干酪乳桿菌發酵廢棄煙梗制備L-乳酸操作參數的優化

朱大恒，楊增光，張可可，丁騰閣，張綿綿，鄒春陽，閆曉靜，王婧芬，賈英勃，席宇

鄭州大學生命科學學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道100號 450001

干酪乳桿菌發酵廢棄煙梗制備L-乳酸操作參數的優化

朱大恒，楊增光，張可可，丁騰閣，張綿綿，鄒春陽，閆曉靜，王婧芬，賈英勃，席宇*

鄭州大學生命科學學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道100號 450001

采用單因子試驗研究了6個操作參數（發酵方式、發酵時間、裝載量、接種量、發酵溫度及初始pH）對干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）XJL發酵廢棄煙梗制備L-乳酸的影響。根據單因素試驗結果，選取接種量、裝載量、初始pH及發酵溫度進行四因素三水平正交試驗。結果表明：①初始pH、接種量和裝載量對L-乳酸的產率影響顯著。②最優操作參數組合為初始pH 7.0、裝載量120/250 mL（250 mL的錐形瓶裝載120 mL的廢棄煙梗提取液）、接種量（種子液的移入體積與接種后培養液體積的比例）7.5%、37℃靜置培養48 h；此條件下，廢棄煙梗發酵產L-乳酸可達157.50 g/kg。

乳桿菌；L-乳酸；煙梗；操作參數；發酵

Keywords:Lactobacillus；L-lactic acid；Tobacco stem；Operational parameter；Fermentation

乳酸作為一種重要的化工原料，可通過生物或化學途徑轉化成一系列具有重要用途的衍生物，如乳酸酯、丙酮酸、丙烯酸和聚乳酸（PLA）等［1-2］。聚乳酸及其改性產品是可生物降解的新型高分子材料，在農、林、漁、工、醫等領域應用廣泛［3］。在煙草行業，添加乳酸能夠有效降低卷煙煙氣的pH，提高凝聚性和舒適性，改善卷煙的抽吸品質［4-5］。目前，微生物發酵法是生產乳酸的重要途徑；隨著市場需求量的日益擴大，尋求工農業廢棄物等廉價發酵底物，降低發酵成本已成為乳酸工業的一個研究熱點［6-9］。

煙梗是煙葉加工過程中產生的廢棄物［10］，其中僅有40%左右通過造紙法再造煙葉等技術被有效利用［11］，大量的廢棄煙梗造成了資源浪費和環境污染。煙梗中含有大量水溶性糖類和硝酸鹽等［12-13］，因此對廢棄煙梗進行資源化利用具有重要意義。目前，以廢棄煙梗為主要原料制備活性炭［14-15］、木質陶瓷［16-17］、吸附劑［18-19］及人工草炭［20］等已有報道，但上述研究主要集中在對廢棄煙梗中質量分數不到20%的粗纖維組分的利用方面［12］，綜合利用程度不高。廢棄煙梗中的可溶性成分可作為廉價底物通過微生物發酵制備生物殺蟲劑［21］、酵母菌［22］、真菌吸附劑［23］等。朱大恒等［24-26］分離的一株干酪乳桿菌XJL能夠發酵廢棄煙梗制備L-乳酸，發酵過程中的操作參數可對結果產生重要影響。因此，對影響XJL發酵制備L-乳酸的6個主要操作參數進行了優化，獲得了發酵的最佳操作參數組合，以期為L-乳酸的規模化制備提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

廢棄煙梗由河南天昌煙草國際有限公司提供，長度為0.2～5.0 cm，直徑為0.15～0.50 cm。

瓊脂粉購于美國Sanland公司，其余試劑均為國產分析純。

SHZ-D循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；JJ300電子天平（感量0.001 g，常熟雙杰儀器廠）；PHS-3C pH計（上海鵬順科學儀器有限公司）；HZQ-X100恒溫搖床（太倉市實驗設備廠）；XFH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫療器械有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；GHP-9160隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；SBA-40D生物分析傳感儀（山東省科學院生物研究所）。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培養基

干酪乳桿菌XJL為本實驗室分離鑒定的一株可發酵廢棄煙梗產L-乳酸的菌株［24］，XJL的保存和活化均采用MRS固體培養基［27］，瓊脂的質量分數為1.8%。L-乳酸的發酵制備采用廢棄煙梗提取液（Tobacco stem extraction,TSE）培養基，其制備方法參考文獻［24］進行，培養基滅菌條件均為115℃滅菌20 min。TSE的初始pH采用4 mol/L的鹽酸溶液或5 mol/L的氫氧化鈉溶液進行調節，采用精密pH計進行測量。

1.2.2 L-乳酸的發酵制備及操作參數的優化

采用在250 mL錐形瓶中發酵的方法，研究不同的發酵方式、發酵時間、裝載量、接種量，發酵溫度及初始pH對L-乳酸產率的影響。將XJL平板培養物接種到含100 mL TSE培養液（pH 5.5）的250 mL錐形瓶中，在37℃和180 r/min的條件下培養18 h，培養物作為種子液進行發酵試驗。以溫度37℃、接種量5%（移入種子液的體積和接種后培養液體積的比例）、裝載量100/250 mL（250 mL的錐形瓶裝載100 mL的TSE）、發酵時間48 h及初始pH 5.5靜置發酵為基礎試驗條件，通過每次改變一個參數水平分別進行單因子試驗。根據單因子實驗結果選取對L-乳酸產率有較大影響的操作參數進行正交試驗，通過直觀分析和方差分析確定最佳參數條件。單因子及正交試驗均設置2次重復，結果取平均值。

1.2.3 發酵液中L-乳酸濃度的測定及產率的計算

干酪乳桿菌XJL發酵僅產生L-乳酸，因此發酵后TSE中L-乳酸的濃度（g/L）采用生物分析傳感儀進行測定。考慮到本研究的最終目的是資源化利用廢棄煙梗，目前主要集中在如何提高發酵液中L-乳酸的濃度方面，尚未開展對發酵液中L-乳酸的提取工作，因此試驗結果采用煙梗發酵制備L-乳酸的產率（g/kg）來表示。根據煙梗質量和水體積的比例為1∶10（kg∶L）時，每千克煙梗可制備7.5 L的TSE，因此每千克煙梗發酵后L-乳酸的產率（g/kg）即為發酵后TSE中L-乳酸濃度（g/L）的7.5倍。

1.2.4 數據分析

試驗數據采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 操作參數對L-乳酸產率的影響

2.1.1 發酵方式

干酪乳桿菌是一種兼性厭氧菌，采用靜置和振蕩兩種培養方式來比較發酵方式對產酸的影響，結果見圖1。在靜置培養條件下，L-乳酸的產率可達131.25 g/kg。振蕩培養對產酸的影響較大，振蕩轉速為60 r/min時產率為127.50 g/kg，與靜置培養時相差不大；隨著轉速的增大，產酸量明顯下降，轉速為120 r/min時，產率為108.75 g/kg。轉速與發酵體系的溶氧有關，轉速越高，溶氧相對越高［28］。試驗結果表明，低溶氧條件下更有利于L-乳酸的產生。與振蕩培養相比，靜置培養不僅節約能耗，還可提高產酸量。因此以下試驗均采用靜置方式進行發酵。

圖1 發酵方式對L-乳酸產率的影響

2.1.2 發酵時間

L-乳酸的產生與發酵時間有顯著的關系。從圖2可看出，發酵6～30 h時，L-乳酸產率從41.25 g/kg增至120.00 g/kg。隨著TSE中糖的消耗及乳酸的累積，產酸速率顯著下降，繼續發酵至48 h時，L-乳酸的產率僅增加15.00 g/kg；發酵48 h后，產酸量基本保持不變，表明發酵達到終點，此時L-乳酸的產率為135.00 g/kg。縮短發酵周期是優化發酵過程中操作參數的重要目的之一，因此可通過菌種改良方法提高菌株的耐酸性或添加適當的中和劑來解除末端產物的抑制效應，縮短發酵周期。

圖2 發酵時間對L-乳酸產率的影響

2.1.3 發酵裝載量

裝載量是影響發酵體系溶氧量的另一個重要操作參數，裝載量越低，溶氧量相對就越高［29］。不同裝載量對發酵產酸的影響結果見圖3。在250 mL錐形瓶中，當裝載量為120～160 mL時產酸量相對最高，產率均為135.00 g/kg。當裝載量低于120 mL時產率逐漸降低，裝載量越低，產率越低，裝載量為60 mL時產率最低，為105.00 g/kg；當裝載量為180 mL時產率又略微降低。這可能由于溶氧過小，影響菌體初期的繁殖生長，導致菌體濃度過低，因此選擇合適的裝載量可以有效提高產酸量。

圖3 裝載量對L-乳酸產率的影響

2.1.4 發酵接種量

接種量對L-乳酸產率的影響見圖4。結果表明，接種量越大產率越高，當接種量在7.5%～12.5%時，L-乳酸的產率最高為135.00 g/kg；當接種量低于7.5%時，產酸量逐漸降低。這可能是由于XJL的延滯期過長造成的。然而，與12.5%的接種量相比，接種量為15%時的產酸量反而略微下降，這可能與發酵時過大的接種量導致發酵液中糖濃度略微降低有關。

圖4 接種量對L-乳酸產率的影響

2.1.5 發酵溫度

溫度是影響菌體生長和產酸的重要環境參數，適宜的溫度條件可以促進細胞的生長，提高發酵的產酸量。不同發酵溫度對L-乳酸產率的影響見圖5。在20～45℃范圍內菌株XJL均能正常生長產生L-乳酸，低于28℃或者高于42℃，產酸均明顯下降；最適宜產酸溫度范圍為35～40℃，37℃時產率最高，可達131.25 g/kg。這與文獻［26］報道的牛鏈球菌的最適宜產酸溫度為37℃一致。

圖5 溫度對L-乳酸產率的影響

2.1.6 初始pH

初始pH對L-乳酸產率的影響如圖6。從圖6可看出，在pH為4.5～7.5的范圍內，菌株XJL均能發酵產酸，產率的最大值為135.00 g/kg，對應的pH為6.5。這與文獻［8］報道的芽孢桿菌NL01的最適宜產酸pH為6.3比較接近。當pH小于5.5或大于6.5時，產酸量逐漸下降。這可能是由于該pH范圍內XJL菌體生長緩慢，對糖類利用率較低，導致發酵周期內產酸過低。

圖6 初始pH對L-乳酸產率的影響

2.2 正交試驗的直觀分析

通過對單因子試驗結果分析，選取發酵溫度、初始pH、接種量及裝載量4個對產酸影響較大的操作參數進行四因素三水平正交試驗。發酵溫度、初始pH和接種量正交試驗水平在單因子試驗的最高值附近選擇。考慮到下一步的放大試驗還需要補加營養成分及中和劑等操作，因此裝載量選擇80、100和120 mL 3個水平。試驗選用操作參數水平及試驗結果的直觀分析見表1。從直觀分析的極差R值可看出在試驗所選的水平范圍內4個操作參數對產酸影響的順序是：B＞C＞D＞A，即初始pH＞接種量＞裝載量＞發酵溫度，發酵產L-乳酸的最優組合為A2B3C3D3，即溫度37℃、初始pH 7.0、接種量7.5%和裝載量120/250 mL。

表1 煙梗發酵產L-乳酸正交試驗因素水平及試驗結果的直觀分析①

2.3 正交試驗結果的方差分析

正交試驗結果的方差分析見表2，操作參數B、C和D的P＜0.01，因此初始pH、接種量和裝載量對L-乳酸的產生均具有極顯著的影響。表1的9組試驗組合中沒有最優組合A2B3C3D3，因此選擇該組合進行追加試驗（n=2）。結果表明，在優化的操作參數條件下，以廢棄煙梗為唯一基質L-乳酸的最高產率可達157.50 g/kg。

表2 L-乳酸發酵正交試驗的方差分析

3 小結

①與振蕩發酵相比，靜置發酵產酸量相對較高，節約能耗。②初始pH、接種量和裝載量對L-乳酸產率有極顯著影響，最優產酸條件為：溫度37℃、pH 7.0、裝載量120/250 mL和接種量7.5%；在該條件下，L-乳酸的產率為157.50 g/kg。與前期的研究結果［24］相比，L-乳酸的產率提高10.14%。③干酪乳桿菌XJL發酵產酸的溫度范圍較廣，因此廢棄煙梗可為L-乳酸的規模化發酵制備提供一種廉價的潛在基質。

［1］高超，馬翠卿，許平.生物基乳酸生物轉化研究［J］.生物工程學報，2013（10）：1411-1420.

［2］XU Ke,XU Ping.Efficient production of L-lactic acid using co-feeding strategy based on cane molasses/ glucose carbon sources［J］.Bioresource Technology, 2014,153：23-29.

［3］朱忠泗，劉有才，林清泉.聚L-乳酸性能、制備及其用途最新進展［J］.化工新型材料，2013（10）：184-186.

［4］王文領，王寧，宋金勇，等.反相HPLC法同時測定煙草中的甲酸、乙酸和乳酸［J］.煙草科技，2008（6）：41-43.

［5］周博，張天棟，李賡，等.乳酸和乳酸鹽在卷煙保潤中的應用［J］.中國煙草學報，2011,17（6）：8-12.

［6］Sánchez C,Serrano L,Llano-Ponte R,et al.Bread residuesconversionintolacticacidbyalkaline hydrothermaltreatments［J］.ChemicalEngineering Journal,2014,250：326-330.

［7］于波，曾艷，姜旭，等.聚合級L-乳酸的非糧生物質發酵研究進展［J］.生物工程學報，2013，29（4）：411-421.

［8］OUYANG Jia,MA Rui,ZHENG Zhaojuan,et al.Open fermentative production of L-lactic acid by Bacillus sp. strain NL01 using lignocellulosic hydrolyzates as lowcost raw material［J］.Bioresource Technology,2013, 135：475-480.

［9］Ghaffar T,Irshad M,Anwar Z,et al.Recent trends in lactic acid biotechnology：A brief review on production to purification［J］.Journal of Radiation Research and Applied Sciences,2014,7（2）：222-229.

［10］YANGZixu,ZHANGShihong,LIULei,etal. Combustionbehavioursoftobaccostemina thermogravimetric analyser and a pilot-scale fluidized bed reactor［J］.Bioresource Technology,2012,110：595-602.

［11］ZI Wenhua,PENG Jinhui,ZHANG Xiaolong,et al. Optimization of waste tobacco stem expansion by microwaveradiationforbiomassmaterialusing responsesurfacemethodology［J］.Journalofthe Taiwan Institute of Chemical Engineers,2013,44（4）：678-685.

［12］Sung Y J,Seo Y B.Thermogravimetric study on stem biomassofNicotianatabacum［J］.Thermochimica Acta,2009,486（1/2）：1-4.

［13］孫平，湯朝起，王軍，等.煙梗人工醇化過程中主要化學成分的變化［J］.煙草科技，2014（4）：50-54.

［14］LI Wei,PENG Jinhui,ZHANG Libo,et al.Investigations on carbonization processes of plain tobacco stems and H3PO4-impregnatedtobaccostemsusedforthe preparation of activated carbons with H3PO4activation［J］.Industrial Crops and Products,2008,28（1）：73-80.

［15］LI Wei,ZHANG Libo,PENG Jinhui,et al.Preparation of high surface area activated carbons from tobacco stems with K2CO3activation using microwave radiation［J］.Industrial Crops and Products,2008,27（3）：341-347.

［16］ZHANG Libo,LI Wei,PENG Jinhui,et al.Raman spectroscopicinvestigationofthewoodceramics derived from carbonized tobacco stems/phenolic resin composite［J］.Materials&Design,2008,29（10）：2066-2071.

［17］LI Wei,ZHANG Libo,PENG Jinhui,et al.Effects of microwaveirradiationonthebasicpropertiesof woodceramics made from carbonized tobacco stems impregnated with phenolic resin［J］.Industrial Crops and Products,2008,28（2）：143-154.

［18］Ghosh R,Reddy D D.Tobacco stem ash as an adsorbent for removal of methylene blue from aqueous solution：equilibrium,kinetics,andmechanismof adsorption［J］.Water,Air,&Soil Pollution,2013,224（6）：1-12.

［19］LI Wei,ZHANG Libo,PENG Jinhui,et al.Tobacco stems as a low cost adsorbent for the removal of Pb（II）from wastewater：Equilibrium and kinetic studies［J］.Industrial Crops and Products,2008,28（3）：294-302.

［20］位輝琴，申永防，杜閱光，等.煙梗草炭在煙草漂浮育苗基質中的應用［J］.煙草科技，2013（9）：82-84.

［21］杜雷，趙高嶺，席宇，等.煙梗廢料固態發酵生產蘇云金芽孢桿菌的適宜條件篩選［J］.煙草科技，2011（12）：69-72.

［22］吉彥龍，席宇，李敏睿，等.廢棄煙梗發酵生產深紅酵母的工藝條件優化［J］.煙草科技，2013（1）：77-80.

［23］席宇，高明，郭東衡，等.廢棄煙梗發酵生產真菌吸附劑及其脫色作用［J］.煙草科技，2012（6）：72-75.

［24］朱大恒，張可可，陳彥好，等.乳桿菌發酵煙梗制備生物塑料前體物L-乳酸的研究［J］.煙草科技，2014（8）：78-81.

［25］Singla A,Verma D,Lal B,et al.Enrichment and optimization of anaerobic bacterial mixed culture for conversionofsyngastoethanol［J］.Bioresource Technology,2014,172：41-49.

［26］Yuwono S D,Kokugan T.Study of the effects of temperature and pH on lactic acid production from fresh cassava roots in tofu liquid waste by Streptococcus bovis［J］.Biochemical Engineering Journal,2008,40（1）：175-183.

［27］凌代文，東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業出版社，1999.

［28］毛勇，毛健，李華鐘，等.溶氧控制條件對雙孢菇發酵產胞外多糖的影響［J］.食品科學，2013,34（1）：155-159.

［29］孫波，徐寧.以玉米粉為原料L-乳酸高產菌株的選育和產酸條件的研究［J］.食品工業，2009（5）：6-8.

責任編輯 茹呈杰

Optimization of Operational Parameters for Preparation of L-lactic Acid by Fermentation of Waste Tobacco Stems withLactobacillus casei

ZHU Daheng,YANG Zengguang,ZHANG Keke,DING Tengge,ZHANG Mianmian,ZOU Chunyang, YAN Xiaojing,WANG Jingfen,JIA Yingbo,and XI Yu*
School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China

Monofactorial experiments were performed to study the effects of six operational parameters, including fermentation means,fermentation duration,loading capacity,inoculum size,temperature and initial pH,on the preparation of L-lactic acid by the fermentation of waste tobacco stems with Lactobacillus casei XJL.According to the results of monofactorial experiments,four factors（inoculum size,loading capacity,initial pH and temperature）were selected and orthogonally tested at three levels. The results showed that:1）Initial pH,inoculum size and loading capacity significantly affected the yield of L-lactic acid.2）The optimum operational parameters were initial pH 7.0,loading capacity 120/250 mL（120 mL tobacco stem extraction loaded in a conical flask of 250 mL）,inoculum size 7.5%（the volume ratio of transferred inoculant solution to total culture solution after inoculation）,static culture for 48 hours at 37℃;under the above conditions,the maximum yield of L-lactic acid reached 157.50 g/kg.

TS414

A

1002-0861（2015）11-0022-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151105

2014-10-16

2015-07-21

河南省高等學校重點科研項目“干酪乳桿菌XJL發酵廢棄煙梗水提取物產L-乳酸的響應面優化研究”（15B180020）；國家級大學生創新創業訓練計劃資助項目“干酪乳桿菌XJL發酵廢棄煙梗水提取物產L-乳酸的研究”（2015xjxm208）；河南省煙草公司科技項目“煙草基質有機酸發酵與資源利用生物工程”（HYKJ201125）。

朱大恒（1965—），博士，教授，主要從事微生物工程研究。E-mail:zhudaheng2000@aliyun.com.cn;*

席宇，E-mail:microxy@126.com

朱大恒，楊增光，張可可，等.干酪乳桿菌發酵廢棄煙梗制備L-乳酸操作參數的優化［J］.煙草科技，2015，48（11）：22-27.

ZHU Daheng，YANG Zengguang，ZHANG Keke，et al.Optimization of operational parameters for preparation of L-lactic acid by fermentation of waste tobacco stems with Lactobacillus casei［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：22-27.