清對高糖誘導的腎小球系膜細胞外基質堆積的影響

南一，馬麗杰，袁玲

(1.寧夏醫科大學 中醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學 回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；5.寧夏回醫藥協同創新中心，寧夏 銀川 750004)

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回回甘松飲含藥血清對高糖誘導的腎小球系膜細胞外基質堆積的影響

南一1,2，馬麗杰1，袁玲2,3,4,5Δ

(1.寧夏醫科大學 中醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學 回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；5.寧夏回醫藥協同創新中心，寧夏 銀川 750004)

目的 探討回回甘松飲(Hui-hui Gan-song Yin，HGY)含藥血清對高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞(mesangial cells，MCs)外基質堆積的影響。方法 健康雄性SD大鼠40只隨機分為正常對照組(蒸餾水)、格列喹酮組(10 mg/kg)、HGY(5、10 g/kg)組，每組各10只，每天給藥2次，連續3 d后制備含藥血清用于體外培養大鼠MCs，分為正常對照組(10%正常對照組大鼠血清)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清)、格列喹酮組(30 mmol/L葡萄糖+10%格列喹酮組大鼠血清)、HGY高劑量組(30 mmol/L葡萄糖+10%HCY高劑量組大鼠血清)、HGY低劑量組(30 mmol/L葡萄糖+10%HCY低劑量組大鼠血清)。細胞培養結束后，采用Western blot方法檢測纖維連接蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)及Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)含量。結果 與空白對照組比較，高糖組FN、ColⅠ及ColⅣ表達量上調(P<0.01)；HGY含藥血清可降低在高糖誘導的MCs中FN、ColⅠ及ColⅣ表達量(P<0.05)。結論 HGY含藥血清可降低MCs在高糖環境下的FN、ColⅠ及ColⅣ蛋白表達水平，從而減少了ECM堆積，保護腎小球，延緩糖尿病腎病進程。

回回甘松飲；腎小球系膜細胞；細胞外基質堆積；纖維連接蛋白；ColⅠ；ColⅣ

腎臟由固有細胞和細胞外基質構成，細胞外基質是支撐腎臟的基礎，固有細胞是腎臟的功能構成。腎臟固有細胞包括：內皮細胞、上皮細胞、腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞和間質成纖維細胞，而腎小球系膜細胞(mesangial cells, MCs)能合成和分泌多種細胞外基質蛋白，對腎小球毛細血管網起到支撐作用，在腎小球中反應最活躍。糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)最早出現且最明顯的變化就是MCs增生，細胞外基質增多，腎小球增大，從而出現腎小球高濾過現象[1]。

“回回甘松飲”(Hui-hui Gan-song Yin，HGY)是在回族醫學典籍《回回藥方》原方“甘松丸子”基礎上，基于“四性學說”[2]理論，根據益稟補腎、化痰通絡的治則，選用甘松、木香、茴香、丁香等13味藥物組成的特色“香藥”[3]方劑。前期研究已證實[4-6]：HGY對DKD大鼠的腎臟具有保護作用，并可使MCs細胞周期在高糖環境下發生G1/S期阻滯，抑制MCs細胞增殖。本實驗通過血清藥理學的方法，研究HGY含藥血清對高糖誘導的MCs細胞外基質堆積的影響，探討HGY在治療DKD中的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只,6～7周齡，體質量180～200 g， SPF級，購自北京大學醫學部實驗動物科學部，許可證號：SCXK(京)2011-0012。實驗期間大鼠自由攝食和飲水，嚴格遵循《實驗動物保護條例》相關規定。

1.1.2 細胞株：大鼠腎小球系膜細胞株(HBZY-1)購于中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，資源編號：3111C0001CCC000375。

1.1.3 藥物與試劑：HGY(專利號：ZL201310205739.1)由甘松10 g、枸杞15 g、茴香12 g、木香9 g、丁香6 g、藿香3 g、松蕈5 g、菟絲子10 g、大黃5 g、蘆薈8 g、人參15 g、肉蓯蓉10 g、紅花5 g組成。方中各藥材經寧夏醫科大學中醫學院鑒定并按照原方配比，70%乙醇提取，石油醚萃取，大孔樹脂富集分離、濃縮，用蒸餾水配制成實驗所需生藥濃度為0.5、1 g/mL的藥液。格列喹酮(gliquidone)，北京萬輝雙鶴藥業有限責任公司生產，批號：1120536，臨用前用蒸餾水配制成濃度為1 mg/mL藥物溶液。MEM-EBSS培養基(美國，Gibco公司)，胎牛血清(美國，Gibco公司)，細胞培養瓶(板)(美國，Corning公司)，纖維連接蛋白(fibronectin，FN)一抗(美國，Abcam公司)，Ⅰ型及Ⅳ型膠原蛋白(ColⅠ、ColⅣ)一抗(美國，Abcam公司)，山羊抗兔IgG(H+L)二抗(上海基因公司)。

1.1.4 儀器：SW-CJ-1FD型超凈工作臺(中國蘇潔凈化公司)，5804R型超速低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)XP205分析天平(瑞士Mettler Toledo)，CKX41型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Allgre 21R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，FlexStation-3多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備[7]：健康雄性SD大鼠40只，隨機分為4組，即正常對照組、格列喹酮組(10 mg/kg)、HGY(5、10 g/kg)組各10只。HGY組和格列喹酮組大鼠每天分別按照相應劑量灌胃給藥，正常對照組灌胃給予等體積的蒸餾水，每天給藥2次，連續3 d，于末次給藥1 h后股動脈取血，離心，取血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，過濾除菌后，分裝凍存于-20 ℃。

1.2.2 細胞培養：采用含10%胎牛血清的MEM-EBSS培養基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中常規培養。

1.2.3 實驗分組：選取第3～8代細胞進行實驗，共分為5組：①正常對照組(NG)：給予10%正常對照組大鼠血清；②高糖組(HG)：給予30 mmol/L葡萄糖+10%正常對照組大鼠血清；③格列喹酮組(HG+Gli)：給予30 mmol/L葡萄糖+10%格列喹酮(10 mg/kg)組大鼠血清；④HGY-H組(HG+HGY)：給予30 mmol/L葡萄糖+10%HGY(10 g/kg)組大鼠血清；⑤HGY-L組：30 mmol/L葡萄糖+10%HGY(5 g/kg)組大鼠血清。

1.2.4 藥物干預：待生長至70%～80%細胞融合時，采用0.05%胰酶消化，制成細胞懸液，并常規進行細胞傳代，于37 ℃、5%CO2恒溫培養24 h后，吸取上清液，加入無胎牛血清的MEM-EBSS培養液，37 ℃、5%C02恒溫培養24 h，使細胞同步于G0期；同步化后，將細胞分為上述5組，每組設置3孔重復，為減少實驗誤差,將制備的大鼠含藥血清按組別富集合并，按照上述分組方法進行干預，干預過程中均采用只含有大鼠血清的MEM-EBSS培養基培養，在培養結束時取樣本進行檢測。

1.2.5 Western blot法檢測FN、ColⅠ及ColⅣ蛋白表達的影響：提取各組細胞總蛋白，通過BCA法檢測總蛋白含量后，以RIPA調整蛋白濃度，加入5×樣品緩沖液后樣品蛋白終濃度為2 mg/mL。煮沸變性5 min，進行10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白樣本，細胞樣品的上樣量為10 μg/孔，電泳(濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，約80 min)，后經轉膜儀(恒流300 mA，2.5 h)轉膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，將膜在室溫中封閉30 min。用3% BSA-TBST稀釋FN(1:4000)、ColⅠ(1:5000)及ColⅣ(1:1000)一抗，于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次3 min。用5%脫脂奶粉-TBST稀釋HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1:20000)，室溫反應40 min。TBST洗膜6次，每次3 min。ECL加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光10s～5 min(曝光時間隨光強度調整)，顯影2 min，定影，進行膠片掃描。采用Bio-Rad圖像分析系統掃描目的條帶印跡，然后用Quantity One軟件對內參條帶的光密度值進行分析，目的蛋白表達量的改變用相對光密度進行檢測，最后采用目的條帶光密度值與內參條帶光密度值的比值來計算蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 Western blot檢測HGY對高糖誘導的MCs中FN蛋白表達的影響 Western blot檢測結果表明，5組間MCs中FN蛋白表達水平差異有統計學意義(F=7.654，P<0.01)。與正常對照組(1.000±0.224)MCs比較，高糖組(2.506±0.357)MCs中FN蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，給予格列喹酮(1.959±0.362)含藥血清干預后，MCs中FN蛋白的表達水平雖有所降低，但未見顯著性差異；給予HGY高(1.585±0.251)、低劑量(1.599±0.478)含藥血清干預后，FN蛋白的表達水平下降明顯(P<0.01)。由此可知，HGY含藥血清可以下調高糖誘導的MCs中FN蛋白表達水平，且HGY優于格列喹酮含藥血清的作用。見圖1。

圖1 HGY對高糖誘導的MCs中FN蛋白表達的影響**P<0.01，與NG組比較；##P<0.01，與HG組比較Fig.1 FN protein expressions in high glucose- induced MCs(±s，n=3)**P<0.01，compared with NG group；##P<0.01，compared with HG group

2.2 Western blot檢測HGY對高糖誘導的MCs中ColⅠ蛋白表達的影響 Western blot檢測結果表明，5組間MCs中ColⅠ蛋白表達水平差異有統計學意義(F=9.774，P<0.01)。與正常對照組(1.000±0.089)MCs比較，高糖組(2.141±0.302)MCs中ColⅠ蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，給予格列喹酮(1.650±0.225)含藥血清干預后，MCs中ColⅠ蛋白的表達顯著降低(P<0.01)；給予HGY高(1.683±0.237)、低劑量(1.724±0.225)含藥血清干預后，ColⅠ蛋白的表達亦顯著降低(P<0.01)。由此可知，HGY含藥血清可以下調高糖誘導的MCs中ColⅠ蛋白表達水平，且HGY與格列喹酮含藥血清的作用相近。見圖2。

圖2 HGY對高糖誘導的MCs中CollagenⅠ蛋白表達的影響**P<0.01，與NG組比較；##P<0.01，與HG組比較Fig.2 ColⅠ protein expressions in high glucose-induced MCs(±s，n=3)**P<0.01，compared with NG group; ##P<0.01，compared with HG group

2.3 Western blot檢測HGY對高糖誘導的MCs中ColⅣ蛋白表達的影響 Western blot檢測結果表明，5組間MCs中ColⅣ蛋白表達水平差異有統計學意義(F=16.128，P<0.01)。與正常對照組(0.999±0.209)MCs比較，高糖組(4.035±0.644)MCs中ColⅣ蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，給予格列喹酮(2.204±0.463)含藥血清干預后，MCs中ColⅣ蛋白的表達顯著降低(P<0.01)；給予HGY高(2.322±0.478)、低劑量(2.790±0.466)含藥血清干預后，ColⅣ蛋白的表達亦顯著降低(P<0.01)。由此可知，HGY含藥血清可以下調高糖誘導的MCs中ColⅣ蛋白表達水平，且HGY與格列喹酮含藥血清的作用相近。見圖3。

圖3 HGY對高糖誘導的MCs中CollagenⅣ蛋白表達的影響**P<0.01，與NG組比較；##P<0.01，與HG組比較Fig.3 ColⅣ protein expressions in high glucose-induced MCs(±s，n=3)**P<0.01,compared with NG group;##P<0.01,compared with HG group

3 討論

糖尿病腎病是指由糖尿病(diabetic mellitus，DM)引起的慢性腎臟疾病[8]，DKD是DM的主要(重要)并發癥之一，高血糖與DKD的發生、發展有著重要的聯系,很多研究，如著名的“糖尿病干預和并發癥研究”(epidemiology of diabetes interventions and complications，EDIC)、“糖尿病控制與并發癥實驗”(diabetes control and complications trial，DCCT)都證明了合理有效地控制高血糖的發生可以降低DKD并發癥的危險系數[9-10]。DKD臨床主要表現為糖尿病性腎小球硬化癥，而腎小球硬化主要是由于腎小球細胞外基質(extracellular matrix，ECM)堆積所造成。因此，阻止或延緩DKD發生、發展進程最有效的途徑就是減少ECM堆積[11]。

MCs是研究腎臟疾病發生發展機制的常用細胞模型[12-13]，在DKD的病理改變中起到舉足輕重的作用。MCs增殖是DKD發生、發展的病理基礎，該細胞外的基質堆積嚴重影響著腎小球硬化的進程。高糖環境可以刺激MCs增殖，引起細胞外基質堆積。通過體外培養MCs進行研究，不僅可以探索DKD細胞生物學基礎，還可為探討相關的藥理作用機制提供方便。因此，深入研究HGY對高糖條件下MCs的ECM堆積發生的藥理作用機制，對防治DKD具有重要意義。

格列喹酮是WHO推薦的腎功能損害DM患者的首選藥之一。格列喹酮的體內代謝產物95%不經腎臟排泄，是具有良好的保護腎臟的口服降糖藥。其在降低血糖的同時，還可以減少腎臟組織中炎癥反應的發生，減少尿蛋白生成，并能夠改善腎小球基底膜及足細胞的損傷程度[14]，其與HGY治療DKD的藥理作用基本一致，故在本研究中選用格列喹酮作為陽性對照藥。

在生理狀態下,腎組織借助降解酶系統而維持ECM降解的動態平衡；在病理狀態下,一方面，ECM降解酶系統失衡以及相關調控機制紊亂,可導致腎小球ECM降解減少,形成腎小球硬化或腎纖維化；另一方面，即ECM的組成成分合成增加所致[15]。本實驗研究主要從ECM合成增加這一角度考察細胞外基質堆積的機制。

細胞外基質蛋白是ECM的主要成分,主要包括纖維連接蛋白(fibronectin，FN)和膠原蛋白(collagen，Col)等。FN是一種糖蛋白，由腎小球固有細胞分泌，是構成細胞外基質的重要組成成分。正常情況下，FN以非可溶性形式，存在于細胞外基質中，與整合素結合影響細胞外基質的生理功能。DKD發生后，FN過度積聚在系膜區，可以加速腎小球硬化，被認為是加速腎纖維化及硬化的重要因素。由于在DKD的發生及發展過程中，FN含量的升高出現得早而明顯，所以FN被認為是反映腎小球病變的客觀指標[16]。膠原蛋白是一種纖維狀的蛋白質，主要存在于細胞外基質和基底膜中，其中Ⅰ型膠原屬于纖維形成膠原蛋白，Ⅳ型膠原蛋白為基底膜膠原蛋白，分布于腎小球和腎小管基底膜及系膜基質中。前期研究發現[6]：在高糖誘導條件下，MCs中Ⅰ型及Ⅳ型膠原蛋白的mRNA水平明顯升高，此效應可能是多元醇通路活性增強、蛋白激酶C激活的結果。在高血糖條件下，葡萄糖可不依賴胰島素調節進入細胞內,使細胞內葡萄糖濃度增高，從而激活醛糖還原酶，促使葡萄糖轉變為山梨醇，在山梨醇氧化成果糖過程中，激活蛋白激酶C，而蛋白激酶C可使膠原蛋白合成增加[17]。所以，早期檢測FN及Col能較好地判斷ECM堆積情況，并能作為衡量腎小球硬化的重要指標。

在體外實驗研究中發現：在高糖誘導的條件下，MCs中纖維連接蛋白及膠原蛋白的含量均增加(P<0.01)；給藥干預后，HGY含藥血清能明顯降低高糖誘導條件下的MCs中FN、ColⅠ及ColⅣ的蛋白表達量(P<0.01)，且在調節FN、ColⅠ及ColⅣ的蛋白表達水平上，基本與格列喹酮含藥血清的作用相當，這可能是其抑制細胞外基質堆積，保護腎小球的重要機制之一。ECM堆積可以是合成增加的結果,亦可以是降解減少的結果。HGY延緩DKD進程，保護腎臟的藥理作用機制可能是抑制ECM的合成增加，亦有可能是促進ECM的降解，本研究的不足之處在于未檢測高糖誘導條件下MCs中ECM降解酶系統的水平，當然這還需要進一步研究去證實。

綜上所述，HGY可通過調節FN、ColⅠ及ColⅣ的蛋白表達水平，減少ECM堆積，從而減輕DKD腎小球硬化的程度，延緩DKD的發生發展進程，保護腎臟功能。

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(編校：王儼儼)

Effects of Hui-hui Gan-song Yin on accumulation of extracellular matrix of glomerular mesangial cells induced by high glucose

NAN Yi1,2, MA LI-jie1, YUAN Ling2,3,4,5Δ

(1. School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 2. Key Laboratory ofHui Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 3. College of Pharmacy, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 4. Ningxia Engineering and Technology Research Center of Hui Medicine Modernization,Yinchuan 750004, China; 5. Ningxia Collaborative Innovation Center of Hui Medicine, Yinchuan 750004, China)

ObjectiveTo investigate the effects of Hui-hui Gan-song Yin(HGY) on the accumulation of extracellular matrix of rat glomerular mesangial cells(MCs) induced by high glucose.MethodsThe 40 SD rats were randomly divided into normal control group(distilled water), glurenorm group(10 mg/kg), HGY high-dose group(10 g/kg) and HGY low-dose group(5 g/kg), 10 rats in each group. The rats in each group were treated with corresponding drugs, twice a day. After 3 days, the serum containing each drug were prepared to culture rat MCsinvitro. The MCs were divided into the normal control group(10% serum of rats in normal control group), high glucose group(30 mmol/L glucose+ 10% serum of rats in normal control group), glurenorm group(30 mmol/L glucose+ 10% serum of rats in glurenorm group), HGY high-dose group(30 mmol/L glucose+ 10% serum of rats in HGY high-dose group) and HGY low-dose group(30 mmol/L glucose+ 10% serum of rats in HGY low-dose group). The fibronectin(FN), ColⅠand ColⅣ levels were detected by Western blot.ResultsCompared with normal control group, the expression of FN, ColⅠand ColⅣ in high glucose group increased(P<0.01). The HCY suppressed the protein expression of FN, ColⅠand ColⅣ significantly(P<0.05).ConclusionThe serum containing HGY could suppressed protein expression of FN, ColⅠand ColⅣ and inhibit the accumulation of extracellular matrix of MCs induced by high glucose, which could protect glomerulus and delay the development of diabetic nephropathy.

Hui-hui Gan-song Yin; glomerular mesangial cell; accumulation of extracellular matrix; fibronectin;ColⅠ; ColⅣ

2012國家自然科學基金(No.81202774)

南一，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：糖尿病及其并發癥的中醫藥防治研究，E-mail：nanyiailing@sina.com；袁玲，通信作者，女，博士，講師，研究方向：中藥藥理學研究，E-mail：nxykdx@qq.com。

R692.6

A

1005-1678(2015)11-0015-04