喀斯特山區不同種植方式下煙田土壤微生物特征分析

黃化剛，肖謀良，梁士楚，張龍，肖和友，代園鳳，申燕*，蘇以榮，陳香碧

1.貴州省煙草公司畢節市公司，貴州省畢節市天河路116號 551700

2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室，長沙市芙蓉區遠大二路644號 410125

3.廣西師范大學生命科學學院，廣西壯族自治區桂林市七星區育才路15號 541004

喀斯特山區不同種植方式下煙田土壤微生物特征分析

黃化剛1，肖謀良2，3，梁士楚3，張龍1，肖和友2，代園鳳1，申燕*1，蘇以榮2，陳香碧2

1.貴州省煙草公司畢節市公司，貴州省畢節市天河路116號 551700

2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室，長沙市芙蓉區遠大二路644號 410125

3.廣西師范大學生命科學學院，廣西壯族自治區桂林市七星區育才路15號 541004

為明確喀斯特山區烤煙由常規種植轉為有機種植方式后煙田土壤微生物特征的變化，在貴州省金沙縣以常規種植方式為對照，選擇連續3年進行有機種植的煙田為試驗對象，研究了兩種種植方式下煙田土壤基本性質、細菌和真菌群落結構特征及其關鍵影響因素。結果表明，喀斯特山區烤煙種植方式由常規種植轉換為有機種植后，土壤有機質、微生物生物量碳顯著增加，而全氮、全鉀、速效磷、速效鉀等養分含量（質量分數）顯著降低（p＜0.05）；兩種種植方式下，土壤微生物豐富度和多樣性均以細菌高于真菌，土壤細菌和真菌多樣性以及在“門”分類上的群落結構差異不大，細菌以變形菌門、放線菌門、酸桿菌門占優勢（54.2%～62.0%），真菌以子囊菌門占絕對優勢（74.4%）；常規種植轉為有機種植方式后，煙田土壤有益微生物類群數量增加。喀斯特山區煙田土壤微生物群落結構主要受土壤有機質、養分和容重的影響。

喀斯特山區；烤煙；有機種植；常規種植；土壤微生物；細菌；真菌

貴州有機煙葉產業配套發展模式主要有“有機高粱—有機煙葉”和“有機水稻—有機煙葉”兩種。該模式參照有機農業生產標準，在烤煙種植過程中禁止使用化學合成農藥、生長調節劑等物質，主要施入有機肥提供烤煙生長所需養分［1］，改變了烤煙常規種植中主要施入無機肥來提供養分的生產模式，生產的煙葉化學品質和外觀品質均得到較大提高，但在有機種植方式下植煙土壤性質是否發生變化尚不清楚。而微生物參與土壤有機質分解、腐殖質形成、養分轉化和循環等過程，對植物養分供應起決定作用，土壤微生物多樣性及其群落結構是評價土壤品質的重要指標［2-3］。目前，針對有機種植方式下煙田土壤微生物特征的研究較少，其中多為運用平板培養法計算微生物數量及多樣性［4-10］，利用分子生物學方法研究微生物群落及其多樣性卻少見報道［11］。平板培養法可以較為直觀地統計微生物的數量，但土壤中多數微生物為不可培養型，平板培養法無法檢測到。因此，運用基因克隆和末端限制性片段長度多態性（TRFLP）技術，擬從土壤微生物及其理化性質方面，揭示喀斯特典型山區烤煙由常規種植轉變為有機種植后的綜合效果及影響土壤微生物變化的原因，為有機烤煙生產的可持續發展提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況及樣品采集

研究區位于貴州省畢節市金沙縣，處于中國西南喀斯特典型山區。金沙縣地跨東經105°47′～106°44′，北緯27°07′～27°46′，海拔1 100～1 400 m，屬北亞熱帶濕潤季風氣候。年均氣溫12.5～16.5℃，晝夜溫差大，年均降雨量1 050 mm，年均日照數1 098 h。植煙區土壤主要為石灰土、黃壤、粗骨土、紫色土和潮土。

以金沙縣通過南京國環有機產品認證中心（OFDC）有機認證區域的有機種植方式和常規種植方式的煙田為對象，烤煙品種為K326。有機種植方式所用肥料配方為500 kg/667 m2農家肥（牛糞∶玉米秸稈=1∶1，堆漚而成）、80 kg菜籽餅、100 kg商品有機肥（貴州光勛生物肥業有限公司生產，以干基計，有機質含量≥74%，N∶P2O5∶K2O=5.4%∶1.8%∶2.6%），20 kg硫酸鉀鎂肥（K2O≥25%，Mg≥5%）。所有肥料全氮量約6～7 kg（N∶P2O5∶K2O=1∶0.6∶1.5），全部條施后起壟，在4月中下旬采用井窖式移栽煙苗后全生育期蓋膜，種植密度為1 200株/667 m2。移栽后7～10 d施用沼液或清糞水提苗肥1次，全程不使用任何化學合成農藥、生長調節劑等。常規種植方式為施用農家肥300 kg/667 m2（同上）和復合肥60 kg/667 m2（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶25），采用條施與窩施相結合的方法，移栽前條施農家肥300 kg/667 m2、復合肥40 kg/667 m2后起壟，剩余的肥料移栽時兌水施入。

于2013年6月28日在下部葉成熟采摘前，在金沙縣巖上鄉選擇有機種植方式（連續3年“有機高粱—有機煙葉”種植模式）和常規種植方式種植的煙田各6塊，每塊煙田面積不低于3 335 m2。采用“S”形多點法采集表層（0～20 cm）土壤樣品，混勻后按“四分法”分取約100 g立即置于冰盒中，帶回實驗室于-70℃冰箱中保存，用于土壤微生物群落分析；另取約500 g帶回實驗室于4℃冰箱中保存，用于微生物生物量分析；另取部分樣品自然風干后用于土壤基本理化性狀指標分析。同時，以環刀法采樣測定土壤容重。

1.2 土壤微生物群落結構分析

1.2.1 土壤微生物DNA提取

采用SDS-GITC-PEG法提取土壤微生物總DNA［12］，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小，用核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度（μg/μL）。

1.2.2 克隆文庫的構建

以土壤微生物總DNA為模板，用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）與519R（5′-GWATTACCGCGGCKGCTG-3′）擴增16S rDNA片段V1-V3區［13］。采用真菌用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）-3′與ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增18S rDNA基因ITS片段［14］。將同一施肥方式下6個重復的PCR產物取等體積混合后，用試劑盒（Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System，美國Promega公司）回收目的片段。以pGEM-T載體試劑盒（美國Promega公司）對回收的PCR產物分別進行克隆。從各克隆庫中隨機挑取150個白斑，通過菌液PCR擴增，篩選120～130個有預期片斷的陽性克隆進行基因測序（深圳華大基因科技有限公司檢測）。兩種施肥方式下篩選同樣的序列進行分析，即細菌序列各129條，真菌序列各117條。

1.2.3 末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）分析

隨機選擇每種種植方式下的4個重復，分別采用通用引物27F/519R和ITS1F/ITS4擴增細菌和真菌的rDNA片段，其中上游引物的5′端采用6-FAM熒光標記，并切膠回收。其PCR體系、擴增條件及切膠回收與構建克隆文庫所采用的步驟一致。分別采用限制性內切酶HinP1I和Alu I對細菌和真菌的PCR產物進行酶切，酶切產物由上海桑尼生物科技有限公司進行基因測序。

1.3 土壤理化指標測定

采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法［15］測定土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮；參照《土壤農化分析》［16］相關方法測定土壤其他理化指標。

1.4 數據分析

各克隆庫中的序列輸入EMBL-EBI網站（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2）中進行比對，根據相似性95%歸為一個操作單元（OTU，等同于“屬”分類），采用Estimate S Win9.1.0軟件和Excel 2010計算香農多樣性指數、辛普森指數和均勻度指數并繪制稀疏曲線；將序列輸入Ribosomal Database Project 11.3數據庫（https：//rdp.cme.msu. edu）中，按相似性為85%和80%分別確定“綱”和“門”的遺傳分類［17］。

T-RFLP數據參照Lukow等［18］的方法進行處理，并基于T-RFLP法得到微生物群落結構，采用Canoco 4.5軟件對土壤細菌和真菌群落結構的影響因子進行冗余分析（RDA）。采用SPSS 19.0軟件，以種植方式作為處理因子分別對煙田土壤基本理化性質進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 有機和常規種植方式下煙田土壤基本理化性質的變化

由表1可見，常規種植方式轉為有機種植方式后，煙田土壤有機質和微生物生物量碳顯著增加（p＜0.05或p＜0.01），全氮、全鉀、速效磷、速效鉀和容重均顯著下降（p＜0.05或p＜0.01），全磷、pH無顯著變化。

2.2 有機和常規種植方式下煙田土壤細菌和真菌的多樣性變化

細菌和真菌克隆庫的稀疏曲線（圖1）顯示，在“屬”水平上，對于細菌，隨機挑取129個克隆子還遠未達到平臺期，而真菌隨機挑取117個克隆子已基本達到平臺期。總體上克隆子數目清晰顯示了兩類微生物在兩種種植方式下的變化趨勢。

表1 有機和常規種植方式下土壤基本理化性質比較①Tab.1 Physicochemical soil properties under organic and conventional cultivation modes

由表2可見，有機種植和常規種植方式下，土壤微生物序列的OTU數量、香農多樣性和辛普森多樣性指數均為細菌明顯高于真菌。總體上，兩種種植方式下兩類微生物的多樣性差異不大。

圖1 有機和常規種植方式下土壤細菌和真菌克隆庫的稀疏曲線Fig.1Rarefaction curves of soil bacterial and fungal clone libraries under organic and conventional modes

表2 有機和常規種植方式下土壤細菌和真菌多樣性Tab.2Diversity of soil bacteria and fungi under organic and conventional modes

2.3 有機和常規種植方式下煙田土壤細菌和真菌群落結構的變化

由表3可見，有機和常規種植方式的土壤細菌在“門”分類上，分別有11和12類，且均以變形菌門、放線菌門、酸桿菌門占優勢，三者合計占總克隆庫的54.2%～62.0%。以上3個“門”類中，又以變形菌門占絕對優勢，其在有機和常規種植的土壤中分別占23.2%和27.1%。變形菌門中：有機種植方式以α-變形菌門占優勢，其次為β-變形菌門，γ-變形菌門和δ-變形菌門分別只占克隆庫的3.8%和3.1%；常規種植方式以β-變形菌門和γ-變形菌門占優勢，α-變形菌門和δ-變形菌門分別只占克隆庫的5.4%和4.7%。兩種種植方式下放線菌門和酸桿菌門占克隆庫的比例差異不大。

兩種種植方式下，土壤中芽單胞菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、疣微菌門占克隆庫的比例為1.6%～9.3%，且均以有機種植大于常規種植方式。其中，有機種植的芽單胞菌門比例明顯高于常規種植的。擬桿菌門和目前尚無法分類的細菌以常規種植大于有機種植方式。兩種種植方式下均檢測到少量屬于擬桿菌門的細菌。此外，在有機種植方式的土壤中檢測到少量常規種植方式中未檢測到的硝化螺菌門和TM7類群。同時，在常規種植方式的土壤中也檢測到少量有機種植方式中未檢測到的厚壁菌門、WS3和Armatimonadetes。

表3 有機和常規種植方式下土壤細菌群落在“門”上的分類Tab.3Classification of soil bacterial community at phylum level under organic and conventional modes

由表4可見，有機和常規種植方式的土壤真菌在“門”分類上，分別有4和5類，且均以子囊菌門占絕對優勢。在子囊菌門中，兩種種植方式各有6個“綱”，但兩種方式下這些“綱”占克隆庫的比例差異較大，占子囊菌門絕對優勢的糞殼菌綱有機種植明顯高于常規種植方式；座囊菌綱在兩種種植方式下差異不大，占克隆庫的6.0%～5.1%；散囊菌綱和錘舌菌綱以常規種植明顯高于有機種植方式；有機種植方式下檢測到少量屬于盤菌綱的真菌，常規種植方式下檢測到少量酵母綱的真菌；此外，有機和常規種植方式下子囊菌門中有部分克隆子無法歸屬到“綱”。

表4 有機和常規種植方式下土壤真菌在“門”和“綱”上的分類Tab.4 Classification of soil fungal community at phylum and class levels under organic and conventional modes

接合菌門和擔子菌門在兩種種植方式的煙田土壤中分別占克隆庫的13.7%～14.5%和7.7%～8.6%，且在兩種煙田土壤中所占比例差異不大。在常規種植方式下檢測到少量屬于壺菌門的真菌。同時，兩種種植方式下均有少量克隆子無法鑒定到“門”。

2.4 有機和常規種植方式下煙田土壤細菌和真菌群落結構的影響因素

由圖2可見，土壤微生物群落的變異較大，尤其是細菌群落，但總體上有機種植方式的微生物群落聚類能與常規種植明顯分開。研究區土壤微生物群落結構與土壤基本理化性質密切相關，且兩種種植方式下，煙田土壤細菌和真菌群落結構與土壤環境條件的關系一致，即有機種植方式土壤微生物群落結構主要與微生物生物量碳（MBC）、有機碳（SOC）和全鉀（TK）相關，常規種植方式則主要與全氮（TN）、有效氮（AN）、全磷（TP）、速效磷（AP）、速效鉀（AK）、微生物生物量氮（MBN）以及土壤容重（Bulk density）相關。

圖2 基于T-RFLP的土壤細菌（A）和真菌（B）群落結構與環境因子的冗余分析Fig.2Redundant analysis between soil bacteria（A）or fungi（B）and environmental factors based on the T-RFLP data

3 結論與討論

在貴州喀斯特山區，常規和有機種植方式下土壤微生物在“門”或“綱”分類上的群落結構基本一致，細菌均以變形菌門、放線菌門和酸桿菌門占優勢，真菌子囊菌門占絕對優勢。常規種植轉為有機種植方式后，各“門”分類的微生物比例以及土壤細菌和真菌多樣性差異不大，但土壤有益微生物類群增加，具體表現為：4個亞門變形菌分布比例關系由β-變形菌門＞γ-變形菌門＞α-變形菌門＞δ-變形菌門轉變為α-變形菌門＞β-變形菌門＞γ-變形菌門＞δ-變形菌門，這是土壤細菌群落結構正逐步向良好方向轉變的一種表現［5］。同時，常規種植向有機種植方式轉變后，土壤中出現了有益微生物如土壤氮素的硝化螺旋菌。研究區煙田土壤中均發現少量生防菌，如木霉菌（Trichoderma）和鐮刀菌屬（Fusarium），這些生防菌在土壤中容易形成優勢種群，對土壤中許多病原菌具有拮抗生防作用［19-20］，這為進一步研究煙草根際土傳病害防治奠定了基礎。然而，研究區煙田土壤中還發現少數青霉菌（Penicillium）和曲霉菌（Aspergillus）。這類真菌中的某些種和亞種是植物病原菌，能產生毒素，屬于烤煙病害的真菌類群［21］，因此該區烤煙生產中需注意防治這些病原菌。

通常，農田土壤中細菌數量高于真菌［22-23］。本試驗中常規種植和有機種植方式下烤煙土壤微生物（細菌和真菌）多樣性均為細菌顯著高于真菌。大部分研究表明，與傳統施肥方式相比，有機施肥方式可顯著增加土壤微生物數量和多樣性［24-25］。然而，該煙區由常規種植轉為有機種植后，土壤細菌和真菌多樣性無顯著變化。其原因，一方面根據施入肥料的配方，種植方式從常規轉變為有機種植后，施入大量有機肥造成施入肥料的碳氮比大大提高；土壤有機質和微生物生物量碳均極顯著增加，而土壤全氮和堿解氮顯著降低，微生物生物量氮也略有降低，造成土壤中碳氮比增加，加劇了微生物礦化有機質所釋放的有效氮和微生物自身同化有機氮的不平衡，導致可被植物吸收利用的有效氮不足［15］，因此應根據烤煙需肥規律和土壤養分供應情況，調整施入有機肥的養分比例。另一方面，微生物群落的恢復是一個漫長的過程［26］，喀斯特山區烤煙由常規種植轉為有機種植方式的年限僅為3年，種植方式的轉變對土壤微生物多樣性的影響可能需要更長時間才能表現出來。

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責任編輯 董志堅

Characteristic of Soil Microorganism in Karst Mountain Areas Under Organic and Conventional Cultural Practices

HUANG Huagang1,XIAO Mouliang2,3,LIANG Shichu3,ZHANG Long1,XIAO Heyou2,DAI Yuanfeng1, SHEN Yan*1,SU Yirong2,and CHEN Xiangbi2
1.Bijie Tobacco Company of Guizhou Province,Bijie 551700,Guizhou,China
2.Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region,Institute of Subtropical Agriculture,Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125,China
3.College of Life Science,Guangxi Normal University,Guilin 541004,Guangxi,China

To investigate the changes of soil microbial characteristics in Karst mountain areas caused by the transformation from conventional cultivation into organic cultivation,an experiment was carried out in tobacco fields on which organic cultivation had been conducted for three consecutive years in Jinsha County,Guizhou Province by taking conventional cultivation as the control.The basic soil properties, bacterial and fungal community structure and key influencing factors were studied.The results showedthat:comparing with conventional cultivation,the contents of soil organic matter and microbial biomass carbon significantly increased,the contents of soil nutrients（total nitrogen,total potassium,available phosphorus，available potassium,etc）significantly decreased（p＜0.05）,and the amount of beneficial microorganism groups increased as a result of organic cultivation.The richness and diversity of bacteria were higher than those of fungi were common to both cultural practices.The diversities and microbial communities at phylum level were not obviously different between conventional and organic cultural practices.Bacterial communities dominated by Proteobacteria,Actinobacteria and Acidobacteria（accounted for 54.2%-62.0%）,and fungal communities dominated by Ascomycota（accounted for 74.4%）.The microbial communities in Karst mountain areas were mainly influenced by the organic matter,nutrient and bulk density in soil.

Karst mountain area；Flue-cured tobacco；Organic cultivation；Conventional cultivation；Soil microorganism；Bacterium；Fungus

S572.61

A

1002-0861（2015）11-0016-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151104

2014-11-21

2015-05-19

貴州省煙草公司畢節市公司科技項目“畢節市有機生產方式下煙田土壤生態特征研究”（BJYC-201301）；中國科學院西部之光人才培養計劃西部博士資助項目“喀斯特典型農田土壤木質素降解特征與微生物驅動機制”（Y423035010）。

黃化剛（1982—），博士，高級農藝師，主要從事土壤生態修復研究。E-mail:huanghg82@gmail.com；*

申燕，E-mail：syan20081013@126.com

黃化剛，肖謀良，梁士楚，等.喀斯特山區不同種植方式下煙田土壤微生物特征分析［J］.煙草科技，2015，48（11）：16-21.

HUANG Huagang，XIAO Mouliang，LIANG Shichu，et al.Characteristic of soil microorganism in Karst mountain areas under organic and conventional cultural practices［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：16-21.