肝素鈉雜質總己糖胺中半乳糖胺的方法學研究

楊方秀，汪玉馨，劉霞飛，陸益紅，樊夏雷Δ

(1.徐州醫學院江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210008)

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肝素鈉雜質總己糖胺中半乳糖胺的方法學研究

楊方秀1,2，汪玉馨2，劉霞飛1,2，陸益紅2，樊夏雷1,2Δ

(1.徐州醫學院江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210008)

目的 建立離子色譜法測定肝素鈉樣品水解后的半乳糖胺含量。方法 通過計算半乳糖胺和葡萄糖胺的響應值的比值從而得到半乳糖胺含量。采用戴安離子色譜儀，色譜柱為氨基酸捕獲柱 (30 mm×3 mm)，串聯保護柱(30 mm × 3 mm)和CarboPac PA20分析柱(150 mm × 3 mm)進行分析，脈沖安培檢測器檢測。流動相為14 mM氫氧化鉀溶液，流速為0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積10 μL。結果 鹽酸葡萄糖胺在1.013～16.211 μg/mL范圍內，葡萄糖胺色譜峰面積與其濃度成良好線性關系(Y=2.303 4X+0.824 2，r=0.998 3)，回收率為92.7%，RSD為3.2%(n=9)，最低檢測限為0.1013 μg/mL，定量限為0.3377 μg/mL。鹽酸半乳糖胺在0.0102～0.1625 μg/mL范圍內，半乳糖胺色譜峰面積與其濃度成良好線性關系(Y=31.157X-0.114 4，r=0.999 3)，回收率為102.1%，RSD為2.4%(n=9)，最低檢測限為0.001 0 μg/mL，定量限為0.003 4 μg/mL。3批肝素鈉原料中半乳糖胺檢測結果分別為未檢出，(0.02±2.1)%，(0.03±1.5)%，均小于美國藥典規定的限值1%。結論 經方法學驗證，本文所建立的離子色譜法可用于肝素鈉中半乳糖胺含量測定，可為肝素鈉質量標準的提高提供參考。

肝素鈉；離子色譜法；方法學；總己糖胺；半乳糖胺

肝素鈉是臨床上常用的糖胺聚糖類抗凝血藥物，臨床上常用于治療心腦血管疾病及血栓栓塞性疾病[1-3]。雜質對肝素鈉制劑的有效性和安全性具有重要的影響，肝素鈉生產過程中可能會產生多種雜質，比如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、多硫酸軟骨素等肝素類似物，且已有文獻對這幾種雜質均進行了質量控制研究[4-8]，肝素鈉水解后可能會產生半乳糖胺，半乳糖胺是肝細胞中磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，進入體內后結合磷酸尿苷形成磷酸尿苷-半乳糖胺，使得磷酸尿苷耗竭，導致一系列細胞器受損，蛋白合成紊亂從而造成肝細胞損傷[9]。通過文獻調研，半乳糖胺可誘導肝細胞損傷[10]，導致大鼠肝纖維化[11]和小鼠急性肝損傷[12]，嚴重時可導致大鼠急性肝衰竭[13-14]。因此檢測半乳糖胺的含量對提高肝素鈉原料的質量具有十分重要的意義。通過國內外文獻檢索，其方法學研究并未有相應的文獻報道，現有國內質量標準也未對半乳糖胺進行質量控制。為靈敏準確地分析肝素鈉及相關化合物中可能存在的半乳糖胺雜質，本實驗建立高效靈敏、高分離效能的離子色譜法對本品水解后的半乳糖胺含量進行檢查，為進一步完善肝素鈉質量標準提供參考。由于實驗中通過測定半乳糖胺和葡萄糖胺的響應值，計算其比值從而計算半乳糖胺百分比，故研究中需對半乳糖胺和葡萄糖胺均進行方法學研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器：Dionex ICS 3000 離子色譜儀，脈沖安培檢測器(美國Dionex公司)。

1.1.2 試劑：鹽酸葡萄糖胺對照品(批號：GOM183，USP)；鹽酸半乳糖胺(批號：GOL378，USP)。供試品：肝素鈉原料3批(批號：1405001、1405002、1405003)均由某廠家提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：采用Dionex ICS 3000離子色譜儀，色譜柱為氨基酸捕獲柱 (30 mm × 3 mm)，串聯保護柱(30 mm × 3 mm)和CarboPac PA20分析柱(150 mm × 3 mm)進行分析，脈沖安培檢測器，波長設置見表1。流動相為14 mM氫氧化鉀溶液，流速為0.4 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

表1 脈沖安培檢測器波長設置

1.2.2 專屬性：取線性項下100 ℃加熱6 h后的水解標準溶液，用水稀釋制成每1 ml含鹽酸葡萄糖胺為8.106 μg，含鹽酸半乳糖胺為0.0813 μg的溶液，取樣品測定項下100 ℃加熱6 h后的肝素鈉樣品(批號：1405001)水解溶液適量，用水稀釋制備成含肝素鈉24 μg/mL，注入離子色譜分析。

1.2.3 線性及范圍 精密稱取鹽酸葡萄糖胺標準品適量，用5 N鹽酸溶液稀釋制成1.6 mg/mL，精密稱取鹽酸半乳糖胺標準品適量，用5 N鹽酸溶液稀釋制成16 μg/mL，將等體積的葡萄糖胺和半乳糖胺標準溶液混合，轉移5 mL標準溶液置頂空瓶中，加蓋，100 ℃加熱6 h。取水解標準溶液，用水稀釋制成每1 mL含鹽酸葡萄糖胺濃度分別為1.013、2.026、4.053、8.106、16.211 μg，含鹽酸半乳糖胺濃度分別為0.0102、0.0203、0.0406、0.0813、0.1625 μg的溶液，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，分別以葡萄糖胺的峰面積(A)對其濃度(C)進行線性回歸，以半乳糖胺的峰面積(A)對其濃度(C)進行線性回歸。

1.2.4 檢測限及定量限：取“線性及范圍”項下混合標準溶液稀釋若干倍，進樣10 μL，分別記錄半乳糖胺和葡萄糖胺為噪音的3倍時的色譜圖。

1.2.5 準確度(回收率)：精密稱取肝素鈉樣品(批號：1405001)適量，用5 N鹽酸溶液稀釋，加入葡萄糖胺和半乳糖胺混合標準溶液，置頂空瓶中，加蓋，100 ℃加熱6 h。用水稀釋制備成含肝素鈉24 μg/mL，鹽酸葡萄糖胺添加濃度分別為6.485、8.106和9.727 μg/mL，鹽酸半乳糖胺添加濃度分別為0.0650、0.0813和0.0976 μg/mL的模擬樣品各3份進行測定，確定葡萄糖胺及半乳糖胺離子色譜測定的準確度。

1.2.6 進樣精密度：取線性項下含鹽酸葡萄糖胺8.106 μg/mL，含鹽酸半乳糖胺0.0813 μg/mL的混合標準溶液連續進樣6次，記錄色譜圖，考察峰面積的變化。

1.2.7 重復性：精密稱取肝素鈉樣品(批號：1405001)適量，用5 N鹽酸溶液稀釋，加入葡萄糖胺和半乳糖胺混合標準溶液，置頂空瓶中，加蓋，100 ℃加熱6 h。用水稀釋制備成含肝素鈉24 μg/mL，鹽酸葡萄糖胺添加濃度為8.106 μg/mL，鹽酸半乳糖胺添加濃度分別為0.0813 μg/mL的模擬樣品各6份進行測定。

1.2.8 穩定性：取含鹽酸葡萄糖胺8.106 μg/mL，含鹽酸半乳糖胺0.0813 μg/mL的混合標準溶液于0、2、4、6、12、24 h分別進樣，以峰面積考察溶液穩定性。

1.2.9 供試品中總己糖胺中半乳糖胺測定：取含鹽酸葡萄糖胺8.106 μg/mL，含鹽酸半乳糖胺0.0813 μg/mL的混合標準溶液，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，計算標準溶液水解液中半乳糖胺和葡萄糖胺響應值的比值。取3批肝素鈉樣品(批號：1405001、1405002、1405003)，各稱取12 mg置頂空瓶中，加5 N鹽酸溶液5 mL溶解，加蓋，100 ℃加熱6 h。用水稀釋100倍，注入離子色譜儀，記錄色譜圖。平行測定3次。計算公式如下：

水解標準溶液中半乳糖胺與葡萄糖胺的響應值比值：f=(As1/ As2)×(ms2/ms1)

As1：標準溶液中半乳糖胺峰面積；As2：標準溶液中葡萄糖胺峰面積；ms1：標準溶液中半乳糖胺質量；ms2：標準溶液中葡萄糖胺質量；

水解供試品中半乳糖胺的峰面積比%= (A1/f)/[(A1/f)+A2]×100

A1：水解供試品中半乳糖胺的峰面積；A2：水解供試品中葡萄糖胺的峰面積

2 結果

2.1 專屬性 專屬性結果表明，肝素鈉不會對葡萄糖胺及半乳糖胺的測定存在干擾。見圖1。

圖1 葡萄糖胺及半乳糖胺離子色譜分析專屬性A:葡萄糖胺半乳糖胺混合標準溶液；B:肝素鈉原料Fig.1 The specialization of the ion chromatography analysis of glucosamine and galactosamineA: the mix standard solution of glucosamine and galactosamine；B: the raw material of heparin sodium

2.2 線性及范圍 在1.013～16.211 μg/mL范圍內，葡萄糖胺色譜峰面積與其濃度成良好線性關系，Y=2.3034X+0.8242，r=0.998 3(見表2)。在0.0102～0.1625 μg/mL范圍內，葡萄糖胺色譜峰面積與其濃度成良好線性關系，Y=31.157X-0.1144，r=0.999 3(見表3)。

表2 葡萄糖胺離子色譜分析線性及范圍

表3 半乳糖胺離子色譜分析線性及范圍

2.3 檢測限及定量限 鹽酸葡萄糖胺方法檢測限為0.1013 μg/mL，定量限為0.3377 μg/mL，鹽酸半乳糖胺方法檢測限為0.0010 μg/mL，定量限為0.0034 μg/mL。見圖2。

圖2 葡萄糖胺及半乳糖胺離子色譜分析檢測限(A)及定量限(B)Fig.2 The LOD(A)and LOQ(B)of the ion chromatography analysis of glucosamine and galactosamine

2.4 準確度(回收率) 葡萄糖胺離子色譜測定的準確度平均值為92.7%，RSD為3.2%(見表4)。半乳糖胺離子色譜測定的準確度平均值為102.1%，RSD為2.4%(見表5)，結果表明測定準確度均良好。

表4 葡萄糖胺離子色譜分析準確度

表5 半乳糖胺離子色譜分析準確度

2.5 進樣精密度 進樣精密度的結果表明葡萄糖胺及半乳糖胺進樣精密度均良好。見表6、7。

表6 葡萄糖胺離子色譜分析進樣精密度Tab.6 The precision of ion chromatography analysis of glucosamine

表7 半乳糖胺離子色譜分析進樣精密度Tab. 7 The precision of ion chromatography analysis of galactosamine

2.6 重復性 重復性結果表明葡萄糖胺和半乳糖胺重復性均良好。見表8、9。

表8 葡萄糖胺離子色譜分析重復性Tab.8 The repeatability of ion chromatography analysis of glucosamine

表9 半乳糖胺離子色譜分析重復性Tab.9 The repeatability of ion chromatography analysis of galactosamine

2.7 穩定性 以峰面積考察溶液穩定性，結果發現主峰面積未見顯著下降，表明葡萄糖胺及半乳糖胺均在測定時間內穩定。見表 10、11。

表10 葡萄糖胺離子色譜分析穩定性Tab.10 The stability of ion chromatography analysis of glucosamine

表11 半乳糖胺離子色譜分析穩定性Tab.11 The stability of ion chromatography analysis of galactosamine

2.8 樣品測定 分別對3批肝素鈉原料中半乳糖胺進行檢測，每批樣品平行測定3次，其檢測結果分別為未檢出，(0.02±2.1)%，(0.03±1.5)%，均小于美國藥典規定的限值1%。

3 討論

本實驗建立了離子色譜法測定半乳糖胺及葡萄糖胺的方法學，并對3批肝素鈉原料藥樣品中半乳糖胺的含量進行測定，均獲得良好的結果。與比色法[15]相比，采用離子色譜儀檢測葡萄糖胺及半乳糖胺的方法的專屬性強、重現性好、穩定性和靈敏度高。前者主要通過氨基糖與乙酰丙酮產生生色物質通過分光光度計進行檢測，由于其對操作要求很高，其準確度和穩定性因此受到一定限制，而離子色譜法運用離子交換的原理配備脈沖安培檢測器，通過優化分離方式和分離柱提高被分析物的選擇性和檢測靈敏度。因此，本實驗所研究的離子色譜法檢測肝素鈉總己糖胺中半乳糖胺的方法可以為肝素鈉質量控制提供一定的參考。

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(編校：王儼儼)

A methodological study of limit test of galactosamine for total hexosamine in heparin sodium

YANG Fang-xiu1,2, WANG Yu-xin2, LIU Xia-fei1,2, LU Yi-hong2, FAN Xia-lei1,2Δ

(1. Jiangsu key laboratory of new drug research and clinical pharmacy, Xuzhou 221004, China; 2. Jiangsu Province Food and Drug Supervision and Inspection Institute, Nanjing 210008, China)

ObjectiveTo establish an ion chromatography method to determine the content of galactosamine in heparin sodium sample.MethodsThe content of galactosamine was determined by the ratio of response value of galactosamine and glucosamine. The determination was performed on an Dionex ICS, and the separation was carried out on a Amino acids capture column (30 mm × 3 mm), Series protect column (30 mm × 3 mm)and analytical column CarboPac PA20 (150 mm × 3 mm). The mobile phase was 14 mM potassium hydroxide solution at a flow rate of 0.4 mL/min; the column tempertature was at 30 ℃; the injection volume was 10 μL.ResultsGlucosamine hydrochloride had good linearity within the range of 1.013 - 16.211 μg/mL(Y= 2.303 4X+0.824 2,r=0.998 3), the average accuracy was 92.7%, and RSD was 3.2%(n=9), the limit of detection was 0.101 3 μg/mL, and the limit of quantitation was 0.337 7 μg/mL. D-Galactosamine hydrochloride had good linearity within the range of 0.010 2 - 0.162 5 g/mL, (Y= 31.157X-0.114 4,r=0.999 3). The accuracy was 102.1%, RSD was 2.4%(n=9). The limit of detection was 0.001 0 μg/mL, and the limit of quantitation was 0.003 4 μg/mL. The determination of galactosamine in 3 batches of heparin sodium raw material was not detected, (0.02±2.1)%, (0.03±1.5)%, respectively, which were all lower than the limit value (1%) of United States Pharmacopeia regulation.ConclusionThe method for the determination of galactosamine in total hexose amine is successfully developed, which could be used as reference for improvement of the quality standard of heparin sodium.

heparin sodium; ion chromatography; methodology; total hexosamine; galactosamine

楊方秀，女，碩士，研究方向：體內藥物分析學及藥品安全性研究，E-mail：yfx1409@163.com；樊夏雷，通信作者，男，博士，碩士生導師，主任藥師，研究方向：色譜分析及藥品安全性研究，E-mail:fanxialei@sohu.com。

R973+.2

A

1005-1678(2015)11-0165-04