多烯酸乙酯軟膠囊的抗氧化劑研究

任麗萍，藺娟，閔祺，廖海明，楊洪淼，范慧紅Δ

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.新疆維吾爾自治區食品藥品檢驗所，新疆 烏魯木齊 830004；3.遼寧錦州市食品藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

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多烯酸乙酯軟膠囊的抗氧化劑研究

任麗萍1，藺娟2，閔祺3，廖海明1，楊洪淼1，范慧紅1Δ

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.新疆維吾爾自治區食品藥品檢驗所，新疆 烏魯木齊 830004；3.遼寧錦州市食品藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

目的 分析比較多烯酸乙酯軟膠囊國內外同類產品的過氧化值、甲氧基苯胺值以考察其氧化穩定性。方法 采用TSK gel ODS-100V色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇—水(98:2，V/V)測定多烯酸乙酯軟膠囊樣品中維生素E的結構形式；初步評價生育酚醋酸酯、α-生育酚作為輔料對ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類藥物抗氧化作用的影響。結果 國產樣品中添加的抗氧化劑的主要結構形式為醋酸酯結構，國外同類樣品抗氧化劑主要為游離的α-生育酚；生育酚醋酸酯的抗氧化效果不如生育酚的效果佳，維生素E的結構形式對ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類藥物抗氧化作用有直接影響。結論 本研究為科學評價多烯酸乙酯軟膠囊中抗氧化劑添加的合理性提供了依據，對有效控制該類藥品質量具有積極意義。

多烯酸乙酯軟膠囊；抗氧劑；抗氧化作用；維生素E；α-生育酚 ；生育酚醋酸酯

多烯酸乙酯軟膠囊為ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類降脂藥，其原料和制劑均為《中國藥典》2010年版二部新增品種[1]。該藥為國家非基本藥物，在部分地區醫保目錄乙類品種中收載。美國藥典(USP37)收載同類品種ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類原料和軟膠囊劑，日本藥局方(JP16)收載同類品種二十碳五烯酸乙酯原料藥，歐洲藥典(EP8.0)收載同類品種ω-3多不飽和脂肪酸乙酯60、90系列原料藥。2014年本院承擔了對多烯酸乙酯軟膠囊的國家評價性抽驗工作。

ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類藥物的主要有效成分為二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯，2者化學結構中均含有較多的不飽和雙鍵，在加工和運輸過程中易受到氧氣、光照和水分等因素的作用而發生酸敗[2-3]。因此氧化穩定性是衡量該類藥品質量的重要指標，藥品中添加的抗氧化劑又與藥品的氧化穩定性緊密相關。《中國藥典》2010年版注明該藥處方由多烯酸乙酯原料和適量穩定劑組成，但未對穩定劑種類和量有更詳細的說明。在調研過程中發現，國內企業添加的穩定劑主要為維生素E，各企業的添加量存在較大差別，濃度范圍大約為0.5%～3%。該添加量遠遠高于國外同類品種所標明的 0.1%～0.4%濃度，與多烯酸乙酯軟膠囊所不同的是，國外品種所添加的抗氧劑為α-生育酚。

維生素E是一種脂溶性的維生素，由于取代基位置的不同存在α、β、γ、δ四種異構體，根據酚羥基是否酯化可分為生育酚與生育酚醋酸酯[4]，中國藥典中收載的維生素E就是以醋酸酯的形式存在[1]。多烯酸乙酯軟膠囊藥品所使用的抗氧化劑維生素E是何種結構形式？它與國外藥品使用的α-生育酚有何區別？2者對該類藥品的氧化穩定性有何影響？2者的抗氧化作用哪種更強？針對以上問題，本研究在對國內外同類藥品的氧化穩定性指標過氧化值、甲氧基苯胺值結果進行比較分析的基礎上，對該品種所添加抗氧劑維生素E的結構形式以及不同結構的維生素E的抗氧化能力進行考察，旨在為科學評價該類藥物抗氧化劑添加的合理性提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀： SPD-20A檢測器、SIL-20A自動進樣器、二元泵(日本島津公司)。

1.2 藥品與試劑 2014年國家評價性抽驗的6個廠家共26批樣品；維生素E輔料4批(國內4家制劑生產企業提供)；多烯酸乙酯原料樣品(國內企業A提供)；二十碳五烯酸乙酯原料3批(進口企業A)；二十碳五烯酸乙酯軟膠囊3批(進口企業B)；α-生育酚標準品(日本藥局方)；生育酚醋酸酯對照品(sigma公司)；甲醇(色譜純，Fisher公司)；超純水(實驗室自制)。

1.3 過氧化值、甲氧基苯胺值測定方法 取多烯酸乙酯軟膠囊5個企業25批次樣品，二十碳五烯酸乙酯軟膠囊3批樣品，按照《中國藥典》2010年版二部多烯酸乙酯軟膠囊質量標準中過氧化值、甲氧基苯胺值方法[1]測定，采用SPSS統計軟件繪制各企業所有批次的過氧化值、甲氧基苯胺值箱式圖。

1.4 國產制劑輔料中維生素E結構形式的考察

1.4.1 色譜條件：色譜柱：TSK gel ODS-100V色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；檢測波長：285 nm；流動相:甲醇:純水=98:2；流速：1.0 mL，等度洗脫。

1.4.2 對照品及供試品溶液的制備：取生育酚醋酸酯對照品、α-生育酚標準品、企業提供維生素E輔料各50 mg，分別置于棕色50 mL容量瓶中，加入甲醇并定容，采用0.45 μm針頭濾器進行過濾。各樣品進樣20 μL。

1.5 生育酚醋酸酯與游離α-生育酚對油脂氧化影響

1.5.1 供試品的制備：模擬國外制劑處方，加入α-生育酚到多烯酸乙酯原料中，混勻后置于表面皿中，制備0.1%、0.2%的α-生育酚共2個濃度水平的多烯酸乙酯制劑；模擬國內制劑處方，加入生育酚醋酸酯到多烯酸乙酯原料中，混勻后置于表面皿中，制備1%、3%的生育酚醋酸酯共2個濃度水平的多烯酸乙酯制劑，取多烯酸乙酯原料藥空白對照。

1.5.2 實驗方法：將所有樣品置于紫外燈下照射，照射2 h(功率40 w，垂直距離60 cm)，取出后置于65 ℃恒溫烘箱中誘導氧化酸敗。每隔24 h，將樣品取出置于紫外燈下照射2 h，然后復置于65 ℃恒溫烘箱中繼續誘導，連續照射5 d，分別于第0、1、2、3、4、5天取樣充氮保存，考察樣品外觀性狀及過氧化值的變化。

2 結果

2.1 過氧化值、甲氧基苯胺值測定結果 所有批次樣品的過氧化值均小于15.0，甲氧基苯胺值均小于30.0。國內外不同企業樣品的過氧化值、甲氧基苯胺值的箱式圖分別見圖1、圖2。從圖中可以看出國內企業的過氧化值、甲氧基苯胺值均高于國外同類產品，國內同一企業不同批次間樣品的過氧化值、甲氧基苯胺值均存在較大差異。

圖1 不同生產單位樣品過氧化值箱式圖Fig.1 Comparison of peroxide value of ethyl polyenoate soft capsules from different manufactures

圖2 不同生產單位樣品甲氧基苯胺值箱式圖Fig.2 Comparison of anisidine value of ethyl polyenoate soft capsules from different manufactures

2.2 國產制劑輔料中維生素E結構形式的考察結果 α-生育酚、生育酚醋酸酯對照品及供試品溶液的HPLC色譜圖見圖3。由4家企業提供的輔料其維生素E主要結構形式為生育酚醋酸酯，進口企業樣品中的抗氧化劑為α-生育酚。

圖3 對照品及供試品溶液的HPLC色譜圖1.α-生育酚；2.生育酚醋酸酯；a.進口EPA乙酯軟膠囊；b-e.4家國內企業提供維生素E輔料；f.生育酚醋酸酯對照品；g.α-生育酚對照品Fig.3 HPLC chromatograms of reference substance and sample solution1.α-tocopherol；2.tocopherol acetate；a.imported ethyl icosapentate soft capsules；b-e.vitamin E as excipient supplied by four kinds of domestic manufactures of ethyl polyenoate soft capsules；f.tocopherol acetate reference substance；g.α-tocopherol reference substance

2.3 生育酚醋酸酯與游離α-生育酚對油脂氧化影響結果 不同濃度水平的α-生育酚與生育酚醋酸酯對多烯酸乙酯藥品性狀的影響見圖4。由圖4可知，與第1天樣品相比，第4天取樣時，加入1%、3%的生育酚醋酸酯的國內處方模擬組均發生明顯的色變；加入0.1%的α-生育酚的國外處方模擬組產生色變，但顏色淺于對照組和國內處方模擬組；加入0.2%的α-生育酚的國外處方模擬組顏色未產生色變。加入1%、3%的生育酚醋酸酯的國內處方模擬組在實驗中色變與對照組比沒有明顯的區別。

不同濃度水平的α-生育酚與生育酚醋酸酯對多烯酸乙酯藥品過氧化值的影響見圖5。由圖5可知，國內處方模擬組和對照組樣品在實驗周期內的過氧化值一直處于上升趨勢，與以上3組樣品過氧化值變化相比，國外處方模擬組樣品中的α-生育酚的存在減緩了樣品氧化過程。

圖4 不同濃度α-生育酚與生育酚醋酸酯對外觀性狀的影響Fig.4 The effect of α-tocopherol and tocopherol acetate with different concentrations on appearance

圖5 不同濃度α-生育酚與生育酚醋酸酯對過氧化值的影響Fig.5 The effect of α-tocopherol and tocopherol acetate with different concentrations on peroxide value

3 討論

3.1 影響藥物氧化穩定性評價指標的選擇[5]油脂的氧化過程是一個比較復雜的過程。油脂的自動氧化，最先經過誘導期，在此階段，主要生產第一級產物過氧化物；其次經過氧化期，在這一階段，主要生成第二級氧化產物，如醇類及羧基化合物，并進一步分解物羧酸，在此期間可以檢測到過氧化值、揮發性反應物及氧吸收顯著增加[6-8]，在此階段，反應會比較迅速，且油脂開始劣變，此為誘導期終點。油脂的誘導期到氧化期之間時間的長短表明油脂抗氧化能力的強弱，即氧化穩定性的好壞。油脂的穩定性的評價指標種類較多，有過氧化值、脂肪酸組成、酸值等。其中，過氧化值、甲氧基苯胺值由于具有適用范圍廣，測定方法簡單的優點。因此在評價油脂類藥物的氧化穩定性研究中被廣泛應用，本研究中采用過氧化值及甲氧基苯胺值作為評價指標。

3.2 藥物氧化穩定性的影響因素 與一般的魚油保健品所不同的是，多烯酸乙酯軟膠囊中不飽和脂肪酸的二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯的含量高達80%以上，因此作為藥品使用的多烯酸乙酯更容易發生氧化。因此在藥品的提取、精制、運輸和貯藏以及進一步加工過程中，需要隨時防止氧化。空氣中氧氣的存在是氧化的主要條件，紫外線、高溫甚至金屬離子是促進氧化的因素，都應盡量避免。在其他影響因素不能改變的條件下，添加合適抗氧化劑能夠適當減緩多不飽和脂肪酸的氧化，但抗氧化的機理因抗氧化劑的不同而異。若由于抗氧化劑的使用不當，會造成抗氧化效果不佳，甚至比不加更壞。因此，不同企業由于原料的提純工藝、中間體的貯存及運輸條件有所不同，應根據各自工藝條件摸索適合的抗氧化劑。

氧化穩定性是ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類藥物質量控制所面臨的巨大挑戰之一。本文采用HPLC-UV方法對國內外藥品中抗氧化劑維生素E結構形式進行測定，并比較了以醋酸酯和游離態2種結構形式的維生素E的抗氧化作用。研究結果表明國內藥品中的抗氧化劑主要是以生育酚醋酸酯形式存在的維生素E，其抗氧化作用不如國外同類品種中使用的抗氧化劑α-生育酚的效果佳，初步作出了抗氧化劑的使用不當可能是國內藥品的氧化穩定性與國外同類產品存在差距的判斷，但由于已有的HPLC-UV方法靈敏度很低，無法準確測定國產樣品中α-生育酚的含量，為進一步確證該項判斷，本研究還建立了高效液相色譜-熒光檢測法考察我國藥品中添加的生育酚的種類和水平，該項研究結果將后續報道。綜合以上研究，建議國內的多烯酸乙酯軟膠囊生產企業開展該品種的抗氧化劑研究，進一步改進產品處方，以提高該類品種的氧化穩定性。

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(編校：王冬梅)

Study on antioxidant of ethyl polyenoate soft capsules

REN Li-ping1, LIN Juan2, MIN Qi3, LIAO Hai-ming1, YANG Hong-miao1, FAN Hui-hong1Δ

( 1.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 2.Xinjiang Uyghur Autonomous Region Institute for Food and Drug Control, Urumqi 830004, China; 3.Liaoning Jinzhou City Institute for Food and Drug Control, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo analyze peroxide value and anisidine value of ethyl polyenoate soft capsules and imported drugs and evaluate the oxidative stability. MethodsThe analysis was carried out on a TSK gel ODS-100 V(250 mm×4.6 mm,5 μm)with methanol-water(98:2，V/V)as the mobile phase to determine the structure of the vitamin E as antioxidant.The influence on the antioxidation effect of tocopherol acetate and α-tocopherol as excipient in omega-3 polyunsaturated fatty acid ethyl ester drugs was evaluated.ResultsThe structure of vitamin E as antioxidant in domestic drugs was acetate, while vitamin E as excipient in foreign drugs had the structure of α-tocopherol monomer.As antioxidant, the antioxidation effect of tocopherol acetate was better than α-tocopherol.The structure of vitamin E had a direct impact on the antioxidation effect of omega-3 polyunsaturated fatty acid ethyl ester drugs.ConclusionThe studies provide the basis for evaluate rationality of antioxidant in ethyl polyenoate soft capsules scientifically, which has positive significance for controlling the quality of the drug effectively.

ethyl polyenoate soft capsules; antioxidant; antioxidation effect; vitamin E; α-tocopherol; tocopherol acetate

任麗萍，女，碩士，副主任藥師，研究方向：生化藥品質量研究，E-mail：pplucky@126.com；范慧紅，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥品質量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

R927.2

A

1005-1678(2015)05-0174-03