正常產婦羊水、血漿蛋白質指紋圖譜分析的研究

朱斌 周堅 陳芳 黎麗紅 葉志海 夏魯全

基礎研究論著

正常產婦羊水、血漿蛋白質指紋圖譜分析的研究

朱斌 周堅 陳芳 黎麗紅 葉志海 夏魯全

目的比對羊水、血漿蛋白質指紋圖譜，尋找羊水特異性表達蛋白，為產科學的臨床研究提供分子依據。方法應用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜儀采用4種不同原理的蛋白芯片檢測了12名正常足月產婦的羊水、血漿蛋白質指紋圖譜。結果羊水和血漿標本分別測得蛋白信號(信噪比大于3)150個和250個。4種芯片檢出羊水特異性蛋白30個，相對分子質量為11 198、12705 Da的蛋白是比較確定的羊水特異性蛋白。結論羊水中存在特異性表達蛋白，其在妊娠相關生理、病理學中可能起重要作用。

羊水；血漿；蛋白質指紋圖譜

羊水對于胎兒的發育至關重要，羊水中蛋白可能與妊娠相關性疾病發生有關[1]。羊水和孕婦血漿中的蛋白質譜研究是尋找標志物的重要途徑。表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)是隨著蛋白組學興起而出現的新技術，是一種基于蛋白質芯片和質譜技術的蛋白質指紋圖譜分析平臺[2-7]。為尋找羊水特異性標志蛋白，本研究采用SELDI-TOF-MS分析12例正常足月產婦的羊水和血漿蛋白質組學，繪制并比對羊水和血漿蛋白質指紋圖譜，旨在為產科學領域的研究提供可能的分子依據。

材料與方法

一、標本來源

選擇產檢正常、足月擇期行剖宮產的12例產婦為研究對象。術中行羊膜腔穿刺獲得羊水標本，同時靜脈穿刺采集靜脈血5 ml，肝素抗凝，分離血漿后與羊水標本置-80℃凍存備用。

二、主要儀器與試劑

采用PBSⅡc型SELD1-TOF-MS質譜儀，WCX2離子交換型、IMC3金屬螯合型、50反相型和Goldchip型蛋白芯片均為美國Liphergen公司產品，實驗用水和試劑全部采用美國Sigma公司產品。

三、方法

血漿和羊水標本均采用相同的實驗方法，共完成12對樣品的檢測。為保證檢測的完整性和全面性，使樣品中不同性質的蛋白質均被吸附而可檢測，本研究采用4種不同原理的蛋白芯片，即WCX2離子交換型、IMC3金屬螯合型、H50反相型和Goldchip型蛋白芯片，均嚴格按照芯片說明書操作，檢測相對分子質量范圍1 000～180 000 Da。檢測獲得的血漿和羊水的蛋白質指紋圖譜用Ciphergen Protein Chip軟件校正分子量、總離子強度、篩選和標記信號，根據各信號的信息進行蛋白質組學分析[8-9]。

結 果

一、羊水特異性表達蛋白質指標圖譜及分子量

羊水和血漿標本分別測得蛋白信號(信噪比大于3)150個和250個。4種芯片檢出羊水特異性的蛋白共計30個(圖1)。其中，相對分子質量為11 198、12 705 Da的2種蛋白是比較確定的羊水特異性蛋白。

圖1 4種蛋白芯片測得的羊水特異性表達蛋白質結果

上方：血清檢測結果；下方：羊水檢測結果；A～E：WCXZ交換型芯片結果，所標注的相對分子質量依次分別為3 720、3 737、3 925、5 392、2 432、5 518、5 605、5 810、5 880、7 362、7 475、7 931、9 972、10 108、11 022、11 062、11 198、11 953、12 705、14 704、14 918、17 118、17 453 Da；F、G：IMC3金屬螯合型芯片結果，所標注的相對分子質量依次分別為3 449、10 839、11 204、11 307、12 693 Da；H、I：H50反相型芯片結果，所標注的相對分子質量依次分別為7 524、7 975 Da；J：GoldChip金芯片結果，所標注的相對分子質量依次分別為10 893、11 780、14 733 Da

二、4種芯片在羊水特異性蛋白的檢測結果

30種羊水特異性蛋白中，WCX2交換型芯片檢出38種(95%)，IMC3金屬螯合型芯片檢出12種(30%)，H50反相芯片檢出11種(28%)，GoldChip檢出9種(23%)。

表1 4種芯片檢測結果的比較

注： +，僅存在羊水中；+-，僅存在羊水標本中且并非12份羊水標本中均有；-，羊水和血漿樣品均存在；×，未檢測到；由于使用H50芯片和GoldChip金芯片做檢測時，樣品沒有用尿素做預處理，同一個蛋白在H50芯片和GoldChip芯片上檢測到的分子量較在WCX2和IMC3芯片上檢測到的相對分子質量大40～60 Da，本表相對分子質量以WCX2和IMC3上測得的為準。

討 論

根據質譜技術的原理，蛋白信號在橫軸上的位置及強度分別與蛋白的相對分子質量及蛋白含量有著對應關系。因此，蛋白芯片上出現蛋白信號即說明存在相應分子蛋白，并且可以判斷該蛋白的含量。由此，我們判斷某個信號是否具羊水特異性的標準是：羊水中的信號強度與血清中的信號強度比值大于10。本研究在羊水中測得蛋白信號約150個，在血清中測得蛋白信號約250個。此外，本研究中所用的4種蛋白芯片分別依據蛋白質的4種不同屬性進行檢測，故任一芯片上出現羊水特異性信號即認為此信號對應的蛋白是羊水特異性蛋白。通過綜合分析4種類型芯片的蛋白信號結果，本研究最后認定在4種類型芯片上表現出羊水特異性的蛋白共計30個，其相對分子質量主要集中在7 000～18 000 Da。

同一蛋白在不同類型芯片上可有不同的差異，這是由蛋白自身的性質和在標本中的含量決定的，譬如11 953、14 704、14 918 Da蛋白在WCX2芯片上表現出有無的差異，在IMC3芯片上表現不出有無的差異，而僅有強度的差別，這說明該類蛋白具有較強的親金屬離子性質，在血清和羊水中的含量有較大差異。

對于4類原理不同的芯片，可以認為在H50和GoldChip芯片上獲得的是標本中蛋白的天然情況，在WCX2和IMC3芯片獲得的是樣品中蛋白的部分變性增溶后的情況。在WCX2、IMC3、H50芯片上檢測到的是選擇性結合的蛋白，信號的強度與蛋白的性質和含量有關，在GoldChip芯片上檢測到的為非選擇性結合的蛋白，信號的強度僅與蛋白含量有關，在WCX2芯片上檢出3 720～5 810 Da的8個蛋白，在其他芯片上并未檢出，這是因為使用WCX2芯片時，樣品在預處理過程中使用了還原劑打開二硫鍵。

根據各芯片提供的信號判斷，在各類芯片上表現出羊水特異性的蛋白大多不是羊水特有的，相對血漿而言，羊水中有更高的濃度。綜合分析篩選出的30個蛋白在4種芯片上的信號情況，篩選出未在血清檢測到(即沒有“-”信號)且能被更多種類蛋白芯片檢測到(即“+”更多)的蛋白，結果顯示相對分子質量為11 198、12 705 Da是比較確定的羊水特異性蛋白，但血漿中是否完全沒有此類蛋白有待進一步研究。

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(本文編輯：林燕薇)

Analysisoffingerprintpatternsofamnioticfluidandplasmaproteinsinhealthypregnantwomen

ZhuBin,ZhouJian,ChenFang,LiLihong,YeZhihai,XiaLuquan.

DepartmentofGynecologicalOncolagy,HexianMemorialHospitalPanyu,Guangzhou511400,China

,ZhuBin,E-mail：2547695010@qq.com

ObjectiveTo explore the proteins specifically-expressed in the amniotic fluid (AF) by comparing the fingerprint patterns of in the AF and plasma proteins, aiming to provide molecular evidence for obstetrics research.MethodsSurface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) with four different protein-chips was utilized to investigate the fingerprint patterns of AF and plasma proteins from 12 healthy full-term pregnant women.ResultsIn total, 150 protein signals (signal-to-noise ratio>3) were detected in the AF and 250 in the plasma. Thirty proteins were detected specifically expressed in the AF using four types of protein-chips. The proteins with a molecular weight of 11198 Da and 12705 Da were confirmed to be specifically expressed in the AF.ConclusionThe AF contains specifically-expressed proteins, which probably play a vital role in the physiological and pathological progresses during pregnancy.

Amniotic fluid; Plasma; Protein fingerprint pattern

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.006

廣東省科技廳社會發展領域科技計劃項目(2010B031600179)

511400 廣州，南方醫科大學附屬何賢紀念醫院婦產科(朱斌，周堅，陳芳，黎麗紅);519080 珠海，百奧生物工程有限公司(葉志海，夏魯全)

，朱斌，E-mail：2547695010@qq.com

2015-03-22)