胎盤中血管內皮生長因子及其受體1改變與子癇前期的相關性研究

張彩 游澤山 李理 李曉明

臨床研究論著

胎盤中血管內皮生長因子及其受體1改變與子癇前期的相關性研究

張彩 游澤山 李理 李曉明

目的探討胎盤中血管內皮生長因子(VEGF)及其可溶性受體1(sFlt-1)的變化與妊娠期高血壓疾病的關系。方法采用半定量逆轉錄PCR法和免疫組織化學染色法檢測20例正常人工流產絨毛組織、40例正常妊娠晚期、40例輕度子癇前期及40例重度子癇前期孕婦胎盤組織中VEGF及sFlt-1的表達及胎盤微血管密度(MVD)。結果子癇前期和正常妊娠孕婦絨毛或胎盤中均有VEGF、sFlt-1 mRNA和蛋白的表達。正常妊娠早期組、正常妊娠晚期組、輕度子癇前期組及重度子癇前期組VEGF、sFlt mRNA及蛋白表達水平兩兩比較差異均具有統計學意義(P均<0.01)。隨著妊娠的進展，胎盤MVD逐漸增加，而在子癇前期孕婦中逐漸減少，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.01)。輕、中度子癇前期胎盤組織中VEGF與sFlt-1 mRNA和蛋白表達水平均呈負相關(P均<0.05)。各組絨毛或胎盤組織中MVD與VEGF mRNA和蛋白表達水平均呈正相關(P均<0.05)，而與sFlt-1 mRNA和蛋白質表達呈負相關(P均<0.05)。結論VEGF和sFlt-1參與妊娠期高血壓疾病的發生、發展，VEGF和sFlt-1在妊娠期高血壓疾病的發病過程中可能存在著相反的關系，也就是VEGF對妊娠期高血壓疾病的發生具有保護作用而sFlt-1則對其具有促進作用。

血管內皮生長因子；可溶性血管內皮生長因子受體-1；子癇前期

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，是造成孕產婦死亡的重要原因之一，也是產科病理的研究重點之一[1]。血管內皮細胞損傷是其發病的重要環節，但造成血管內皮細胞損傷的原因尚不清楚。可溶性血管內皮生長因子受體1(sFlt-1)由Flt-1在胞外被剪接而成，缺少跨膜區和胞質區，但保留了與血管內皮生長因子(VEGF)高親和力的特性，與Flt-1和含激酶插入區受體形成異源二聚體，最終阻斷VEGF的生物學活性[2]。本研究旨在通過對妊娠期高血壓疾病孕婦胎盤組織中VEGF和sFlt-1水平進行定量分析，進一步探討其與妊娠期高血壓疾病發生的作用及兩者間關系。

對象與方法

一、研究對象

2010年1月至2011年10月在我院診斷為輕度子癇前期(40例)、重度子癇前期(40例)單胎孕婦和40名與之年齡、孕周相匹配的無妊娠合并癥的正常妊娠晚期孕婦。妊娠期高血壓疾病的診斷及分類標準參照全國高等學校教材《婦產科學》第7版[3]。同時收集妊娠早期人工流產絨毛組織20例。重度子癇前期孕婦40例，孕(37±3)周；輕度子癇前期孕婦40例，孕(37±5)周。正常妊娠晚期妊娠婦女40例，均為孕37～38周無子宮收縮入院，而行剖宮產術終止妊娠者。所有孕婦均無高血壓病及心臟病史，無慢性腎炎等泌尿系統疾病，無貧血及巨大兒和胎兒生長受限的發生。

二、方法

1.胎盤標本收集

待孕婦胎盤娩出后，于母面近臍帶處，避開鈣化點迅速取胎盤組織2～4塊，每塊約2 cm×2 cm×2 cm，滅菌生理鹽水反復漂洗，去除母體血液后吸掉水分，迅速置于液氮中，過夜后置于-80℃冰箱保存備用。

2.總RNA的提取

取保存的胎盤組織150 mg放入預冷的10 mm×15 mm試管中，加入Trizol總RNA抽提試劑1 ml用電動勻漿器冰浴下粉碎組織成勻漿，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度計測定吸光度A值，1%瓊脂糖凝膠電泳可見28 S、18 S條帶，表明RNA質量符合要求，可用于逆轉錄。

3.RNA逆轉錄及目的基因片段的擴增

將所有總RNA均勻稀釋至0.5 g/L，按照美國Promega公司的逆轉錄試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉錄為模板DNA。根據sFlt-1基因系列設計引物：上游引物P1為5’-GGAATTCCGCGCTCAGCATGGTCAGC-3’，下游引物P2為5’-TTGGATCCTACCGCTTGCCAGCTACGGTTT-3。用于檢測VEGF mRNA的上游引物為5’ -TGCCTTGCTGCTCTACCTCC-3’，下游引物為5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3’，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因，上游引物為5’-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3’，下游引物為5’- CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3’。PCR反應體系為30 μl ，條件設定為：94℃預變性4 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共28個循環，最后72℃延伸10 min。取10 μl PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，β-actin作為內參照，測定特異條帶的密度，得出目的基因mRNA的相對表達水平。

4.胎盤組織VEGF和sFlt-1蛋白表達水平的檢測

采用免疫組織化學染色方法檢測，按PV-6000免疫組織化學染色試劑盒說明書步驟操作，陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗。陽性結果判斷標準：標本組織細胞質或基質中有黃色和棕黃色顆粒。采用相關軟件測定陽性細胞的平均光密度A值。每張切片隨機選取8個區域的陽性細胞計算光密度，以其均值反映VEGF和sFlt-1的蛋白表達水平。

5.胎盤絨毛微血管密度(MVD)的計算

以CD34鼠抗人單克隆抗體標記胎盤內的血管，以細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性。參照Maeda等(1996年)方法在100倍光鏡下挑選微血管分布最高密度區域，然后在400倍光鏡下觀察5個視野，計算每個視野內的微血管數目，取平均值作為MVD值。

三、統計學處理

結 果

一、各組胎盤或絨毛組織中VEGF、sFltmRNA和蛋白的表達水平比較

子癇前期組和正常妊娠組胎盤中均有VEGF、sFlt-1 mRNA和蛋白的表達。正常妊娠早期、正常妊娠晚期、輕度子癇前期及重度子癇前期組VEGF、sFlt mRNA及蛋白表達水平兩兩比較差異均具有統計學意義(P均<0.01)。隨著妊娠的進展，胎盤MVD逐漸增加，而在子癇前期孕婦中逐漸減少，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.01)，見表1。

二、胎盤或絨毛組織VEGF與sFlt-1mRNA和蛋白表達水平的相關性分析

輕、重度子癇前期胎盤組織中VEGF與sFlt-1 mRNA和蛋白表達水平均呈負相關(P均<0.05)，見表2。

表1 各組胎盤或絨毛組織中VEGF、sFlt-1 mRNA和蛋白質的表達水平及MVD比較

注：與妊娠早期絨毛組織比較，aP<0.01；與正常妊娠晚期胎盤組織，bP<0.01；與輕度子癇前期胎盤組織比較，cP<0.01

表2 各組絨毛或胎盤組織中VEGF與sFlt-1 mRNA和蛋白表達水平的相關性分析

三、胎盤或絨毛組織中VEGF及sFlt-1mRNA和蛋白表達水平與MVD的相關性分析

各組胎盤絨毛組織中MVD與VEGF mRNA和蛋白表達水平均呈正相關(P均<0.05)，而與sFlt-1 mRNA和蛋白質表達呈負相關(P均<0.05)。這也與正常妊娠生理需要相符合，隨著孕周的增加，母胎間營養物質交換增多，血管密度也隨著增加，以滿足生長發育的需要。

表3 各組絨毛或胎盤MVD與VEGF及sFlt-1 mRNA和蛋白之間的相關性分析

討 論

子癇前期的發病包括胎盤異常階段和母體異常階段。胎盤異常階段以胎盤缺血、發育異常為特征，同時伴有胎盤分泌一些因子包括sFlt-1通過胎盤-血管屏障進入母體血循環，引起廣泛的血管內皮損傷；母體異常則是在胎盤異常的基礎上出現高血壓病、蛋白尿等臨床表現[4-5]。VEGF是目前公認最重要的促血管生成因子，與其受體Flt-1結合，在妊娠早期參與胎盤血管網的形成而在妊娠晚期主要調節血管內皮細胞的通透性，有利于胎兒生長發育。本研究表明，隨著孕周增加胎盤組織中VEGF表達水平升高，妊娠晚期VEGF水平明顯高于妊娠早期，而子癇前期孕婦中VEGF表達水平較正常妊娠晚期婦女明顯降低，但仍高于妊娠早期婦女，與Chun等(2005年)的研究結果一致。

sFlt-1是VEGF跨膜受體Flt-1的可溶形式，因其缺乏跨膜區和細胞內結構域，雖能與相應配體結合但不能轉錄VEGF信號，從而成為VEGF拮抗劑，使循環中VEGF水平下降阻斷VEGF的各種生理作用，引起血管生成障礙和內皮損傷[6-7]。本研究發現，正常妊娠和子癇前期患者胎盤組織中均有sFlt-1 mRNA和蛋白的表達，但子癇前期患者表達水平明顯高于相應孕周正常妊娠婦女，且重度子癇前期患者明顯高于輕度患者。Maynard等(2003年)檢測了子癇前期患者胎盤Flt-1及sFlt-1的表達，發現Flt-1和sFlt-1表達均增強，結合本研究中發現子癇前期患者胎盤sFlt-1mRNA和蛋白表達明顯升高,均證實了sFlt-1參與了子癇前期的病理生理過程。

胎盤sFlt-1過度表達是否為子癇前期的病因及其作用機制目前仍不明確。Hornig等(2000年)的體外實驗結果表明缺氧可誘導胎盤滋養細胞sFlt-1的表達，而子癇前期患者存在胎盤缺血、缺氧，因此子癇前期患者胎盤sFlt-1過度表達可能是子癇前期的繼發事件。而Hertigh等(2004年)和Mckeeman等(2005年)研究發現子癇前期患者臨床癥狀出現前6～11周血清sFlt-1水平即有明顯升高，提示胎盤sFlt-1過度表達造成血清sFlt-1水平升高，可能是子癇前期的重要原因。胎盤MVD是反映促血管生成因子VEGF水平的直接指標，缺氧時胎盤MVD應該是代償性增加即與sFlt-1呈正相關。本研究同時檢測VEGF、sFlt-1及MVD的變化并分析兩者之間的相關性，MVD與VEGF表達量呈正相關也進一步證實了兩者之間的直接關系，如果sFlt-1是缺氧的繼發事件則子癇前期時胎盤MVD應該增加。然而，MVD與sFlt-1呈負相關，這則與之相悖，在一定程度上說明sFlt-1可能是子癇前期的重要病因，有關結論尚待通過轉染誘導sFlt-1過表達或者基因沉默抑制sFlt-1表達與子癇前期發病之間個體關系予以證實。

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[2]Shibuya M. Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1 and receptor-2 in angiogenesis. J Biochem Mol Biol, 2006,39(5): 469-478.

[3]樂杰.婦產科學. 7版，北京：人民衛生出版社，2008：94-95.

[4]B?descu A, Georgescu CV, Vere CC, Cr?ioiu S, Grigore D.Correlations between Her2 oncoprotein, VEGF expression, MVD and clinicopathological parameters in gastric cancer.Rom J Morphol Embryol, 2012,53(4):997-1005.

[5]Szpera-Gozdziewicz A, Breborowicz GH. Endothelial dysfunction in the pathogenesis of pre-eclampsia. Front Biosci (Landmark Ed), 2014,19:734-746.

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Correlationbetweenthechangesofplacentalvascularendothelialgrowthfactorandreceptor1andpreeclampsia

ZhangCai,YouZeshan,LiLi,LiXiaoming.

DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou511700,China

,YouZeshan,E-mail:youzeshan888@21cn.com

ObjectiveTo investigate the relationship between the alterations in placental vascular endothelial growth factor (VEGF) and soluble receptor 1 (sFlt-1) and hypertension during gestation period.MethodsThe expression of VEGF and sFlt-1 and microvascular density (MVD) in the villi of twenty healthy women with normal induced abortion and the placental tissues of 40 with late pregnancy, 40 with mild preeclampsia and 40 with severe preeclampsia were measured using semi-quantitative reverse transcription PCR and immunohistochemical staining.ResultsAt both protein and mRNA levels, VEGF and sFlt-1 were expressed in the villi or placenta from healthy pregnant women and those with preeclampsia. The expression of VEGF and sFlt at both protein and mRNA levels significantly differed between any two groups among early and late pregnancy, mild and severe preeclampsia groups (allP<0.01). Along with the development of pregnancy, the placental MVD was gradually increased, whereas steadily decreased in pregnant women with preeclampsia with statistical significance between any two groups (allP<0.01). In the mild and moderate preeclampsia groups, the expression of placental VEGF mRNA and protein was negatively correlated with those of sFlt-1 (allP<0.05). In each group, MVD was positively correlated with expression of VEGF mRNA and protein (allP<0.05). However, MVD was negatively correlated with the expression of sFlt-1mRNA and protein (allP<0.05).ConclusionsVEGF and sFlt-1 participate in the incidence and progression of hypertension during gestation period. These two factors probably play different roles in the process. VEGF is help to prevent the incidence of gestational hypertension, whereas sFlt-1 exerts a promoting effect.

Vascular endothelial growth factor；sFlt-1；Preeclampsia

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.007

廣東省科技計劃項目(2008B030301072)

510700 廣州，中山大學附屬第一醫院黃埔院區婦產科

，游澤山，E-mail: youzeshan888@21cn.com

2015-02-23) (本文編輯：林燕薇)