CRP+1444 C/T基因多態性與子宮內膜癌的相關性研究

王麗娟 巴音吉力 盧淮武 李晶 林仲秋

臨床研究論著

CRP+1444 C/T基因多態性與子宮內膜癌的相關性研究

王麗娟 巴音吉力 盧淮武 李晶 林仲秋

目的探討CRP+1444C/T基因多態性與子宮內膜癌(EC)的相關性。方法選擇203例EC患者(EC組)和同期健康體檢者203名(對照組)，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RELP)方法檢測CRP+1444C/T基因多態性，并結合血清超敏CRP(hsCRP)水平及其他臨床資料進行分析。結果EC組的血清hsCRP高于對照組(P<0.05)，2組的CRP+1444C/T基因型和等位基因的分布相近，比較差異無統計學意義(P>0.05)。與子宮內膜癌BMI<25 kg/m2(正常)者相比， BMI≥25 kg/m2(超重)者CC基因型及C等位基因頻率較高(P<0.05)；且超重者CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組(P<0.05)。結論CRP+1444C/T基因多態性可能和包括胰島素抵抗以及炎癥因子在內的某些機制共同作用，影響子宮內膜癌的發病風險。

C-反應蛋白；基因多態性；子宮內膜癌

子宮內膜癌(EC)的發生、發展與多種代謝異常有關，這些代謝異常與炎癥之間關系密切[1]。CRP是一項敏感的反映機體炎癥反應的標志物。目前認為，血清CRP水平是由生理因素和遺傳因素相互作用、共同影響的結果。Carlson等(2005年)報道，CRP基因變異對血清CRP水平的影響占35%～50%。然而，目前關于CRP基因多態性與EC的相關性研究不多，中國漢族人群的資料更少。因此，本研究旨在探討中國漢族CRP+1444C/T基因多態性分布及其與EC之間的關系。

對象與方法

一、研究對象

2011年3月至2014年10月在我院就診的無血緣關系的203例漢族EC患者(EC組)，其EC均經手術病理活組織檢查(活檢)證實。以一對一選取年齡相匹配的203名漢族女性健康體檢者為對照組。2組均排除合并其他惡性腫瘤或有家族性腫瘤病史者。

二、方法

1.采血及外周血DNA提取

研究組患者于入院后行體格檢查并于次日清晨采集空腹血進行相關指標檢測，對照組女性的數據為體檢時獲得。抽取入選者外周靜脈血3 ml，以32 g/L檸檬酸鈉抗凝，采用低滲破裂紅細胞、標準蛋白酶K消化和飽和DNA試劑盒(北京天根公司)抽取外周血白細胞基因組DNA，-20℃保存。

2.CRP基因多態性分析

根據GenBank公布的CRP基因全序列設計引物，由Invitrogen生物工程有限公司合成。上游引物：5-AGCTCGTTAACTATGCTGGGGCA-3，下游引物：5-CTTCTCAGCTCTTGCCTTATGAGT-3，擴增的PCR產物為181 bp。PCR反應體系為25 μl，包括預制Taq混和物12.5 μl、Template DNA 1.5 μl、上下游引物各2 μl、滅菌蒸餾水7 μl。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，共35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。取PCR產物5 μl采用1%瓊脂糖凝膠-溴乙錠染色法進行電泳，使用UVI自動凝膠成像及分析系統觀察擴增結果。

3.PCR產物的限制性酶切

使用限制性內切酶HpyCH4Ⅲ對CRP+1444C/T位點的PCR擴增產物進行酶切。酶切體系為30 μl，包括PCR產物10 μl、HpyCH4Ⅲ內切酶1 μl，10倍FastDigest緩沖液2 μl，滅菌蒸餾水17 μl。于37℃孵育1～2 h，取10 μl經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像及分析系統判斷基因型，取部分PCR擴增產物送廣州艾基生物技術有限公司測序以進一步驗證。

4.生化指標及體檢資料

采用日立7600全自動生化分析儀測定甘油三酯、LDL-C、HDL-C、血糖和超敏CRP(hsCRP)。

三、統計學分析

結 果

一、EC組與對照組的一般資料及生化指標比較

EC組患者的腰圍、BMI、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、空腹血糖、hsCRP水平均高于對照組(P均<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 EC組與對照組的一般資料和代謝特征資料比較

注：1 mm Hg=0.133 kPa

二、CRP基因+1444C/T多態性檢測及PCR產物測序結果

PCR擴增產物為181bp的特異性片段(圖1)，然后用內切酶HpyCH4Ⅲ酶切。本研究檢測到3種基因型(圖2)：TT純合型(156 bp、25 bp)、CT雜合型(181 bp、156 bp和25 bp)和CC純合型(181 bp)。PCR產物經測序進一步驗證成功(圖3)。

圖1 CRP+1444位點PCR擴增電泳圖M：DNA標記物

三、CRP基因+1444C/T多態性分布特點及與EC的關系

圖2 RP+1444位點酶切電泳圖1：CC基因型 2：CT基因型 3：TT基因型 M：DNA標記物

圖3 CRP+1444基因部分序列及測序圖箭頭所指該點為C/T雙峰，為CT基因型

CRP+1444C/T基因型頻率分布經χ2檢驗符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。各基因型在EC組和對照組的分布比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；而TT基因型以及C等位基因頻率在2組間的分布比較差異有統計學意義(P均<0.05)。經logistic回歸分析，調整年齡、舒張壓、收縮壓、血糖、甘油三酯、LDL-C和HDL-C等多因素后顯示，CRP+1444 C/T的CC、CT和TT基因型與EC均無關(P均>0.05)。將EC組按BMI分為BMI<25 kg/m2(正常)組和BMI≥25 kg/m2(超重)組，發現超重組CC基因型及C等位基因頻率較正常組增高(χ2=4.011，P=0.045)，見表2。

表2 CRP+1444基因多態性分布

注：Pa表示EC組與對照組比較的P值;Pb表示2組經多因素分析校正后的P值；Pc表示EC兩亞組比較的P值

四、CRP基因型與血清hsCRP水平的關系

EC組及對照組的CRP+1444 CC基因型組hsCRP水平與CT+TT基因型組比較差異無統計學意義(3.42vs. 3.61，t=0.155，P=0.877；1.94vs. 2.10，t=0.486，P=0.313)。EC的正常組與超重組hsCRP水平比較差異無統計學意義(3.25vs. 3.76，t=0.112，P=0.125)。EC的正常組(BMI<25 kg/m2)CC基因型與CT+TT基因型的hsCRP水平比較差異無統計學意義(3.28vs. 3.19，t=0.287，P=0.182)；而在EC的超重組，CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組(4.05vs. 3.12，t=2.196，P=0.038)。

對照組同樣分為BMI<25 kg/m2的正常組和BMI≥25 kg/m2的超重組，2組的hsCRP水平比較差異無統計學意義(1.89vs. 1.97，t=0.528，P=0.438)。在BMI<25 kg/m2以及BMI≥25 kg/m2的對照組，CC基因型與CC+TT基因型的hsCRP水平比較差異均無統計學意義(1.93vs. 1.86，t=0.620，P=0.430；2.01vs. 1.92，t=0.910，P=0.340)。EC組的正常亞組hsCRP水平高于對照組的正常亞組(3.26vs. 1.89，t=9.589，P<0.001)。EC的超重亞組(BMI≥25 kg/m2)hsCRP水平高于對照組的超重亞組(3.76vs. 1.97，t=11.25，P<0.001)。

討 論

目前大量研究表明，炎癥在腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要作用[2]。炎癥標志物的表達量隨著疾病嚴重程度的上升而增加，與相應受體結合后，可激活核因子-κB通路及JAK通路，促進細胞增殖、抗凋亡及促進腫瘤轉移。處于慢性炎癥狀態時，患者的氧化應激水平提高，這也會為腫瘤提供適宜的微環境，利于腫瘤生長、轉移。

CRP是炎癥、感染和組織損傷急性期反應的非特異性標志物，是反映機體炎癥狀態的一種敏感、可靠的指標[3]。CRP基因定位于人類1號染色體q13.2區域，約跨越1.9 kb，含有2個外顯子，中間由1個內含子隔開。功能學研究發現，CRP基因啟動子-286C>T>A可影響轉錄因子的結合以及調節轉錄活性，已證實其為功能性多態性位點。CRP基因+1444C/T多態性與-286C>T>A多態性位點存在強的連鎖不平衡。由此推測，CRP基因+1444C/T這種多態性變異可能影響轉錄的過程，也有可能其本身就影響啟動子的活性，從而影響基礎血清CRP水平。但是研究表明，CRP基礎水平與很多因素相關，如性別、年齡、BMI、血脂、血壓、環境因素、生活方式、遺傳因素等，在各種因素所導致的個體CRP水平差異中，遺傳因素所起的作用能夠達到40%[4]。

目前關于CRP與EC的相關研究尚不多，Dossus等[5]研究發現，CRP明顯升高的肥胖患者，發生EC的風險增高。既往研究表明，術前血清hsCRP水平與EC的FIGO分期、是否有淋巴結轉移及患者年齡有關，高FIGO分期、淋巴結轉移和年齡大于50歲者術前血清hsCRP水平明顯增高；且hsCRP和腫瘤分期與EC的無復發生存期及總生存期密切相關，均可作為EC的獨立預后因子[6]。

關于CRP基因多態性與EC的關系研究更少。在Wen等[7]的研究中發現，CRP+1444C/T在中心性肥胖的EC患者中存在基因型的差異，但未就其與EC患者相應的CRP濃度進行進一步的分析。本研究通過對CRP+1444C/T基因多態性與EC的相關分析，發現在EC患者和正常人之間，各基因型及等位基因分布頻率比較差異無統計學意義。多因素分析顯示，CRP+1444各基因型與EC無關。將EC組根據BMI分組后，發現超重組CC基因型頻率較高，但2個亞組之間血清hsCRP水平比較差異無統計學意義。EC的超重亞組(BMI≥25 kg/m2)中，CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組。對照組不同BMI亞組之間以及同一BMI亞組不同基因型之間的hsCRP水平相近。相同BMI水平的EC組與對照組相比，hsCRP水平均為EC組高于對照組。這說明EC患者處于一種慢性炎癥狀態，并通過hsCRP水平反映出來，且基因型在一定程度上可以影響血清hsCRP水平。這些與Dossus等[5]研究結果相一致。

但在Marsik等(2006年)的研究報道中，攜帶CRP+1444 C等位基因者的基礎血清CRP水平并不高，而IL-6水平較高；靜脈給予2 ng/kg內毒素刺激后，表現為TNF-α和IL-6水平明顯增高、體溫上升，究其原因，可能攜帶CC基因型者炎癥反應更強烈。筆者既往研究表明，隨著BMI的增加，EC患者代謝綜合征的發生率從低體重亞組的0增至肥胖亞組的100%，而代謝綜合征是EC發病的獨立危險因素[8]。肥胖和代謝綜合征共同的通路是胰島素抵抗，根據上述結果推測，CRP+1444 CC等位基因可能通過肥胖相關的炎癥反應導致EC的發病風險增加，但其更深層的機制需要進一步研究。也有不盡一致的研究結果， Kumurcu-Bayrak等[9]的研究發現，在高血壓病患者中，CRP+1444 CT+TT基因型與血清CRP水平升高有關。在Martinez-Calleja等[10]的研究中發現，合并肥胖的2型糖尿病患者CRP+1444 TT基因型占優勢。肥胖、高血壓病、糖尿病作為EC的3大危險因素，與CRP+1444的基因多態性結果卻不一致，原因可能是EC的發生是多基因遺傳因素與環境因素共同作用的結果，而單一基因、單一位點的作用較弱。

本研究雖然未直接發現CRP+1444基因多態性與EC的關系，但顯示出了不同BMI者有不同的基因多態性分布，且EC患者超重亞組CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組。這提示我們CRP基因多態性可能和其他因素相互作用、相互影響，通過胰島素抵抗和炎癥因子的共同作用影響EC的發病。

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AssociationofC-reactiveproteingene+1444C/Tpolymorphismwithendometrialcancer

WangLijuan,Bayinjili,LuHuaiwu,LiJing,LinZhongqiu.

DepartmentofGynecologicalOncology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

,LinZhongqiu,E-mail:lin-zhongqiu@163.com

ObjectiveTo investigate the potential association between C-reactive protein (CRP) gene +1444 C/T polymorphism and endometrial cancer.MethodsIn this study, 203 patients with endometrial cancer (EC) and 203 healthy controls were enrolled into the EC and control groups. The CRP gene+1444 C/T polymorphism was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The serum hsCRP levels combined with alternative clinical data were determined for subsequent analysis.ResultsThe serum hsCRP level in the EC group was significantly higher compared with that in the control group (P<0.05). No statistical significance was documented in the frequencies of CC, CT and TT genotypes between two groups (P>0.05). Compared with EC patients with normal BMI (<25 kg/m2), a significantly higher frequency of CC genotype and C allele type was found in those with BMI≥25 kg/m2(P<0.05). In addition, women with CC genotype or C allele type had significantly higher serum hsCRP levels compared with those with CT and TT genotypes or T allele type (bothP<0.05).ConclusionCRP gene +1444 C/T polymorphism, insulin resistance and inflammatory factors may collectively affect the risk of EC.

C-reactive protein; Gene polymorphism; Endometrial cancer

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.006

廣東省醫學科研基金(B2012105)

510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫院婦科腫瘤專科

，林仲秋， E-mail: lin-zhongqiu@163.com

2015-02-26) (本文編輯：林燕薇)