CCK- 8降低LPS誘導(dǎo)的小鼠單核細(xì)胞RAW264.7 CHOP/caspase- 11 /caspase- 1的表達(dá)

劉 威，段 林，許光明，于 峰，張曉靜*，宋 寧*

(1.河北省胸科醫(yī)院 骨科， 河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系， 河北 石家莊 050017)

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CCK- 8降低LPS誘導(dǎo)的小鼠單核細(xì)胞RAW264.7 CHOP/caspase- 11 /caspase- 1的表達(dá)

劉 威1，段 林2，許光明3，于 峰3，張曉靜3*，宋 寧2*

(1.河北省胸科醫(yī)院 骨科， 河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系， 河北 石家莊 050017)

目的探討CCK- 8對(duì)LPS激活RAW264.7細(xì)胞CHOP/caspase- 11/caspase- 1 信號(hào)通路的影響。方法用LPS和(或) CCK- 8和(或) CCK- 8的1受體阻滯劑孵育RAW 264.7細(xì)胞，用Western blot法檢測(cè)CHOP、caspase- 11蛋白表達(dá)，用試劑盒檢測(cè)caspase- 1活性，用ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL- 1β水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，LPS組CHOP、caspase- 11表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，給予CCK- 8可有效抑制LPS誘導(dǎo)的CHOP、caspase- 11表達(dá)升高(P<0.05)，而預(yù)先給予CCK- 8的1受體阻滯劑可明顯抑制CCK- 8的作用。caspase- 1活性變化、IL- 1β含量變化趨勢(shì)均與CHOP、caspase- 11表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致(P<0.05)。結(jié)論CCK- 8通過(guò)受體1抑制CHOP/caspase- 11/caspase- 1表達(dá)，減少LPS誘導(dǎo)IL- 1β的生成, 發(fā)揮抗炎作用。

膽囊收縮素；脂多糖；C/EBP同源蛋白；caspase- 11；caspase- 1

內(nèi)毒素的主要成分為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性菌外膜的主要成分。LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化釋放大量促炎性細(xì)胞因子在急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙綜合征等危重病癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1- 2]。八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK- 8)是廣泛存在于體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)的神經(jīng)肽，具有多種生物學(xué)功能。本研究經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CCK- 8作用于表達(dá)CCK受體的巨噬細(xì)胞通過(guò)激活多條信號(hào)通路，抑制LPS誘生多種促炎因子，提示CCK- 8的抗炎作用對(duì)于治療炎性反應(yīng)相關(guān)性疾病具有較好的應(yīng)用前景[3- 6]。在 LPS誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達(dá)增高，上調(diào)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 11(cysteinyl aspartate specific proteinase 11，caspase- 11)表達(dá)，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase- 1)，促進(jìn)IL- 1β生成，表明CHOP/caspase- 11/caspase- 1 信號(hào)通路在LPS啟動(dòng)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7- 8], CCK- 8對(duì)上述信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用尚不清楚，研究CCK- 8對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CHOP/caspase- 11/caspase- 1通路的影響對(duì)于闡明CCK- 8的抗炎機(jī)制以及藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：小鼠單核細(xì)胞RAW264.7(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。以含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。2 d傳代1次，取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，LPS(E.coli LPS，serotype 0111:B4)，CCK- 8(Sigma公司)，Caspase 1 Assay Kit和小鼠抗兔caspase- 11抗體(Abcam公司)，小鼠抗兔CHOP抗體(Bioworld公司)，CCK- 81受體阻滯劑 devazepide(Tocris公司)，IL-1β ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理: 小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞傳2～3代后隨機(jī)分6組，分別為對(duì)照組(培養(yǎng)基中加入等體積0.9%氯化鈉注射液)、LPS組(培養(yǎng)基中加入0.5 mg/μL LPS)、CCK- 8+LPS組(在加入LPS前10 min加入1×10-6mol/L CCK- 8)、CCK- 81受體阻滯劑+ CCK- 8+LPS組(在加入CCK- 8前10 min加入1×10-3mol/L CCK- 8的1受體阻滯劑devazepide)、CCK- 8的1受體阻滯劑組(培養(yǎng)基中加入1×10-3mol/L devazepide)、CCK- 8組(培養(yǎng)基中加入1×10-6mol/L CCK- 8)。1.2.2 Western blot檢測(cè)CHOP、caspase- 11蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，加500 μL裂解液，20 μL蛋白酶抑制劑，5 μL PMSF在冰上裂解15 min后，4 ℃,14 000×g，離心15 min。蛋白定量后，采用聚丙烯酰胺凝聚電泳(SDS-PAGE)，通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上。用體積分?jǐn)?shù)為0.05的脫脂奶粉封閉3 h，與1∶500的小鼠抗兔CHOP抗體(或小鼠抗兔caspase- 11抗體)4 ℃孵育過(guò)夜。再與1∶5 000 HRP標(biāo)記的熒光標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h。用熒光顯色儀顯色。采用β-tublin作為內(nèi)參對(duì)照，分別以相應(yīng)蛋白與β-tublin熒光強(qiáng)度比值表示該蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 比色分析法測(cè)定caspase- 1活性：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟收集細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞/mL)，加預(yù)冷50 μL裂解液，冰浴10 min，10 000×g，離心1 min，轉(zhuǎn)移上清至新試管，進(jìn)行蛋白濃度定量，調(diào)整蛋白濃度為4 g/L，加50 μL含DTT的反應(yīng)液，5 μL 4 mmol/L YVAD-p-NA，37 ℃孵育1～2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在400 nm處的吸光度值(A400值)。將對(duì)照組吸光度值定為1，caspase- 1活性增高的倍數(shù)用其他組吸光度值與對(duì)照組吸光度值的比值表示。

1.2.4 ELISA方法測(cè)定IL-1β表達(dá)水平：藥物處理后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃，1 500 r/min，離心10 min，分裝，-80 ℃凍存。取上清，根據(jù)IL-1β檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)所示方法用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在450 nm處的吸光度值(A450值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸分析得出直線回歸方程。將測(cè)得的不同檢測(cè)樣品的A值代入相應(yīng)的直線回歸方程中，即可得到IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞CHOP蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組CHOP表達(dá)明顯增高，預(yù)先給與CCK- 8可明顯抑制LPS引起的CHOP表達(dá)的增高(P<0.05)。而在應(yīng)用CCK- 8之前預(yù)先應(yīng)用devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用(P<0.05)。CCK- 8組和devazepide組CHOP表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P<0.05) (圖1)。

A.the CHOP expression was detected by Western blot; B.densitometry analysis of CHOP expression; data were representative of four independent experiments; #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with LPS group; ▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group圖1 CCK- 8對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)水平的影響Fig 1 Effect of CCK- 8 on the CHOP expression induced by LPS in RAW264.7 cell

2.2CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞caspase-11蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組caspase- 11表達(dá)水平顯著升高。與LPS組相比，CCK- 8 +LPS組caspase- 11的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，預(yù)先給與devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用(P<0.05) (圖2)。

A.the caspase- 11 expression was detected by Western blot; B.densitometry analysis of caspase- 11 expression; data were representative of four independent experiments; #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with LPS group; ▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group圖2 CCK- 8對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞caspase- 11蛋白表達(dá)水平的影響Fig 2 Effect of CCK- 8 on the caspase- 11 expression induced by LPS in RAW264.7 cell

2.3CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞caspase-1活性增加

LPS誘導(dǎo)caspase- 1活性增加，約為對(duì)照組的1.47倍；CCK+LPS組caspase- 1活性較LPS組有所下降，約為對(duì)照組caspase- 1活性的1.24倍。預(yù)先給與devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用，caspase- 1活性為對(duì)照組caspase- 1活性的1.38倍(圖3)。

Data were representative of four independent experiments; #P<0.01 compared with control group; *P<0.01 compared with LPS group; ▲P<0.01 compared with CCK- 8+LPS group圖3 CCK- 8對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞caspase- 1活性的影響Fig 3 Effect of CCK- 8 on the caspase- 1 activity induced by LPS in RAW264.7 cell

2.4CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β生成增多

與對(duì)照組相比，LPS組IL-1β表達(dá)明顯增高。與LPS組相比，CCK+LPS組IL-1β的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，預(yù)先應(yīng)用devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用 (P<0.05) (表 1)。

表1 CCK- 8對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β水平的影響

#P<0.05 compared with control group;*P<0.05 compared with LPS group;▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group.

3 討論

CHOP(C/EBP-homologous protein)，又稱生長(zhǎng)停滯及DNA損傷誘導(dǎo)基因153(growth arrest and DNA damage inducible gene 153, GADD153)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)特異的轉(zhuǎn)錄因子之一。在生理狀態(tài)下低表達(dá)，但在ERS時(shí)，被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞凋亡[9]。LPS可以誘發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ERS，促進(jìn)CHOP的表達(dá)，但并不引起巨噬細(xì)胞凋亡卻啟動(dòng)了炎性相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)IL-β的表達(dá)[7]，另有研究證實(shí)，與野生型小鼠相比，敲除CHOP基因的小鼠經(jīng)LPS刺激后，肺泡灌洗液中IL-1β的含量明顯降低，肺臟炎性病理改變明顯減輕。表明CHOP的表達(dá)可能是LPS活化巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。因此，控制巨噬細(xì)胞CHOP表達(dá)對(duì)抑制LPS誘生促炎因子具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS作用細(xì)胞可引起CHOP蛋白表達(dá)顯著增高，預(yù)先給予CCK- 8可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達(dá)增高，而CCK- 81受體抑制劑可有效逆轉(zhuǎn)CCK- 8的作用，提示CCK- 8通過(guò)1受體抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的ERS, 降低CHOP表達(dá)。

敲除CHOP基因可抑制LPS作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞caspase- 11表達(dá)，表明CHOP是LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞caspase- 11表達(dá)的關(guān)鍵因子[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCK- 8可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的caspase- 11蛋白表達(dá)增高，這一作用可被CCK- 81受體抑制劑反轉(zhuǎn)，caspase- 11的變化趨勢(shì)與CHOP的變化趨勢(shì)一致，提示CCK- 8通過(guò)1受體抑制CHOP的表達(dá)，降低caspase- 11的表達(dá)。caspase- 11可以通過(guò)蛋白水解作用激活caspase- 1[8]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)caspase- 1活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激，caspase- 1活性顯著升高， CCK- 8可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的caspase- 1活性增加，這一效應(yīng)可被1受體抑制劑所反轉(zhuǎn)，結(jié)果與caspase- 11表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCK- 8通過(guò)1受體抑制LPS誘導(dǎo)的CHOP/caspase- 11/caspase- 1的表達(dá)。caspase- 1又稱白介素- 1β 轉(zhuǎn)化酶(interleukin- 1β-converting enzyme，ICE)[11]。CHOP/ caspase- 11/ caspase- 1 信號(hào)通路是LPS誘導(dǎo)IL-β生成的關(guān)鍵通路，為了驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究又觀察了細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-β水平變化，結(jié)果證實(shí)CCK- 8可通過(guò)1受體降低IL-β的生成。

本研究證實(shí)，CCK- 8通過(guò)1受體抑制LPS誘導(dǎo)的CHOP/caspase- 11/ caspase- 1的表達(dá)，減少炎性因子IL-β的生成，對(duì)于闡明CCK- 8的抗炎機(jī)制，豐富CCK- 8及相關(guān)神經(jīng)肽生物學(xué)作用的有關(guān)理論具有重要意義，同時(shí)也有利于CCK- 8相關(guān)抗炎藥物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

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新聞點(diǎn)擊

注射肉毒桿菌可能緩解病痛

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年10月30日?qǐng)?bào)道，用于撫平皺紋的肉毒桿菌制劑“保妥適”(Botox)，可能有助減輕癌癥、關(guān)節(jié)炎與偏頭痛引發(fā)的不適，而且不會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。長(zhǎng)期遭受背痛的患者和曾剖宮產(chǎn)的女性，也能因注射“超級(jí)肉毒桿菌”受益。

注射一次能減輕疼痛數(shù)月，讓患者不須每天服用數(shù)次強(qiáng)效藥片，而且可注射于身體任何部位。這種由英國(guó)謝菲爾德大學(xué)(Sheffield University)研究人員研發(fā)的藥劑，可能會(huì)為治療疼痛帶來(lái)創(chuàng)新。

防止皺紋生成的主要成分是細(xì)菌毒素肉毒桿菌(botulinum)，能防止神經(jīng)細(xì)胞和肌肉互相作用，以阻止肌肉移動(dòng)，進(jìn)而防止皺紋生成。同時(shí)肉毒桿菌每次能阻止疼痛訊號(hào)傳遞達(dá)數(shù)月。然而因擔(dān)心會(huì)使治療部位癱瘓，而致肉毒桿菌未能普遍用于止痛。

為了解決這一問(wèn)題，謝菲爾德大學(xué)研究人員達(dá)維勒托夫(Bazbek Davletov)取出肉毒桿菌能鎮(zhèn)痛的部分，再植入破傷風(fēng)桿菌所產(chǎn)生類毒素中的兼容部分。

破傷風(fēng)毒素會(huì)將鎮(zhèn)痛成分送至脊椎，這種成分就能在脊椎阻止疼痛訊號(hào)傳送至大腦。達(dá)維勒托夫教授指出：“事實(shí)上，我們達(dá)成止痛效果的方法就是，只選取有益的分子。”

動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞，如果對(duì)人體進(jìn)行的大型試驗(yàn)成功，這種藥物3年后就可能問(wèn)世。可用于偏頭痛患者，也可能用于癌癥患者。

CCK- 8 decreases the expressions of CHOP/caspase- 11/caspase- 1 induced by LPS in mouse monocyte RAW264.7 cells

LIU Wei1, DUAN Lin2, XU Guang-ming3, YU Feng3, ZHANG Xiao-jing3*, SONG Ning2*

(1.Hebei Chest Hospital, Shijiazhuang 050041; 2.Dept. of Respiratory Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000; 3.Basic Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

ObjectiveTo investigate the effect of CCK- 8 on CHOP/caspase- 11/caspase- 1 expressions induced by LPS in RAW264.7 cells.MethodsRAW264.7 cells were incubated with LPS and/or CCK- 8 and/or CCK- 8 1R blocking agent devazepide for indicated times. CHOP and caspase- 11 protein expressions were determined by Western blot, caspase- 1 activity was analyzed by kit, IL- 1β expression level was analyzed by ELISA.ResultsBoth CHOP and caspase- 11 expression were upregulated in LPS-activated RAW264.7 cell, which were inhibited by pre-treatment of CCK- 8. Pre-treatment of devazepide inhibited the effects of CCK- 8 significantly.The same effects were found in caspase- 1 activity and IL- 1β expression.ConclusionsCCK- 8 exerts an anti-inflammatory effect by inhibiting CHOP/caspase- 11/caspase- 1 expressions induced by LPS in RAW264.7 cell. CCK 1R may contribute to the anti-inflammatory effect of CCK- 8.

cholecystokinin；lipopolysaccharides；C/EBP homologous protein；caspase- 11；caspase- 1

2014- 05- 12

：2014- 10- 14

河北省自然科學(xué)基金(H2012206029)

*通信作者(correspondingauthor)：zhangxue781127@163.com；342840431@qq.com

1001-6325(2015)02-0178-05

研究論文

R 541.4

：A