沙利度胺對急性白血病患者外周血調節性T細胞的影響及其臨床療效評價

夏軼姿，朱寶玲，湯魯明，邢超，陳慧，邵美娟

(1.溫州醫科大學附屬第二醫院 急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 血液科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫科大學附屬第二醫院 檢驗科，浙江 溫州 325027)

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沙利度胺對急性白血病患者外周血調節性T細胞的影響及其臨床療效評價

夏軼姿1Δ，朱寶玲2，湯魯明1，邢超3，陳慧3，邵美娟3

(1.溫州醫科大學附屬第二醫院 急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 血液科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫科大學附屬第二醫院 檢驗科，浙江 溫州 325027)

目的 評定沙利度胺(thalidomide)對急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者CD4+CD25+T淋巴細胞的影響及其臨床療效。方法 將71例AML患者隨機分為常規化療方案對照組(37例)和沙利度胺加常規化療方案治療組(34例)，另有31例健康者納入正常組。治療組和對照組患者均接受相同化療方案，其中治療組加用沙利度胺。分別檢測治療前、第二療程化療結束后10～14d、完全緩解后隨訪6個月或隨訪過程中復發時血清CD4+CD25+T淋巴細胞、CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+/CD8+比值、NK細胞水平，正常組于對應化療前及化療結束后10～14d檢測相同指標。觀察治療組和對照組患者臨床療效。結果 治療組有效緩解率較對照組高(P<0.05)；治療組和對照組患者治療前CD4+CD25+T淋巴細胞水平均明顯高于正常組(P<0.05)，治療后2組均下降(P<0.05)；與對照組相比，治療組CD4+CD25+T淋巴細胞水平明顯降低(P<0.05)。加用沙利度胺治療后，治療組在CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD4+/CD8+比值、NK細胞水平均明顯高于對照組(P<0.05)。結論 沙利度胺可改善AML患者細胞免疫功能和提高臨床緩解有效率，機制與下調CD4+CD25+T淋巴細胞水平相關。

沙利度胺；急性髓細胞白血病；CD4+CD25+T淋巴細胞；腫瘤免疫

急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是造血系統非淋巴細胞的惡性腫瘤，多數患者經過正規治療后仍殘存部分白血病細胞(minimal residual disease，MRD)，此時自身的免疫系統在清除MRD的過程中發揮重要作用。CD4+CD25+T淋巴細胞(CD4+CD25+Treg)是近年來鑒定的一種新型免疫抑制細胞，有學者發現AML患者外周血中 CD4+CD25+Treg比例明顯高于正常人，并推測CD4+CD25+Treg在AML發生發展中起到一定作用[1-3]。沙利度胺(thalidomide)作為一種合成的谷氨酸衍生物，具有免疫調節、抗炎及抗血管生成等重要作用[4-5]。研究認為沙利度胺可以通過調節免疫系統、抑制炎癥反應等方式對血液系統腫瘤有一定的療效[6-7]。本研究擬通過觀察沙利度胺對AML患者的免疫功能的調節并進一步探索沙利度胺的作用機制，為探索AML的免疫調理治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年6月至2014年6月溫州醫科大學附屬第二醫院血液科新發、復發或難治的AML病患者71例，其中年齡51～67歲，平均(56.1±8.1)歲；男性43例，女性28例。按照FAB分型(法國、美國和英國)三國血細胞形態學專家討論、制訂了關于急性白血病的分型診斷標準，簡稱“FAB”分型，M1型7例，M2型12例，M3型27例，M4型21例，M5型4例。所有患者的診斷均根據臨床、細胞形態學、病理、免疫學資料及遺傳學檢查做出診斷。按隨機化數字表原則，入科后疾病診斷符合AML診斷標準后立刻納入研究，按照患者入住血液科日期分為治療組(34例)與對照組(37例)。治療組男性22例，女性12例，年齡50～66歲，平均年齡(56.0±7.4)歲，M1型3例，M2型6例，M3型11例，M4型12例，M5型2例。對照組男性21例，女性16例，年齡51～67歲，平均年齡(56.2±7.8)歲，M1型4例，M2型6例，M3型16例，M4型9例，M5型2例。選取同期本院健康體檢患者30例，男性15例，女性15例，年齡50～67歲，平均(55.1±7.9)歲。治療組與對照組一般資料比較差異無統計學意義，具有可比性。排除伴有其他惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全、嚴重代謝性疾病及治療不配合患者。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：所有患者按照隨機化原則分為治療組(34例)和對照組(37例)，治療組確診后立即進行常規化療方案并開始服用沙利度胺片(常州制藥廠有限公司，國藥準字H32026129)，起始劑量從50 mg/d，1周后可加量至100 mg/d，若病人無不能耐受的毒副作用，在加量至200 mg/d后一直服用至全部化療結束。對照組化療方案同實驗組，但無沙利度胺。正常組不做藥物處理。

1.2.2 樣品采集：根據張之南《血液病療效及診斷標準》[8]，將白血病分為完全緩解，部分緩解，未緩解。完全緩解：白血病的癥狀、體征消失；血象和骨髓象基本正常，中性粒細胞絕對值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，外周血分類中無白血病細胞；骨髓象原始、幼稚白血病細胞≤5%，紅系、巨核系正常。部分緩解：骨髓中原始細胞為5%～20%，外周血標準同CR。未緩解(NR)：骨髓中原始細胞≥20%。

1.2.3 外周血CD4+CD25+Treg水平測定：2組患者于治療前(T1)、第二療程化療結束后10～14 d(T2)、完全緩解后隨訪6個月或隨訪過程中復發時(T3)，分別抽取外周血；正常組于治療組和對照組化療前及化療結束后10～14 d(T2)對應時間抽取外周血，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。取50 μL血液標本，每管中加入10 μLCD4-FITC、5 μLCD25-PE、10 μLCD127-PECy5后混勻，室溫避光孵育30 min，加1 mL細胞裂解液混勻，PBS洗滌2次，低速離心5 min，去上清液后加入200 μL PBS液，重懸后用Handyem流式細胞儀(北京四正柏生物科技有限公司)進行檢測。

1.2.4 外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及NK細胞的檢測：抽取患者空腹血2 mL，肝素抗凝。直接免疫熒光標記法，100 μL全血CD3-FITC/CDl6CD56PE熒光雙標記單克隆抗體放入試管中，混勻后室溫避光放置30 min，低速離心5 min棄去上清液，PBS洗滌后上機檢測(DF-100熒光光譜儀，上海仁特檢測儀器有限公司)。

2 結果

2.1 臨床療效比較 71例患者均于第二療程化療結束后10～14 d后評價療效，治療組有效病例繼續口服沙利度胺。治療組中，完全緩解28例，部分緩解4例，未緩解2例，有效率94.12%。對照組中，完全緩解25例，部分緩解3例，未緩解9例，有效率75.68%。2組間療效差異有統計學意義(χ2=4.603，P<0.05)。

2.2 各組患者外周血CD4+CD25+Treg水平比較 治療前2組患者CD4+CD25+Treg水平差異無統計學意義，但均高于正常組(P<0.05)；治療后2組患者CD4+CD25+Treg水平較治療前均降低，但仍高于正常組(P<0.05)，其中治療組CD4+CD25+Treg水平明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者不同時間點CD4+ CD25+ Treg細胞的比較Tab.1 Comparison of CD4+ CD25+ Treg in serum of different point of three groups(±s)

#P<0.05，與同組治療前比較，compared with the same group pre-treatment；*P<0.05，與對照組同期比較，compared with control group same period

2.3 各組患者外周血T淋巴細胞亞群及NK細胞水平比較 患者治療前CD3+、CD4+、NK細胞比例及CD4/CD8比值較正常組明顯偏低(P<0.05)；CD8+較正常人升高(P<0.05)。2組患者治療后CD3+、CD4+、NK細胞比例及CD4/CD8比值較治療前明顯升高(P<0.05)；CD8+治療前后無顯著變化，差異無統計學意義。與對照組治療后相比，治療組患者CD3+、CD4+、NK細胞比例及CD4+/CD8+比值明顯升高(P<0.05)；CD8+無明顯變化，差異無統計學意義。見表2。

表2 3組患者不同時間點血清T淋巴細胞亞群及NK細胞的比較

#P<0.05，與同組治療前比較，compared with the same group pre-treatment；*P<0.05，與對照組同期比較，compared with control group same period

3 討論

AML的微環境具有免疫抑制性和抗細胞凋亡的特性，而其中的免疫抑制性又包括免疫細胞和免疫分子[9]。自身免疫系統能夠積極對抗白血病細胞，對免疫系統進行調節可能提高腫瘤患者的生存率[10]。闡明自身免疫的作用機制，對于提出新的腫瘤治療方案以及進一步探討腫瘤發生發展規律具有非常重要的意義。

本研究采用隨機對照臨床研究，觀察沙利度胺對AML患者免疫功能及預后的影響。研究結果提示，2組AML患者治療后，T淋巴細胞亞群及NK細胞水平均治療前有升高(P<0.05)，研究組升高程度大于對照組(P<0.05)，提示隨時間延長，2組患者自身免疫功能改善，而研究組改善明顯，提示沙利度胺能促進T淋巴細胞亞群及NK細胞水平重新達到平衡，使機體免疫狀態得到改善，進一步說明，沙利度胺對AML患者抑制狀態的免疫功能起到調節作用。此外，2組患者有效緩解率相比，研究組明顯優于對照組(P<0.05)，提示沙利度胺聯合常規化療能改善AML患者預后。

CD4+CD25+調節性T淋巴細胞(CD4+CD25+Treg)具有免疫無能性及免疫抑制性，可以抑制效應性CD4+細胞、CTL和NK細胞，在腫瘤免疫逃逸和抗腫瘤免疫中起著重要的作用。國外研究中發現血AML患者外周血CD4+CD25+Treg比例明顯升高，其升高程度與病程及預后呈正相關[11]。此外，Zhou[12]等發現在鼠類AML模型中降低CD4+CD25+Treg水平可以提高T細胞亞群在體外的功能，且有利于提高療效。本研究中治療組和對照組患者CD4+CD25+Treg比例明顯高于正常組(P<0.05)。經沙利度胺之后，治療組患者CD4+CD25+Treg比例較對照組明顯下降，提示沙利度胺可以下調患者CD4+CD25+Treg的表達并解除AML患者的免疫抑制狀態，阻止腫瘤細胞的逃逸。

本研究表明沙利度胺聯合化療可提高AML的緩解率，其主要通過下調CD4+CD25+Treg水平，改善其它免疫細胞功能從而發揮其抗AML作用，同時這一結果為尋找新的治療AML的途徑奠定了理論基礎，抑制CD4+CD25+Treg的功能可為AML的治療開辟新的途徑。

[1] Suto A,Nakajima H,Kagami SI,et al.Role of CD4CD25 regulatory T cells in Th2 cells mediated allergic inflammation in the airways[J].Am J Respir Crit CareMed,2001,164:680-687.

[2] Beyer M,Sehultze JL.Regulatory T cells in cancer[J].Blood,2006,108(3):804-811.

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[12] Zhou Q,Bucher C,Munger M E,et al.Depletion of endogenous tumor-associated regulatory T cells improves the efficacy of adoptive cytotoxic T-cell immunotherapy in murine acute myeloid leukemia[J].Blood,2009,114(18):3793-3802.

(編校：譚玲)

Effect of thalidomide on peripheral blood regulatory T cells and evaluation of its clinical effect in patients with acute myelocytic leukemia

XIA Yi-zi1Δ, ZHU Bao-ling2, TANG Lu-ming1, XING Chao3, CHEN Hui3, SHAO Mei-juan3

(1.Department of Emergency,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China;2.Department of Hematology,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China;3.Department of Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China)

ObjectiveTo evaluate of impact of thalidomide on CD4+CD25+T lymphocytes in patients with acute myeloid leukemia and its clinical curative effect.Methods71 cases of patients with AML were randomly divided into the control group and the experiment group, and 31 healthy people were selected to be the normal group. The experiment group and the control group patients were treated with the same chemotherapy, the experiment group was treated with thalidomide. The levels of CD4+CD25+T lymphocyte, CD3+T lymphocyte, CD4+T lymphocyte, CD8+T lymphocyte, ratio of CD4+/CD8+and NK cells were detected at before treatment, 10 to 14d after treatment, complete remission 6 months follow-up. In normal group, the same index was detected before and after chemotherapy, and 10-14 d. The clinical curative effect of the experiment group and the control group were observed.ResultsThe effective rate of the experiment group was higher than of the control group(P< 0.05); The levels of CD4+CD25+T lymphocyte in the experiment group and control group were significantly higher than in the normal group(P< 0.05), the two groups decreased compared with the control group, the level of CD4+CD25+T lymphocyte in the experiment group was significantly decreased(P< 0.05). And with thalidomide treatment, the experiment group in the CD3+T lymphocytes, CD4+T lymphocytes and ratio of CD4+/CD8+, NK cells were significantly higher than the control group(P< 0.05).ConclusionThalidomide can improve both the immunity cell function and the clinical efficiency in patients with AML. The mechanism is related to reduce the level of CD4+CD25+T lymphocyte.

thalidomide; acute myeloid leukemia; CD4+CD25+T lymphocyte; tumor immunity

2012年度溫州市科技計劃項目(Y20120051)

夏軼姿，通信作者，女，本科，主治醫師，研究方向：血液腫瘤學，E-mail：wenzhouxiayizi@163.com。

R552

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1005-1678(2015)11-0061-03