不同熱處理時間對污泥厭氧發酵產氫的影響

昌盛，李建政，劉楓，王淑靜

1.環境基準與風險評估國家重點實驗室，中國環境科學研究院，北京 100012

2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090

氫氣具有熱值高、燃燒無污染及不產生溫室氣體的特性，被認為是最具發展前景的清潔能源之一，但因缺乏經濟高效的制氫技術而制約了氫能的推廣應用［1-2］。與傳統的物理化學方法相比，基于活性污泥混合菌群的厭氧發酵制氫技術優勢明顯，其能以有機廢物為原料［2-3］，且厭氧發酵系統操作簡單，管理方便，工業化前景廣闊。近年來，厭氧發酵制氫技術研究發展十分迅速。為提高發酵制氫反應系統的產氫效能，研究者在高效反應設備、控制條件的優化以及生物強化技術等方面進行了廣泛研究［3］。加快發酵產氫系統的啟動進程，提高活性污泥的產氫效能，獲得具有較高產氫效能的微生物種質資源，顯得尤為關鍵。

對種泥進行適宜的預處理，以淘汰接種污泥中不產芽孢的非產氫菌群以及產甲烷菌耗氫菌群，富集產氫混合菌種，成為近年研究的重點方向［4-6］。其中，應用種泥熱處理方法最為多見［6-8］，但厭氧發酵系統的產氫特性，還會受到種泥類別與性質、底物種類和反應pH 等控制條件的影響，報道采用的熱處理溫度為60 ～120 ℃，熱處理時間為30 ～120 min［7-9］。在前期研究中，以城市污水處理廠剩余污泥為種泥，通過間歇發酵試驗，考察了熱處理溫度對活性污泥發酵產氫特性的影響，發現熱預處理溫度為65 ℃時，系統獲得的產氫性能最佳［10］。筆者在前期研究基礎上，通過搖瓶發酵試驗，比較種泥在65 ℃下經不同熱處理時間處理后的產氫性能，探討適宜的熱處理條件，以期為發酵產氫菌群的富集提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 種泥及預處理

種泥來自城市污水處理廠二沉池，取回實驗室后，經淘洗過濾獲得，其懸浮固體濃度(MLSS)和揮發性懸浮固體濃度(MLVSS)分別為27.3 和16.0 g/L。取混勻污泥50 mL 8 份，分別置于8 個100 mL燒杯中，將帶有污泥的燒杯置于65 ℃的水浴鍋中，分別加熱0、15、30、45、60、75、90 和120 min;其中0 min 作為空白對照試驗。

1.2 搖瓶發酵試驗

采用130 mL 的血清瓶進行厭氧發酵。發酵試驗步驟:用注射器取10 mL 污泥分別放入血清瓶中，于每支血清瓶中加入60 mL 培養液，用NaOH 或HCl 溶液將pH 調至7.0;充高純氮氣3 min 并用膠塞密封。將密封后的血清瓶置于35 ℃恒溫搖床中，140 ～150 r/min 下恒溫培養64 h。試驗所用培養液的組分與文獻［10］相同。各種預處理條件下的發酵試驗用3 支血清瓶同時進行，相關數據取平均值進行分析。

1.3 分析方法

pH 和生物量參照國標方法測定［11］，葡萄糖濃度采用DNS 法測定［12］。發酵系統的累計產氫量采用Owen 法計算得到［13］。培養64 h 后，從反應瓶中抽取1.5 mL 反應液，10 000 r/min 下離心1 min，取上清液測定葡萄糖和液相末端發酵產物濃度。試驗中的氣體組分和液相發酵產物采用氣相色譜儀(型號分別為SP-6801T 和SP-6890，山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)測定［14］。

采用改進的Gompertz 模型對累計產氫曲線進行擬合，以求解發酵系統產氫的動力學參數。

式中:H 為累計產氫量，mL;Pmax為最大產氫量，mL;Rmax為最大產氫速率，mL/h;λ 為延滯時間，h;t 為培養時間，h。

2 結果與討論

2.1 累計產氫量

圖1 不同熱處理時間下各發酵體系的累計產氫量Fig.1 Cumulative hydrogen production for batch fermentative system with different heat time

圖1 為不同熱處理時間下各發酵體系的累計產氫量。由圖1 可見，各發酵體系的累計產氫量變化均經歷了延滯期、指數增長期、平臺期3 個階段。未經熱處理的發酵體系累計產氫量最小，僅為15.5 mL。經15 和30 min 熱處理的發酵體系累計產氫量最大，分別為79 和81 mL。經45 ～75 min 熱處理的發酵體系累計產氫量相當，為70 ～74 mL。而經90和120 min 熱處理的發酵體系累計產氫量相對較小，為48 和57 mL。這說明適宜的熱處理時間能有效富集產氫菌群，而過長時間的熱處理可能使得部分產氫菌群的活性受限。

對累計產氫曲線進行非線性擬合，求得的動力學參數如表1 所示。

表1 不同熱處理時間下污泥發酵體系的產氫動力學參數Table 1 Kinetic parameters of fermentative hydrogen production for the pretreated activated sludge

由表1 可見，經過65 ℃熱處理后的污泥，其發酵葡萄糖的最大產氫量和最大產氫速率均遠大于未處理污泥，這與前期研究結果一致［10］。經15 和30 min 熱處理的發酵體系的最大產氫速率最佳，約為10 mL/h;經45、60 和75 min 熱處理的污泥發酵體系最大產氫速率均在9 mL/h 以上;而當熱處理時間大于75 min 時，發酵體系中無論是最大產氫量還是最大產氫速率均有明顯下降，這說明污泥產氫活性較低。分析認為這可能是由于過長的熱處理時間抑制了產氫發酵細菌的活性所致，經熱處理90 和120 min 的發酵系統的延滯期較15 ～75 min 的要長，也說明污泥活性受抑。此外，在不同熱處理時間下，污泥產氫發酵的延滯期均較未進行預處理的系統要明顯縮短。以上結果表明，污泥經過65 ℃適宜時間的熱處理后，促使種泥中產氫菌孢子的萌發，產氫發酵細菌能較快進入指數生長期，而具備較高的產氫速率，但過長的熱處理時間反而會因抑制混合菌群的活性而使產氫發酵反應受阻，限制了發酵系統的產氫效能。試驗結果顯示，以生活污水活性污泥為種泥，采用65 ℃熱預處理方法富集產氫菌群時，適宜熱處理時間為15 ～30 min。

2.3 液相末端發酵產物

圖2 顯示各發酵體系液相末端發酵產物的濃度。由圖2 可見，培養到終點時，除空白對照組的葡萄糖轉化率為77%外，其他發酵系統的葡萄糖轉化率為88% ～91%。各污泥樣品反應體系中剩余葡萄糖濃度分別為2 036(對照)、1 071(15 min)、923(30 min)、1 106(45 min)、966(60 min)、897(75 min)、1 086(90 min)和903 mg/L(120 min)。

圖2 各發酵體系液相末端發酵產物濃度Fig.2 Liquid fermentative products at the end of the cultivation

由圖2 可見，液相末端發酵產物主要以乙酸、丙酸、丁酸和乙醇為主，且不同熱處理時間下所產生的代謝產物總量各不相同，各代謝產物濃度也存在一定差異。對于未經處理的種泥發酵體系，液相代謝產物以乙醇和乙酸為主，其中乙醇、乙酸、丁酸分別占發酵產物總量的24.2%、53.7%和16.6%，呈乙醇型發酵。而對于經過熱處理的發酵體系來講，各發酵體系中乙醇、乙酸和丁酸占總量的比例:15 min 時分別為19.1%、43.1%和35.6%;30 min 時分別為19.3%、45.9%和34.8%;45 min 時分別為20.0%、47.2%和32.9%;60 min 時分別為15.7%、48.5%和35.7%;75 min 時分別為22.7%、47.2%和30.1%;90 min 時分別為26.6%、47.7%和25.6%;120 min 時分別為27.0%、45.9%和28.4%。這說明經15 ～75 min熱處理的污泥發酵系統，呈丁酸型發酵特征;而經90和120 min 熱處理的污泥發酵系統，呈混合酸型發酵特征。表明不同熱處理時間下各發酵系統內形成了具有不同產酸發酵代謝功能的頂級微生物群落，其產酸代謝特征各異。

由圖2 可見，未經過65 ℃處理的污泥和經熱處理15 min 的發酵體系中，經過64 h 發酵反應后，液相代謝產物中含有微量丙酸，而其他熱處理時間下，丙酸未被檢出。這說明熱處理時間較短時，丙酸發酵細菌的活性可能難以被抑制，當處理時間大于15 min時，丙酸發酵細菌可能被殺滅。而在產酸發酵體系中，丙酸發酵菌群在厭氧發酵降解葡萄糖的代謝途徑中不僅無氫氣產生，反而還需消耗氫氣［13］，因此，未經處理的發酵體系，其累計產氫量最小(圖1)。這一現象也說明，在65 ℃的熱處理下，熱處理時間對不同厭氧微生物發酵菌群的作用效果各異。對于不同熱處理時間下厭氧微生物的群落結構組成，后續將采用分子生物學技術進行研究。

2.4 生物量和pH

圖3 為不同熱處理條件下的終止pH 和生物量。由圖3 可見，反應64 h 后，因大量揮發酸的產生，pH 下降較多，但各反應體系的pH 差異甚微，介于3.40 ～3.55。但生物量差別明顯，在間歇培養結束時，各體系的生物量分別為5.85(空白)、5.77(15 min)、5.35(30 min)、4.95(45 min)、5.31(60 min)、4.80(75 min)、4.51 (90 min)和4.57 g/L(120 min)。這一結果表明，過長時間的熱處理顯著抑制了種泥活性，其生物量增加幅度最小。

圖3 不同熱處理條件下的終止pH 和生物量Fig.3 pH and biomass profiles at the end of fermentation with different heat pretreatment time

2.5 綜合分析

表2 為65 ℃不同熱處理時間下各污泥發酵體系的產氫特性。

表2 65 ℃不同熱處理時間下各污泥發酵體系的產氫特性分析Table 2 The characteristic of fermentative hydrogen production of the heat-pretreated sludge by 65 ℃

由表2 可見，污泥在65 ℃下經不同時間的預處理后，發酵系統的產氫特性和微生物生長情況存在顯著差異。對于未經處理的污泥發酵系統而言，雖然其葡萄糖的降解情況與污泥經熱處理過的體系相當，但其獲得的氫氣轉化率最小(0.17 mol/mol，以葡萄糖計)、比細胞增長率卻最大(0.6 g/g，以MLVSS 和葡萄糖計)，這表明在未經處理的污泥發酵體系中，大量葡萄糖被非產氫菌種所利用，故其產生的氫氣量最小(圖2);而經熱處理的污泥，種泥中的非產氫菌種活性受抑制或被殺滅，當污泥被接種后，混合菌群中的產氫菌種能較快進行繁殖，對底物加以利用而大量產氫，因而對污泥輔以熱沖擊的預處理方式，能有效富集產氫菌群，這與Mu Y. 等［15］的報道結果一致。有研究表明，生物量的增長與其發酵產氫量呈現正相關性［9］，然而，試驗中各發酵系統的生物增長量，要比Wang J. L.等［16］報道的高出1.5 倍，但氫氣轉化率卻相對較低。分析認為，基質向細胞生物質的大量轉化，是導致系統產氫量較低的直接原因［17］，而接種污泥的來源和培養條件與Wang J. L.等的研究方法不同，可能是氫氣產率較低的根本原因。為此，有必要在后續研究中，通過進一步優化培養基組分及培養條件以提高系統的產氫效能。

B. Baghchehsaraee 等［9］的研究表明，以活性污泥和厭氧污泥為種泥時，種泥的處理溫度對發酵產氫特性具有顯著影響，筆者的前期研究結果得出了相同的結論［10］。B. Baghchehsaraee 等的研究顯示，經65、80 和95 ℃熱處理后，種泥的微生物群落結構存在明顯差異，發酵產物中的乙酸、丁酸組分比例不同，發酵系統的氫氣轉化率與丁酸/乙酸的比率存在一定相關性。同時，隨著熱處理溫度的提高，種泥中的微生物多樣性顯著降低。筆者的研究結果顯示，在65 ℃下，污泥經不同時間的熱沖擊后，種泥發酵體系的發酵產氫活性和液相末端發酵產物的分布情況都存在一定差異。對于污泥經15 ～75 min 熱處理的發酵體系來講，發酵產物以乙酸和丁酸為主，系統呈丁酸型發酵特征;而經90 和120 min 熱處理的污泥發酵體系，則呈混合酸發酵特征。分析認為，這是由于在不同溫度下的熱處理及在一定溫度下改變處理時間的熱處理方式，均是利用活性污泥在受到不同程度的熱沖擊后，各種微生物菌群反應不一而形成不同的種群結構，所以，不同熱處理時間下種泥中的微生物種群存在差異，進而影響活性污泥中的微生物種群結構組成，導致經不同時間熱處理后，污泥表現出不同的發酵產氫性能。另一方面，筆者的研究結果顯示，過長時間的熱處理也會降低種泥的微生物活性。從表2 可知，過長時間的熱處理，將會降低污泥活性，其葡萄糖降解率、揮發酸產量較低，系統產氫效能欠佳。與經15 ～75 min 熱處理的發酵體系相比，熱處理90 ～120 min 時的污泥細胞增長率較低，這說明種泥經90 和120 min 熱處理后，種泥的多樣性降低，其中活性較差的產氫菌代謝能力降低甚至失去活性，致使發酵體系的產氫量變小(圖1)。因而，熱處理時間為90 和120 min 時，污泥發酵體系的氫氣轉化率相對偏低，而污泥經15 ～75 min 的熱處理后，其污泥比產氫速率和氫氣轉化率分別為8.2 ～8.4 mmol/g(以MLVSS 計)和0.95 ～1.09 mol/mol(以葡萄糖計)，產氫效能差異不明顯，但從節約預處理成本的角度考慮，選擇熱預處理時間為15 ～30 min 較為適宜。

3 結論

(1)城市污水處理廠的活性污泥經65 ℃熱處理后，產酸發酵產氫混合菌群能得到有效富集，進而增強了污泥的厭氧發酵產氫活性，且污泥的熱預處理時間對系統的發酵產氫效能有顯著影響。

(2)在初始葡萄糖濃度為10 g/L，污泥接種量為1.6 g/L(以MLVSS 計)，pH 為7.0 的條件下，經過不同時間熱處理的污泥發酵系統呈現的產氫特性各異。經過64 h 發酵后，以熱處理時間為15 和30 min 獲得的產氫效果最佳，氫氣轉化率為1.06 ～1.09 mol/mol(以葡萄糖計);而當熱處理時間超過90 min 時，種泥中的部分微生物將因失去活性，而削弱系統的產氫效能。

(3)不同熱處理時間下種泥中的微生物種群存在差異，各發酵體系呈現出不同的產酸發酵類型。經熱處理15 ～75 min 后的污泥發酵系統，液相末端發酵產物以丁酸、乙酸為主，呈現出丁酸型發酵特征;而經熱處理90 和120 min 后的污泥發酵系統中，乙醇比例也占到25%以上，呈現出混合酸發酵特征。

［1］MOMIRLAN M，VEZIROGLU T N.The properties of hydrogen as fuel tomorrow in sustainable energy system for a cleaner planet［J］. International Journal of Hydrogen Energy，2005，30(7):795-802.

［2］DAS D. Advances in biohydrogen production processes:an approach towards commercialization［J］. International Journal of Hydrogen Energy，2009，34(17):7349-7357.

［3］HALLENBECK P C，GHOSH D. Advances in fermentative biohydrogen production:the way forward ［J］. Trends Biotechnology，2009，27(5):287-297.

［4］郭婉茜，任南琪，王相晶，等.接種污泥預處理對生物制氫反應器啟動的影響［J］.化工學報，2008，59(5):1283-1287.

［5］SONG Z X，DAI Y，FAN Q L，et al. Effects of pretreatment method of natural bacteria source on microbial community and bio-hydrogen production by dark fermentation［J］. International Journal of Hydrogen Energy，2012，37(7):5631-5636.

［6］HAFEZ H，ELBESHBISHY E，DHAR B R，et al. Single and combined effect of various pretreatment methods for biohydrogen production from food waste［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2011，36(17):11379-11387.

［7］REN N Q，GUO W Q，WANG X J，et al. Effects of different pretreatment methods on fermentation types and dominant bacteria for hydrogen production［J］. International Journal of Hydrogen Energy，2008，33(16):4318-4324.

［8］PENTEADO E D，LAZARO C Z，SAKAMOTO I K，et al.Influence of seed sludge and pretreatment method on hydrogen production in packed-bed anaerobic reactors［J］. International Journal of Hydrogen Energy，2013，38(14):6137-6145.

［9］BAGHCHEHSARAEE B，NAKHLA G，KARAMANEV D，et al.The effect of heat pretreatment temperature on fermentative hydrogen production using mixed cultures［J］. International Journal of Hydrogen Energy，2008，33(15):4064-4073.

［10］昌盛，李建政，王淑靜，等. 預處理溫度對活性污泥發酵產氫特性的影響［J］.太陽能學報，2011，32(3):395-401.

［11］國家環境保護局.水和廢水監測分析方法［M］.3 版.北京:中國環境科學出版社，1997.

［12］MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Analytical Chemistry，1959，31(3):426-427.

［13］OWEN W F，STUCKEY D C，HEALY J B，et al. Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity［J］.Water Research，1979，13:485-492.

［14］LI J Z，ZHENG G C，HE J G，et al. Hydrogen-producing capability of anaerobic activated sludge in three types of fermentations in a continuous stirred-tank reactor ［J］.Biotechnology Advance，2009，27(5):573-577.

［15］MU Y，YU H Q，WANG G. Evaluation of three methods for enriching H2-producing cultures from anaerobic sludge［J］.China Enzyme and Microbial Technology，2007，40(4):947-953.

［16］WANG J L，WAN W. Comparison of different pretreatment methods for enriching hydrogen-producing bacteria from digested sludge［J］. International Journal of Hydrogen Energy，2008，33(12):2934-2941.

［17］LEE H S，RITTMANN B E. Evaluation of metabolism using stoichiometry in fermentative biohydrogen［J］. Biotechnology and Bioengineering，2009，102(3):749-758.?