DAPK基因甲基化與腫瘤相關性的研究進展△

李水琴 黃義德 林堯

福建師范大學生命科學學院，福州350000

DAPK基因甲基化與腫瘤相關性的研究進展△

李水琴 黃義德 林堯#

福建師范大學生命科學學院，福州350000

死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）基因啟動子區域高甲基化可使其表達沉默，從而抑制細胞凋亡，誘導腫瘤的發生和轉移。在不同腫瘤類型或關于同一類腫瘤的不同報道中，DAPK基因甲基化數據相差很大。此外，大多數DAPK基因甲基化研究缺乏相應mRNA或蛋白表達數據。因此，規范DAPK甲基化及表達檢測手段，明確其作用機制，對腫瘤中的DAPK研究至關重要。

腫瘤；惡性腫瘤；啟動子甲基化；死亡相關蛋白激酶

據世界衛生組織報道，腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病之一。2012年腫瘤造成820萬人死亡，其中肺癌、肝癌和胃癌位據前三。在未來20年中，估計每年腫瘤病例將上升到2200萬。研究腫瘤致病機制，尋找有效的腫瘤治療方法，是生物學與醫學界的重要研究課題。表觀遺傳學是指在基因的DNA序列沒有發生改變的情況下，基因發生可遺傳的遺傳信息變化，并最終導致可遺傳的表型變化，且這種改變在發育和細胞增殖過程中能穩定傳遞并具有可逆潛能[1]。在腫瘤中，如DNA甲基化等表觀遺傳學修飾可以通過調節基因的表達影響腫瘤的發生與發展。DAPK基因高甲基化常導致其表達量下降，且在多種腫瘤中發現了DAPK基因的甲基化現象（圖1）[2]，因而備受關注，吸引了大量的研究者們對DAPK基因甲基化和腫瘤之間的關系進行研究。

1 DAPK的生物學功能與腫瘤

DAPK是一種鈣調蛋白（CaM）調節的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，基因定位于人類染色體9q34.1，轉錄成熟的mRNA全長為5.9 kb，編碼蛋白分子質量為160 kDa。DAPK可參與調控多種細胞生理過程，如細胞凋亡、自噬、遷移及細胞膜起泡等[3]，與惡性腫瘤發生、發展、轉移密切相關[4]。例如，將DAPK引入到具有高轉移能力的老鼠肺癌細胞中可以延緩惡性腫瘤細胞的生長并降低其轉移潛能[5]。同時，DAPK可以通過磷酸化抑癌基因p19ARF激活抑癌基因p53，上調p53下游凋亡相關基因如Bcl相關X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）、凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1）等的表達，從而抑制原癌基因cmyc和轉錄因子E2F1誘導的致癌性轉化[6]。此外，DAPK還可以通過調控整合素-細胞分化調控蛋白42（cell division control protein 42，Cdc42）信號軸抑制細胞隨機遷移，因此即使是在對DAPK誘導的凋亡耐受的惡性腫瘤中，DAPK也有可能抑制惡性腫瘤細胞轉移，從而起到抑癌基因的作用[7]。

2 DAPK基因的轉錄調控

DAPK基因序列缺乏TATA盒，但其翻譯起始位點上游1500 bp的序列包含了多種轉錄因子結合位點，如轉錄因子1（transcription factor，Sp1）結合位點、激活蛋白2（activator protein 2，AP2）結合位點、E盒、CAAT盒及可與核因子-激活的B細胞的增強子κ輕鏈（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-kB）、激活蛋白1（activator protein 1，AP1）、E2F1等結合的共有序列結合位點[8]。

此外，在DAPK基因-172 bp到+489 bp之間（包括外顯子1）運用亞硫酸氫鈉測序，還發現在肺癌和乳腺癌細胞中存在一個額外的啟動子[8]，即由雙啟動子調控DAPK基因表達（圖2），而占主導作用的啟動子1（-1294 bp到+214 bp）比啟動子2（+272 bp到+612 bp）的活性高40%～50%。目前DAPK基因的轉錄調控機制仍未完全研究清楚，但已知在不同的外部信號刺激下，細胞中DAPK基因的表達受到了不同機制的調控。

2.1 DAPK基因轉錄的正調控因子

Martoriati等[9]通過EMSA和CHIP技術研究證明，在細胞受到DNA損傷（紫外照射、γ射線及多西環素處理等）時，p53作為正調控轉錄因子被招募到DAPK基因的外顯子1上游或內含子1上（圖2），誘導DAPK基因的轉錄。原癌基因c-Myc、轉錄因子E2F1過表達時，也可引起p53蛋白與DAPK基因啟動子序列結合，從而上調DAPK的轉錄[9]。Benderska等[10]結合運用熒光顯微技術等與電腦軟件模擬DAPK-HSF1熱休克蛋白因子1（heat shock factor protein 1，HSF1）蛋白間的相互作用，發現在腫瘤壞死因子（TNF）刺激結腸癌腫瘤細胞時，DAPK可以磷酸化HSF1蛋白的S230位點，pHSF1S230由細胞質進入細胞核，與DAPK基因啟動子區域HSE序列（核心序列TTCCGGAA）結合，使DAPK的mRNA表達量約增加2倍[11]。此外，在細胞凋亡初期，轉化生長因子-β（transforming grow th factor beta，TGF-β）下游的SMAD蛋白家族（如Smad2、Smad3、Smad4）可與急性骨髓性白血?。ˋML）家族中的轉錄因子相互作用，通過與DAPK基因啟動子（-705至-352）的結合，上調DAPK的mRNA表達量[12-13]。C/EBP-β是另一個可正調節DAPK轉錄的轉錄因子[14]，C/EBP亞家族包括C/EBP-α、C/EBP-β、C/EBP-γ、C/EBP-δ、C/EBP-ε、C/EBP-ζ[15-16]。C/EBP-β可直接與DAPK啟動子近端環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）應答元件CRE/ATF位點（核心序列GACG）結合，但是與啟動子遠端CBS位點（核心序列TGGG）的結合需要干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）的誘導（圖2）[14]。此外，Gade等[17]研究發現在內質網應激狀態下，處于前體狀態的激活轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）與免疫球蛋白結合蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）分離，進入高爾基體。在高爾基體中，前體ATF6經IFN-γ的誘導后，通過細胞凋亡信號調節激酶1（ASK1-MKK3）途徑中的p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化ATF6的T166位點[18]，使之發生蛋白水解變成活性狀態，進入細胞核內與C/EBP-β蛋白結合后共同與DAPK啟動子近端cAMP應答元件CRE/ATF位點結合，誘導DAPK基因的表達[14]。

2.2 DAPK基因轉錄的負調控因子

促炎因子IL-6/STAT3可與DAPK基因啟動子區域（-1471至-1821、-351至-631）結合，抑制DAPK基因的轉錄[13，19]，而DAPK也可通過蛋白間的相互作用改變信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的核定位信號，進而減弱STAT3的活性[13]。因此，二者形成了一個雙向負調控關系。此外，Hayakawa等[20]發現轉化生長因子β活化激酶1（MAP3K7）激活p52NF-KB的同時可與DAPK的CRE及NF-kB位點結合，招募轉錄因子如組蛋白去乙?；?（histone deacetylases2，HDAC2）、HDAC6等以抑制DAPK基因表達[13]。除開轉錄因子的結合外，DAPK基因啟動子區域CpG島的異常甲基化在調節DAPK基因的表達中亦發揮重要作用。Nakatsuka等[21]在甲狀腺癌（TL）中研究發現，DAPK基因的5'非翻譯區（5'UTR）的CpG島是一個超甲基化的潛在靶點。而據在線軟件分析推測，在DAPK基因翻譯起始位點上游6237 bp中，共含有3個可能的CpG島（圖3）。另外，DNA甲基轉移酶可以異常募集致癌蛋白到DAPK啟動子上，最后使DAPK啟動子區域出現DNA異常甲基化現象[7，22-24]，但詳細調控機制有待進一步探索。

3 腫瘤中DAPK基因的甲基化

DAPK作為一種抑癌基因，其啟動子在多種惡性腫瘤細胞中存在不同程度的高甲基化[25-27]。體內研究顯示，DAPK基因在正常組織中均有表達，在多種原發性惡性腫瘤組織中表達低下或缺失，如食管癌[28]、肺癌[5]、大腸癌[29]、乳腺癌[30]、卵巢癌[24]、頭頸部鱗癌（HNSCC）[31]等。Raveh等[7]研究指出，在原發性結腸癌患者中，DAPK基因的甲基化約占20%。在許多情況下，采用甲基化特異性PCR檢測DAPK基因表達，發現因DAPK基因甲基化導致其轉錄后的mRNA表達量明顯降低，并且在肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤患者的組織和患者的體液標本中都已檢測到DAPK基因的異常甲基化現象[5，32]，但其甲基化頻率不盡相同（圖1）。Edgar等[33]指出，抑癌基因SFRP1和DAPK異常甲基化率在32個慢性淋巴細胞白血?。–LL）樣品中分別占68.8%和50%。Bodoor等[34]也檢測出DAPK基因在CLL樣品中甲基化率約占36%，比抑癌基因p53甲基化率高出2倍之多。Bing等[35]發現DAPK啟動子區域甲基化頻率在正常胃組織和胃癌組織樣品中分別約為17.7%、54.8%。Takeuchi等[36]檢測研究95位幼年急性淋巴細胞白血病（ALL）患者得出，DAPK基因甲基化率占13%，并且相對T型患者，B型DAPK基因甲基化更常見。Harder等[37]揭示，DAPK基因啟動子甲基化在34個肝癌樣品中約占68%，但在16個正常肝組織中，其甲基化約占31%，表明DAPK啟動子甲基化在肝癌患者中時常發生。此外，Flatley等[38]在研究宮頸癌細胞樣本時得出，DAPK基因受甲基化的細胞可能更易感染人乳頭瘤病毒（HPV）。

啟動子異常甲基化在細胞癌變過程中是個早期、頻發事件，可以作為腫瘤發生的敏感生物學標志物。Bing等[35]指出，胃癌組織樣品比正常胃組織中DAPK啟動子區域甲基化頻率高3倍，即伴隨胃致癌的過程，抑癌基因DAPK啟動子甲基化率會上升，故可推測DAPK可作為胃致癌的標志。Krajnovic等[39]指出，在32個濾泡性淋巴瘤（FL）樣本中，78%的樣本檢測到DAPK基因異常甲基化，而O-6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（MGMT）基因甲基化占59%，且這兩種基因協同甲基化可以作為FL疾病復發和對藥物抗性的標志。同時，Ogawa等[40]研究得出，在非小細胞性肺癌（NSCLC）和頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞系中，主要因啟動子甲基化導致DAPK基因沉默，使癌細胞獲得抗表皮生長因子受體（epidermal grow th factor receptor，EGFR）治療藥物如埃羅替尼（erlotinib）、西妥昔單抗（cetuximab）的抗性，故可猜想，在抗EGFR治療藥物的耐受性研究中，DAPK基因可能作為一個新的靶基因研究目標。在DAPK完全甲基化且不表達DAPK的Burkitt淋巴瘤Raji細胞株中，用5-氮雜胞苷（5-Aza-dc）處理后可導致其去甲基化，從而使Raji細胞對IFN-γ的凋亡敏感性恢復。Sato等[41]在犬B細胞淋巴瘤細胞中也檢測到類似結果，即用5-氮雜胞苷處理GL-1細胞后，DAPK基因表達的mRNA量及IFN-γ誘導的細胞凋亡均有增加。

Chung等[42]研究中樞神經系統腫瘤時發現，中樞神經細胞瘤中DAPK基因啟動子甲基化頻率遠遠超過少突膠質細胞瘤，但DAPK蛋白表達情況相反。這一研究突出了基因甲基化與蛋白表達之間存在的差異性。雖然在多個患者樣品中檢測DAPK啟動子區域甲基化頻率已有很多相關報道，但可能因研究者得到的患者信息及樣本數量有限，在同一患者樣品中，同時檢測分析DAPK基因的DNA序列位點突變情況、轉錄表達的mRNA量及運用蛋白印跡、免疫組化方法檢測DAPK蛋白量的研究寥寥無幾，有必要在合適的樣本中對這三個層面同時進行檢測，從而進一步深入了解腫瘤中DAPK基因甲基化的生物學功能及臨床意義。此外，DAPK甲基化檢測在作為腫瘤標志物時，也應多考慮是否能夠與其他基因的甲基化聯合檢測，從而能夠更準確地為腫瘤診斷服務。例如，Ahmed等[43]抽取乳腺癌和良性乳腺疾病患者血液提取DNA分析，發現DAPK和Ras相關域含蛋白1（ras association domain-containing protein 1，RASSF1）抑癌基因都呈現不同程度的高甲基化現象，是否可以運用這2種基因甲基化頻率協同上升作為乳腺癌早期診斷的標志有待更多的研究。對DAPK基因甲基化的研究，可能不僅為早期治療診斷提供服務，如Kristensen等[44]指出，在彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中，DAPK基因的甲基化和p53突變也有重要的預后價值。

4 展望

隨著對DNA甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求，這些方法可分為3類：基因組整體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化的檢測和利用測序尋找新的甲基化位點[45]。但在DAPK甲基化的研究中，大多運用前兩者的研究方法，并且處理方式各異，包括基于PCR的甲基化分析、基于限制性內切酶的甲基化分析、基于重亞硫酸鹽的甲基化分析和柱層法等。研究顯示[2]，DAPK在各種腫瘤中甲基化情況的研究方法中，甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）方法是應用最廣泛的，約占72%，這種方法是利用可區別甲基化和非甲基化的引物通過PCR檢測基因甲基化，其關鍵是引物設計。其次是巢式-MSP和RTMSP方法的運用，約占15%[2]，因基因檢測或處理方法的不一致，有可能導致結果的差異性。例如在膽管癌中，運用MSP方法檢測DAPK基因啟動子甲基化情況，Yang等[46]發現其甲基化約占3%，但 Xiaofang等[47]運用巢式PCR方式檢測到的DAPK基因啟動子甲基化約占30.6%。因此DAPK基因的甲基化研究亟須在方法上建立一個統一的標準，以便于不同研究數據之間的橫向比較。此外，在DAPK基因的甲基化研究中，新甲基化位點的發現較少，大部分的研究只集中在一個甲基化位點上，是否還有其他甲基化位點，這些位點的功能在不同腫瘤中是否有不同，有待進一步探索。

對于導致DAPK基因甲基化的分子機制，其中一種可能是因為某些未知原因導致的DAPK基因表達下降本來作為一種誘因導致染色質凝聚和組蛋白尾部修飾，進而使DAPK啟動子甲基化，最后導致基因轉錄沉默[48]。這種基因甲基化機制在乳腺癌細胞雌激素受體信號通路[49]和前列腺癌細胞的谷胱甘肽S-轉移酶[50]中已被證實。還有一種可能性是如Pulling等[8]指出，DAPK在轉錄沉默時存在組織特異性差異。在乳腺癌細胞中，啟動子2的甲基化頻率較高，但在肺癌細胞中，受甲基化影響較大的是啟動子1，其甲基化機制需在不同的細胞中分別研究，可能存在較大的差異性。

DAPK啟動子甲基化可能作為腫瘤早期診斷、治療、轉移和預后的分子標志物[51]，并為未來腫瘤的藥物治療提供分子生物學機制。雖然去甲基化藥物在細胞水平已被證實且取得一定療效，但在臨床應用及其作用機制還有待深入研究。目前，DAPK抗腫瘤和抗炎癥[52]作用也已成為研究的熱點。

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國家自然科學基金青年科學基金（31301172）；福建省自然科學基金（2014J01122）#

（corresponding author），e-mail：yaolinfjfz@gmail.com

2015-03-22）