真海鞘殼化學成分分離及其浸膏抑制人肝癌細胞HepG2活性的研究

翟興月等

摘要：采用硅膠柱色譜及薄層制備色譜等手段從真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）殼中分離純化出了3種化合物。對所獲得的化合物經過理化性質、波譜分析和文獻對照的方法進行了結構鑒定。同時，采用CCK-8方法對75%EtOH浸提所獲得的真海鞘殼浸膏進行了抑制人肝癌細胞HepG2生長測試。結果表明，從真海鞘殼中分離得到3種化合物分別為：Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）、膽甾醇（化合物2）和6-（2，，3，-Dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。體外測試表明，75%EtOH浸提所獲得的真海鞘殼浸膏具有顯著抑制人肝癌細胞HepG2生長的活性，可作為潛在的抗腫瘤藥物進行進一步研究。

關鍵詞：真海鞘；化學成分；結構鑒定；人肝癌細胞HepG2

真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）主要分布于日本的海男鹿半島以北的海域及韓國的東海岸和南海岸[1]。真海鞘可食部分含有豐富的營養成分，味道鮮美，深受人們的歡迎。李春艷等研究了真海鞘的營養價值，發現其可食部分除了含有豐富的氨基酸及礦物質以外，還含有豐富的必需不飽和脂肪酸[2]。近年來，遼寧和山東進行了真海鞘的引進和養殖，目前已經形成一定的規模化養殖[3]。真海鞘體外是呈橙紅色具有很多乳頭狀突起的被囊（殼），是不可食部分，目前大多被當成廢物廢棄[1]。

海洋生物生活環境與陸生生物的生活環境不同。海洋生物生活環境往往更加極端，如高鹽、高壓環境，它們為了適應這樣的生活環境，往往產生一些特殊結構的代謝中間產物。海洋生物所含有的特殊結構的代謝中間產物往往又成為潛在的藥源生物活性物質。對真海鞘殼化學成分的研究未見報道。本研究中，對真海鞘殼化學成分分離及其浸膏抗腫瘤活性進行了研究，旨在為真海鞘殼的開發利用提供基礎數據。

1材料和方法

1.1材料

真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）2013年10月于山東省威海市榮成尋山集團采購；人肝癌細胞HepG2來自中國科學院上海細胞庫；D101大孔吸附樹脂柱購于天津市海光化工有限公司；硅膠（20～300mesh，10～40 μm）及薄層層析硅膠（Silica gel for Thin-layer Chromatography，HG/ T2354-92）購于青島海洋化工有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠購于Sigma公司；CCK-8檢測試劑盒（Dojindo，CK04）來自株式會社同仁化學研究所；其他試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1真海鞘殼浸膏的制備真海鞘殼（濕重21 kg）洗去泥沙，剪成約2 cm×2 cm的小塊，置于圓底燒瓶中，加入3倍量的75% EtOH，加熱回流提取2 h，提取3次，制成浸膏并稱重，放入冰箱中冷凍保藏備用。

依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對提取到的浸膏進行3次萃取，濃縮，分別得到石油醚萃取部分（9 g）、乙酸乙酯萃取部分（13 g）和正丁醇萃取部分（16 g）。

1.2.2真海鞘殼化學成分的分離將石油醚萃取部分9 g溶于適量的石油醚中，在石油醚溶液中加入15 g的300～400目硅膠并攪拌均勻，揮發溶劑使樣品充分吸附。用100 g 300～400目硅膠進行濕法裝柱（2.5×70 cm），先用石油醚平衡，將混有石油醚萃取部分硅膠加入到柱的上層，用石油醚：乙酸乙酯（100∶1-100∶100）的洗脫液進行梯度洗脫，每個比例進行5個柱體積的洗脫，分別收集洗脫液（每組分約600 mL）。通過薄層層析法跟蹤檢測每個組分，并通過顯色結果合并濃縮各組分，共得到8個組分，記為a、b、c、d、e、f、g和h組分（根據極性從小到大標記），a組分為化合物1（41 mg），對b組分進行重結晶，得化合物2 （120 mg）。

將正丁醇萃取部分16 g溶于適量的乙酸乙酯中，并向其中加入24 g的300～400目硅膠并攪拌均勻，揮發溶劑使樣品充分吸附。用160 g 300～400目硅膠進行濕法裝柱（3×100 cm），先用乙酸乙酯平衡，將混有正丁醇萃取部分硅膠加入到柱的上層，用乙酸乙酯：甲醇（100∶1-100∶100）的洗脫液進行梯度洗脫，每個比例進行5個柱體積的洗脫，分別收集洗脫液（每組分約600 mL）。通過薄層層析法跟蹤檢測每個組分，并通過顯色結果合并濃縮各組分，共得到9個組分，記為a、b、c、d、e、f、g、h和j組分（根據極性從小到大標記），對c組分進行制備薄層色譜層析，對刮板洗脫濃縮得到的組分進行重結晶，得化合物3（10.5 mg）。

1.2.3結構鑒定核磁共振光譜（NMR）在Bruker Avance DRX 500核磁共振儀（500/125 MHz）上進行，以四甲基硅烷（TMS）作內標。

1.2.4真海鞘殼浸膏總甾體含量的測定按照田麗冉等的方法利用香草醛-硫酸溶液真海鞘殼浸膏進行總甾體含量的測定[4]。

1.2.5體外抗腫瘤活性測定稱取真海鞘殼浸膏 40 mg ，用20 mL乙醇溶解配制成濃度為2 mg/mL的藥液備用。

將HepG2細胞懸液接種于96孔培養板中（3×103個細胞/孔），于37 ℃ 5%CO2 培養箱培養，加藥之前在顯微鏡下對細胞進行觀察。將藥液加入96孔培養板中，終濃度分別為2 μg/mL、20 μg/mL及200 μg/mL，共同孵育2 h、6 h、12 h、36 h，然后在顯微鏡下對細胞進行觀察。同時，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后培養箱中孵育3 h，測定450 nm處的吸光值。

1.2.6數據處理實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS13.0統計軟件作單因素方差分析。

2結果與分析

2.1真海鞘殼浸膏的制備及化學成分的分離

利用75%EtOH浸提所獲得的真海鞘殼浸膏親水性較大，其含水量為5.12%，其總甾體含量為14.13%。對真海鞘殼浸膏石油醚萃取部分進一步分離，得化合物1和化合物2。

化合物1為白色似油狀物。13C NMR （126 MHz，CDCl3） δ107.31（s），114.11（s），139.26（s），39.44 （s），37.44 （s），37.17 （s），34.73 （s），33.89 （dd，J= 67.3，50.3 Hz），33.27 （s），32.82 （s），3200 （s），30.11 （m），29.78 （d，J= 5.1 Hz），29.74 （d，J= 5.1 Hz），29.44 （s），29.03 （m），27.16 （s），26.77 （s），24.54 （s），23.24 （s），22.73（m），19.77（m），14.20 （d，J= 7.8 Hz），11.46 （s），1092 （s），7.56 （s），1.06 （s）。以上波譜數據并結合維普數據庫查詢，確定化合物1為Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate，分子式為C56H112O40（圖1）[5]。

圖1化合物1

化合物2為白色針狀固體，易溶于丙酮，可溶于甲醇及乙醇。醋酸酐-濃硫酸反應呈陽性，表明為甾體類化合物。13C NMR數據及維普數據庫查詢，與膽甾醇標準品一致，可以確定化合物2為膽甾醇 （Cholesterol），分子式為C27H46O。

對真海鞘殼浸膏正丁醇萃取部分進一步分離，得化合物3。化合物3為白色固體粉末，易溶于甲醇。1H NMR （600 MHz，DMSO-d6）數據如下： δ8.13 （s，1H），8.35 （s，1H），7.35 （s，1H），7.35 （s，1H），5.87 （d，1H，6.2 Hz），4.61 （dd，1H，6.0，11.4 Hz），4.14 （q，1H，3.3 Hz），3.96 （dd，1H，3.3，6.6 Hz），3.65 （dt，1H，12.0，4.0 Hz），3.56 （m，1H），5.45 （d，1H，7.0 Hz），5.18 （d，1H，5.2 Hz），5.44 （m，1H）。13C NMR （150 Mz，DMSO-d6） 數據如下： δ156.3，1563，149.2，152.5（C-3，C-4，C-6，C-7），119.5，140.6（V-1，C-5，C-6，C-8），149.2，88.09（C-2，C-3，C-4，C-7，C-8），73.8 （C-1），71.0（C-1，C-4），86.0，62.1（C-1，C-3）。以上波譜數據并結合維普數據庫查詢，確定化合物3為生物堿6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol，分子式為C12H13NO6（圖2）[6]。

圖2化合物32.2抑制人肝癌細胞HepG2生長活性測定

不同濃度的真海鞘殼總浸膏與HepG2細胞共同培養，不同培養時間后進行CCK-8檢測，結果如圖3。由圖3可以看出，HepG2細胞在無藥物添加的時候，隨著培養時間延長，HepG2細胞以一定的速率增殖。當真海鞘殼總浸膏濃度為2 μg/mL時，隨著培養時間延長到36 h時，培養液吸光度值下降，表明HepG2細胞增殖受到一定抑制。隨著真海鞘殼總浸膏濃度增加，HepG2細胞增殖抑制效果逐漸增加。當真海鞘殼總浸膏濃度增大到為200 μg/mL時，HepG2細胞增殖受到明顯抑制。

圖3HepG2細胞與不同濃度真海鞘殼

總浸膏共同培養的CCK-8檢測結果

真海鞘殼總浸膏與HepG2細胞共同培養后，對HepG2細胞進行形態學觀察。對照組細胞邊界清楚，折光度好，胞質飽滿（圖4A）。真海鞘殼總浸膏與HepG2細胞共同培養后的細胞有破損現象，細質內充滿圓形、透明的顆粒，顯示有較多脂滴（圖4B）[7-8]。

A 對照組細胞；B 真海鞘殼總浸膏與HepG2細胞共同培養后的細胞

圖4顯微鏡下HepG2細胞形態（20×）

3討論

對真海鞘殼75%（體積分數）的乙醇浸膏中石油醚萃取部分進一步分離，得到2個化合物，分別為Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）和膽甾醇（化合物2）。對真海鞘殼浸膏正丁醇萃取部分進一步分離，得化合物6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）?；衔?首次發現于從中國南海西沙群島永勝島附近海域里生長的海綿中[5]?；衔?首次發現于板栗中[6]。在真海鞘殼中發現化合物1與化合物3是首次報道。

CCK-8法是一種優于MTT法的檢測細胞增殖活性的方法，具有操作簡單、靈敏度高、準確性和重復性好的特點[9]。在本研究中，使用CCK-8法對真海鞘殼總浸膏與HepG2細胞共同培養后的細胞進行計數。結果發現，真海鞘殼總浸膏對HepG2細胞具有顯著抑制作用，且有劑量依賴性。真海鞘殼總浸膏中含有多種化學成分，其中比較多的化學成分有總甾體化合物，達到14.13%，這提示我們進一步研究，可以獲得潛在的具有抑制HepG2細胞的化學成分。

對真海鞘中活性物質的研究報道不多。Shirakata等從真海鞘體壁中分離出29 kDa蛋白質]。Harada-Azumi等從真海鞘血淋巴中分離出一種分子量為28 kDa的Ca2+依賴型的N-乙酰-半乳糖酰胺（N-acetyl-galactosamine）特異性的凝集素[11]。日本與韓國的研究者在真海鞘內發現了甘氨酸甜菜堿、龍蝦肌堿、葫蘆巴堿、氧化三甲胺、三甲胺等化學成分[2]。在真海鞘中不斷發現的新化學成分，豐富了真海鞘活性物質的數據，為利用真海鞘提供了更多的可能性。

參考文獻：

[1] 李文姬.韓國的真海鞘養殖[J].水產科學，2004，23（7）：27-30

[2] 李春艷，李丹彤，銀學祥，等.真海鞘營養成分的分析與評價[J].大連水產學院學報，2007，22（5）：347-351

[3] 王大建，趙城南，湯天堂，等.真海鞘人工育苗與海上養成技術[J].齊魯藥業，2007，24（9）：17-18

[4] 田麗冉，朱春芃，曲敏，等.海星中抑制ACE活性的甾體化合物的分離純化[J].大連海洋大學學報，2014，29（4）：409-412

[5] 傅建龍，龍康候.中國南海海綿化學成份研究II-F[J].華南理工大學學報（自然科學版），1991，19（3）：112-116

[6] Zhang DS，Gao HY，Tang ZS，et al.A new alkaloid from Castanea mollisima Blume[J].Chinese Chemical Letters，2008，19：832-834

[7] 何松，沈薇，沈鼎明.體外觀察紫衫醇對肝癌HepG2細胞生長的影響[J].重慶醫學，2003（3）：268-230

[8] 司維柯，肖桃元，康格非.苦參堿對人肝癌細胞HepG2的細胞形態影響和相關增殖因素的變化[J].第二軍醫大學學報，2000，22（6）：553-556

[9] 李寧，萬文婷，金林洪.CKK-8法和MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的最佳條件比較研究[J].貴州大學學報（自然科學版），2009，26（3）：18-24

[10] Shirakata M，Takagi T，Konishi K.Isolation and characterization of a 29，000 Dalton protein from ascidian （Halocynthia roretzi） body wall muscle[J].Comparative Biochemistry and Physiology，1986，85B（1）：71–76

[11] Harada-Azumi K，Yokosawa H，Ishii S.-I.N-acetyl-galactosamine-specific lectin，a novel lectin in the haemolymph of the ascidian Halocynthia roretzi： isolation，characterization and comparison with galactose-specific lectin[J].Comparative Biochemistry and Physiology，1987，88B（1）：375–381

Isolation of constituents in Halocynthia roretzi Drasche sell and

inhibitory activity of extracts from H.roretzi against HepG2 cells

ZHAI Xingyue1，HOU Xiuxiu2，TONG Changqing2，DU Ying3，LI Wei2

（1.Nutrition Department，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China；

2.College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；

3.Dalian Center for Disease Control and Prevention，Dalian 116021，China）

Abstract：Three compounds were isolated from Halocynthia roretzi Drasche shell by column chromatography on silica gel and thin layer chromatography.Their structures were identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry properties.The inhibition on HepG2 cells of all extracts from H.roretzi sell were evaluated by CCK-8 assay.The results showed that three compounds were obtained and identified as Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate （compound 1），cholesterol （compound 2） and 6-（2，3-dihydroxy-4-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol （compound 3）.All extracts from H.roretzi sell using 75% EtOH exhibited the potent inhibitory activities against HepG2 cells.The extracts could be considered as potential anticancer candidate for further study.

Key words：Halocynthia roretzi Drasche；constituent；structural identification；HepG2 cells